ヒト甲状腺乳頭癌の分子生物学的解析

原  著 〔東女医大誌 第62巻 第3号頁251∼260平成4年3月〕

ヒト甲状腺乳頭癌の分子生物学的解析

東京女子医科大学 第2外科学教室（主任：浜野恭一教授）       同 内分泌外科（指導：藤：本吉秀教授） イ    トウ

伊 藤

公  一コウ   イチ （受付 平成3年11月9日） Molecular Analysis of Human Tllyroid Papillary Carcinoma       Koichi ITO    Department of Surgery II（Director：Prof． Kyoichi HAMANO）  Department of Endocr童ne Surgery（Director：Prof． Yoshihide FUJIMOTO）          Tokyo Women’s Medical College   Relatively little has been known about the relationship between genetic alteration of oncogenes or antiイ）ncogenes and malignant transformation in thyroid tumors． In this study， thyroid papillary carcinoma was analyzed in a molecular leve1． High molecular weight DNA from 60 cases of thyroid papillary carcinoma were examined in Southern blot hybridization． In the analysis of RFLPs （restriction fragment length polymorphisms）， LOH（loss of heterozygosity）was observed in one out of 25informative cases examined， where the RFLP marker of the chromosome 17 short arm（MYH2）was used as a pro1）e． No LOH was observed in Southern blot hybridization by using other RFLP markers as probes． Structural alterations in oncogene sequences in thyroid papillary carcinomas were also examined． No gene rearrangement or amplification was observed in Southern analysis where oncqgenes such as解ち’鳩。・〃ηら。・〃δ」B・名and EGF receptor were used as probes． Thus， no correlation was found between these oncogenes and clinicohistological factors．   These results suggest that it may be difficult to demonstrate the genetic alteration in papillary carcinoma of the thyroid as compared with malignancies in other tissues．          緒  言  近年の分子生物学的研究手法の目ざましい発展 に伴い，様々な腫瘍において，細胞の癌化の機構 が遺伝子レベルで徐々に解明さ．れつつある．特に 細胞の増殖，分化に関係すると考えられる遺伝子 （癌遺伝モ癌抑制遺伝子）の異常により，腫瘍が 形成されるという事実は既に一般に受け入れられ るものとなってきた．  散発性の腫瘍の発症年齢と遺伝子異常の起こる 頻度を分析検討した結果，腫瘍の形成には少なく とも五つないし六つの遺伝子異常が関与すると考 えられる正）21．しかしどの遺伝子でも無作為に異常 が起これば腫瘍形成につながるというわけではな く，ある特定の遺伝子の異常に対して特定の組織 で腫瘍が発生するということがわかってきた．こ のように異常が起こることで腫瘍形成につながる 遺伝子は大きく分けて二つある．一つは癌遺伝子 （oncogene）の異常であり，他の一つは特異的染色 体部位の欠失，すなわち遺伝子の欠失である．  癌遺伝子は異常が起こると，その産物の発現量 を増加させたり，構造の異なる蛋白質を産生する ようになる．そして，このような異常は通常，対 になった常染色体上の対立遺伝子のどちらか一方 に起こり，残りの正常遺伝子に対して優性に働く． すなわち，染色体上のどちらか一方に異常（活性 化）が起これば細胞が癌化すると考えられている．

これに対して遺伝子の欠失は，正常細胞で発現し ている遺伝子が不活化されることにより癌化する と考えられている．最初は対になった遺伝子のど ちらか一方に不活化が起こるが，それだけでは癌 化せず，残存する正常遺伝子の欠失ないし二次的 異常が起こったときにはじめて癌化するという考 え方である。このような遺伝子群は，対立遺伝子 のうちどちらか一方が正常であれぽ癌化を抑える という意味で，癌遺伝子に対して，癌抑制遺伝子 （anti・OnCOgene， tUmor SupreSSor gene）と呼ば れている3）∼6）．  癌遺伝子に関しては，癌ウイルス研究を足がか りにして既に多くの遺伝子が単離され，ヒト癌に おける活性化の意義もかなり解明されてきてい る．これに対し遺伝子の不活化による癌化機構は， 遺伝性の癌で染色体特定領域の欠失がみられるこ とから想定されたものであり，そのような遺伝子 の存在は最近まで不明であった．しかし，近年の 分子遺伝学的アプローチにより，網膜芽細胞腫の 発症に密接に関わっていると思われる遺伝子が単

離されるに至り，その実体がはっきりしてき

た7）8）．そしてさらに，遺伝性腫瘍のみならず種々 の非遺伝性腫瘍でも類似の染色体欠失が高頻度に 起こっていることが確認され9）∼13｝，発癌過程にお ける遺伝子欠失の意義が注目されている．  甲状腺癌においても，この数年の間に癌遺伝子，

癌抑制遺伝子についての報告がなされてきた

が14）∼27），まだ腫瘍発生過程や悪性度との関係が十 分に明らかになってはいない．また，遺伝性の髄 様癌以外には特異的染色体領域の欠失が検出され ていない．今回著者は甲状腺乳頭癌症例を対象に

悪性度をDNAレベルで診断する目的で，サザ

ン・ハイブリダイゼーション法を行い，各種

RFLP（restriction fragment length polymor・ phism）マーカーを用いてのLOH（loss of heter・ ozygosity）検出から，臨床病理学的な諸因子との 関連性についての検討を加えた．さらに受容体型 チロシン・キナーゼ群の遺伝子（7鶴’漉癌遺伝 子），c一〃z5，6遺伝子， c−67∂B−2遺伝子， EGF受容体 遺伝子の活性化の有無を調べた．          対  象  対象患者として，平成2年10月より平成3年5 月までに伊藤病院において初回手術を受けた甲状 腺疾患患者の中で，手術前に化学療法，放射線治 療が施行されていない甲状腺乳頭癌患者を選ん だ．うち，摘出標本において，肉眼的に腫瘍部と 正常甲状腺が明瞭に区別しうる例より腫瘍部，正 常部分が十分量採取できた60例を対象とした．症 例の内訳を表1に示した．          方  法

 1．DNAの調製法

 手術室において，甲状腺亜全摘術後の標本より 腫瘍部と正常甲状腺部分を明確に分けて採取，瞬 時に冷凍し，一70℃に保存した．得られた組織より 湿重量で1∼2gを出発材料として，数mm3単位に 細切した後に，10mlの0．1M Tris−HC1／20mM EDTA／0．1M NaCl液を加え，テフロン・ホモ ジェナイザーで10ストローク程上下の振回をくり 返し，細胞を破壊した．溶液に最終濃度が250μg／ mlとなるようにプロティネース液を加え，さらに SDS（sodium dodecyl sulfate）を最終濃度0．5％ となるように加え，十分に混和した．37℃で1昼 夜処理した後にフェノールで抽出1回，フェノー ル：クロロフォルム（1：1）液で1回，さらに クロロフォルムのみで1回抽出を行った．1／20容 の5M NaClを加え混和した後に2．5容の氷冷エタ ノールを加えて，DNAの沈殿を回収，氷冷80％エ

タノールで洗浄し，5m1のTE緩衝液（10mM

Tris−HCI（pH 7．5），1mM EDTA）に溶解させ， 2昼夜以上，室温で振とうし，DNAを完全に均一 に溶解させた．溶解したDNA溶液に最終濃渡が 200μg／mlになるようRNase A液を加え，37℃1 時間反応させ，次にプロティネースKを200μg／ mlになるように加え，37℃1時間反応させた．そ の後，再び，フェノール抽出，フェノール・クロ ロフォルム抽出，クロロフォルム抽出を行い，さ らに1／20容の5M NaC1と2．5容の下冷エタノール

を加え，DNAを沈殿として回収．1m1のTE緩衝

液に溶解させ，DNAが完全に均一になるまで室 温で振とうをした後，試料のうち2μ1の吸光度測 定をし，260㎜の吸光度から濃度を算出，250μg／

表1 対象症例内訳（甲状腺乳頭癌） 症例 年齢 性差 家族歴 t n 合併病変 症例 年齢 性差 家族歴 t _n 合併病変 1 47 _女性 なし 1 1 31 47 女性 なし 2 0 2 35 女性 なし 3 1 32 45 女性 なし 4 2 3 36 女性 なし 3 1 33 22 _女性 なし 1 1 4 62 女性 なし 4 1 34 39 女性 なし 4 1 5 29 女性 なし 4 1 35 52 _女性 なし 2 1 _{腺腫様甲状腺腫} 6 40 女性 あり 3 1 36 45 男性 なし 4 1 7 39 女性 なし 2 1 37 30 _男性 なし 2 1 8 43 女性 あり 2 0 _{腺腫様甲状腺腫，慢性甲状腺炎} 38 45 女性 なし 2 0 9 38 男性 なし 4 1 39 65 _女性 なし 2 0 10 50 女性 なし 2 1 40 56 _女性 なし 2 1 11 41 男性 なし 2 0 _{慢性甲状腺炎} 41 57 _女性 なし 4 1 12 55 _女性 なし 2 1 42 37 _女性 なし 1 0 13 57 女性 なし 1 1 43 42 女性 なし 1 1 腺腫様甲状腺腫 14 31 _女性 なし 3 1 44 34 女性 あり 2 1 15 57 _女性 なし 4 1 _{腺腫様甲状腺腫} 45 57 女性 なし 4 1 16 38 _女性 なし 2 1 _{慢性甲状腺炎} 46 39 女性 なし 2 1 17 39 女性 なし 4 1 47 51 女性 なし 1 1 18． 23 _{女性 なし} 3 1 48 64 男性 なし 4 1 19 66 _女性 なし 4 1 49 51 _女性 なし 2 0 20 49 女性 なし 1 1 50 58 _女性 なし 4 1 21 46 女性 なし 4 0 51 51 女性 なし 4 1 _{慢性甲状腺炎} 22 23 女性 なし 4 0 52 64 _女性 あり 3 0 23 70 女性 あり 4 1 腺腫様甲状腺腫 53 66 女性 なし 2 1 24 50 女性 なし 2 1 54 15 _女性 あり 2 1 _{慢性甲状腺炎} 25 24 _女性 なし 4 1 55 20 _女性 なし ユ 0 26 35 _女性 なし 4 1 56 59 女性 なし 4 1 27 68 男性 なし 3 0 57 41 女性 なし 4 1 28 38 _女性 なし 2 1 58 33 女性 なし 2 1 29 59 男性 なし 4 1 59 41 女性 なし 2 0 30 27 女性 なし 4 1 60 41 女性 なし 2 1 両親，祖父母，兄弟に甲状腺腫瘍患者がいる場合を家族歴ありとした。 t分類，n分類は第4版・甲状腺癌取扱い規約（甲状腺外科検討会編）30）に準じた． 遠隔転移（M分類）は，全例において認められなかった

m1となるようにTE緩衝液を用いて希釈し，再

び，室温で振とうを続けた．均一になったところ で吸光度値の測定，アガロースゲル電気泳動によ り，濃度を再確認した．  2．制限酵素による切断，アガロース電気泳動  DNA試料4μ1に目的とする制限酵素（宝酒造 社，京都）を10倍濃度の制限酵素反応液を使って， 5時間37℃で反応させ，0．8％アガロースゲルで電 気泳動し，完全切断であることを確認した．  3．サザン・プロッティング28）29）

 腫瘍部，正常部ともに完全切断される例の

DNA試料5μg（20μ1）を制限酵素で切断し，サザ ソ・プロッティングの試料とした．1昼夜反応さ せた後，アガロースゲル電気泳動用の反応停止液 を加えて酵素反応を止め，0．8％アガロースゲルで 泳動した．5μg／mlのエチジウム・ブロマイド水溶 液でゲル表面を染色し，完全切断，濃度の均一を 確かめ，Southern・OH液で40分間室温振とうし，

アルカリ変性によりDNAを1本鎖に変性させ

た．次に，Southern−Tris液で30分間室温振とう し，中和をさせた．ゲルよりナイロンフィルター （Schleicher＆SchUll社， Dasse1）に1昼夜をか けて，トランスファーさせた後，302nmフ≧ル ター固定用イルミネーターで3分間照射を行い， DNAを固定した．

 4．ハイブリダイゼーション，洗浄，オートラジ オグラフィー

 DNAを固定したフィルターに，37℃1昼夜を

かけて，プレ・ハイブリダイゼーションを行った 後に，目的の放射性プローブDNAでハイブリダ． イゼーションを行った．37℃2昼夜ロッキングプ レート上で反応させた後，フィルターを2×SSC／

1×Denhardt液で37℃1時間，0．1×SSC／1×

SDSで50℃1時間，0．1×SSC液を用いて，室温で 4回洗浄した．フィルターを増感紙と共にカセッ ト固定し一70℃1昼夜感光させたところで，いっ たん現像して目的のバンドの濃さを検討し，必要 な日数だけさらに感光をした．フィルムは富士 XAR RX filmを用いた．  5．プローブ  分与されたプラスミドDNAを大量調製した上 A ↓ ↓  a＿L＿＿＿⊥＿⊥一＿ プローブ A。a ⇒ A・A A・a ホモ接合性   ヘテロ接合性  A      A。A a ga ホモ接合性      ヘテロ接合性  ヘミ接合性   ホモ接合性      （正常組織）      （腫瘍）     図1 RFLP分析の原理と検出法6） RFLP（restriction fragment length polymorphism） 分析とは，遺伝的に決められている各個人の塩基配列 の個体差（DNA多型性）を利用して相同染色体を識別 し，染色体暴評の有無を判定するものである．  DNAをある制限酵素で切断し（↓），染色体上の位 置が同定されているDNAフラグメント（RFLPマー カー）をプローブに用いてサザンプロット法で解析す ると，切断されたDNA断片の長さに差があるとき，相 同染色体のそれぞれにあるDNAフラグメントが2本 の異なるバンドとして検出される（A・a）．そこで，患 者の正常組織DNAを制限酵素で切断したときに2本 のバンドとして検出され，腫瘍組織DNAでそのうち どちらか一方が消失していれば（AまたはA・A），そ のDNAマーカーを含む染色体領域が腫瘍細胞で特異 的に欠失していると判定できる． で，12種類のRFLPマーカーと腕拗， c・脚6， c−67ろ．8・2，EGF一受容体をプローブDNAとして使 用した．いずれもスパンカラム法により〔α一32P〕 dCTPを用いて標識をした．       結  果  1．RFLPマーカーを利用した特異的染色体領 域におけるアレルの欠失の検討

 RFLP分析の原理と検出法を図1に示した．

1，3，10，13，17番染色体上のDNAマーカーを 利用して，対象症例の腫四部と正常部より抽出し たDNAとのハイブリダイゼーションを施行し， 染色体欠失（LOH）の検出を行った．マーカーの 部位，使用した制限酵素の種類，ヘテロ接合体の 例数，欠失の有無を表2に示した．  図2には具体例を示した．aは1番染色体のDl S57（VNTR13）で，3本のアレルを用いて， LOH の有無を検討した．症例46は下の・ミンドのみしか 見られず，ホモ接合性で“not informative”な結果 である（・ミンドが1本のためLOH解析不能）．他 の症例では，それぞれ2本のバンドが見られ，ヘ テロ接合性で“informative”な結果を示している が，LOHは見られない．右端の結果は，陽性の対 象として使用した卵巣癌症例（65歳，淡明細胞癌） で，腫瘍組織のレーンを見ると，下のバンドのシ グナルが減少しており，LOHと判定した．  bも1番染色体のマーカーで，COO36による検 討である．症例48，50，52は上のバンドのホモ接 表2 今回の検討に使用したRFLPマーカー Probe Local・ 奄嘯≠狽奄盾 Enzyme No． of 狽浮高盾 Infor− 高≠狽奄魔? ases oss  奄獅狽 mor S57 1 31 R a I 3 2 0 O36 1 32 E oR I 3 2 0 S3 3 E oR I 3 1 0 0S11 1 q T q I 2 7 0 3S2 1 q12 M p I 1 1 0 3S3 1 q22 M p I 2 1 0 3S37 1 M p I 1 6 0 7S1 1 p・q13 S c I 3 1 0 53 1 p13 B nII 4 1 0 53寧 1 p13 E oR I 2 2 0

8

1

T q I 3 1 0

H2

1

p13 P t I 5 2 1 構造異常を検討した

54一

Case No． 42  43  44

    TNTNTN

  、聴講＿磁嘉

      脳曲 躯轟

48 49 50

TNTNTN

  獅購剛

b

  讃照岩山

45  46  47

TNTN TN

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嶋撫二二

 51 52  53

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  15  16  17  20  21  22   T N T N T N T N T N T N

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  48  49  50  51  52  53

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  ビ  ゴ  ダ    ヒ      ね  りほセトやゆド     ざ      じ リヒ  すつ

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  撫総総・鯉磁癬欝欝緯、． 癬       お     レ  ゆ モドモ   ぢ」   ・， 、訴巽鍵裂  図2 甲状腺乳頭癌症例のRFLP分析 a：プローブDIS57（VNTR13）， b：プローブCOO36， c：プF・一ブD17S1（HGO47），d：プローブTP53， T： 甲状腺乳頭癌腫瀬棚，N：正常甲状腺組織 合体，症例53が下のバンドのホモ接合体，症例49， 51はLOHの見られないヘテロ接合体である．  cは17番染色体のマーカー，D17S1（HGO47）で あり，同様の解釈により，症例17，21がLOHの見 られないヘテロ接合体と結論した．  dは，他臓器の癌でLOHが多数認められてい る17番染色体のp53（TP53）による検討であるが， 症例49，50，51，53のようなヘテロ接合体は見ら れたが，LOHは認められなかった．また， p53に 関しては制限酵素を変えて，構造異常も検討した が，異常は認められなかった．  図3には17番染色体短腕上のマーカー，MYH 2でLOHが検出された症例を示した．症例26に Case No，23  24  26  28  19  29    下 N T N T N T N T N 圓「 N  〔Kb），’ 23．7》・

雛；幽晦姦、雛織謙コ

2．3》 2ρ》・  噛㊥守、“、』量び ・、＿、 図3 MYH2によるRFLP分析  症例26でLOHを示した． 「響ぎ揖、、

a難癖綱欝欝鵜噸機織鰍噸嚇癖

b 轡 ／． 9 蝕   晦齢碑 蝉㌃細t囎謹  ． 毛《．、

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粛、 4…｛： 図4 c・〃解遺伝子をプローブとしたサザン・ハイブ  リダイゼーション  a：乳頭癌症例（症例2，4，5，7，8，9，10，  11， 12， ユ4， 15， 16， 17）  b：良性腫瘤例（症例1∼9）  c：バセドウ病症例（症例1∼15） 注目をすると，正常組織では他のヘテロ接合体（症 例24，28，19）と同様に2本のバンドが見られる が，種瘍組織においては上のバンドが消失してい るのが分かる．このプローブに対しては50例中25 例がヘテロ接合性を示し，“informative”であった が，LOHを認めたのは1例のみであった．陽性例 は35歳・女性で腫瘤が多発，前頚筋への浸潤があ

表3 対象症例内訳（良性腫瘤，バセドウ病） 良性腫瘤 摘出標本 症例 年齢 性差 家族歴 大きさ（mm） 病理組織診断 1 55 _女性 なし 35×30 腺腫様甲状腺腫 2 54 女性 なし 60×40 腺腫様甲状腺腫 3 41 _{女性 なし 145×85 腺腫様甲状腺腫} 4 54 _{女性 なし 45×38 濾胞腺腫} 5 35 _{女性 なし 46×38 濾胞腺腫} 6 27 女性 なし 45×35 ・ 腺腫様甲状腺腫 7 34 _女性 なし 40×30 濾胞腺腫 8 33 女性 なし 50×50 腺腫様甲状腺腫 9 46 男性 なし ・100×70 腺腫様甲状腺腫 バセドウ病 自己抗体 _摘出標本 リ _ンパ球 症例 年齢 性差 家族歴

TGHA

MCHA

重量（9） 浸潤 濾胞形成 1 16 _女性 なし 4⑪0． 10万 112．0 （十） （一） 2 22 女性 なし （二） （一） ．58．5 （一） （一） 3 27 男性 あり （一） _{6，400 31．4} （＋） （一） 4 32 女性 なし （一） 1，600 74．9 （十） （一） 5 23 女性 あり 100 6，400 81．4 （＋） （一） 6 26 _女性 なし （一） 1，600 3G．0 （＋） （一） 7 27 _女性 なし 6，400 40万 47．2 （＋） （一） 8 17 _女性 なし （一） （一） 46．6 （＋） （一） 9 30 女性 なし （一） 1，600 5．5．3 （＋） （＋） 10 26 _女性 なし （一） （一） 30．2 （一） （一） 11 17 男性 あり ’（一） （一） _40．6 （＋） （一） 12 16 _女性 あり （一） _25，000 67．5 （＋） （一） 13 22 _女性 なし 6，400 40万 134．9 （一） （一） 14 35 _女性 あり （一） （一） 40．2 （一） （一） 15 28 _男性 あり （一） 100 70．9 （一） （一） 良性腫瘍例における家族歴は甲状腺疾患患者の有無を，バセドウ病症例における家族歴はバ セドウ病患老の有無を示した． TGHA：抗サイログロブリン抗体， MCHA：抗マイクρゾーム抗体 り，所属リンパ節転移も著明に認められた進行例 ではあったが，他の24症例との特別な違いは見出 せなかった．  2．reオ癌遺伝子，オrk癌遺伝子， c・川yc遺伝子， c・eめB・2遺伝子，EGF・受容体遺伝子の検討  腫瘍部のみを選択し，γθ’・gθηo煽627例（SacI， HindIII）γ6’一cDNA271列（EcoRI），〃々17例 （BamHI）， c一彫y622例（EcoRI）， c・θゆβ一227例 （EcoRI）， EGF・受容体27例（EcoRI）にハイブリダ イゼーションを行ったが，いずれにおいても遺伝 子の再構成，増幅などのDNAレベルの変化は認 められなかった．c・卿夕。に関しては，表3に示した 良性腫瘍9例（腺腫3例，腺腫様甲状腺腫6例）， バセドウ病15例にも検：討を加えたが，図4に示し たように，いずれの症例においても異常は認めら れなかった．        考  察  癌は古くから遺伝子の異常によって起こる病気 とされているが，近年の分子生物学の目ざましい 発展にともない，色々な腫蕩における遺伝子レベ ルでの変化が明らかにされてきた．特に癌遺伝子， 癌抑制遺伝子と．腫瘍の発生，増殖，分化度，転移 などの関係は臨床的にも興味のある問題であり， 多くの研究がなされつつあるエ）∼13）．甲状腺癌にお

いても，腫瘍形成に関する特異的な遺伝子の異常 について数多くの研究がなされてきたが14）∼27），他 の臓器における癌に比べ，まだ腫瘍発生過程や悪 性度との関係が十分に明らかになったおけではな い．甲状腺腫瘍には，良性の腺腫や腺腫様甲状腺 腫，比較的おとなしい性質の分化癌，さらには非 常に悪性度の強い未分化癌といった幅広い分化度 の腫瘍が発生すること，濾胞上皮細胞から発生す る乳頭癌と濾胞癌とでは組織学的な形態上の差の ほかに，転移様式にも差が見られる点などから， 発癌や転移の機序解明のために非常に有用，かつ 興味深い臓器と考えられる．  今回著者は，甲状腺癌の中で70∼80％と圧倒的 に頻度の高い乳頭癌の手術摘除組織より高分子 DNAを抽出し，サザン・ハイブリダイゼーション 法によって染色体欠失の部位て癌抑制遺伝子の存 在），癌遺伝子の構造異常を調べ，DNAレベルで の変化から，乳頭癌における遺伝子異常を検討し た．  癌抑制遺伝子の存在は，小児期の腫瘍である網 膜芽細胞腫7）8）やWilms腫瘍において特定の染色 体領域の欠失が顕微鏡下で高頻度で観察されるこ とから，遺伝子産物の欠失が癌化と深い関連をも つ．すなわち，遺伝子産物が癌化を抑えていると いうことが考えられてぎた．その後，RFLPsに よってDNAレベルでの解析が可能となり，急速 に研究が進展し遺伝子が単離されるに至った（表 4）．  一般の癌においても，RFLPsによる正常組織 と癌組織の比較により染色体の欠失が容易に同定 できるようになり11ト13），特定の癌においては特定 の染色体の欠失が高頻度に起こっていることが明 らかとなった（表5）．RFLPマーカーによる癌組 織での特異的染色体領域での染色体欠失（LOH） の検出は，癌抑制遺伝子の存在部位を探索するた めの一手段である．今回の甲状腺乳頭癌において のLOH検出においては，まず既に他の臓器の癌

で高頻度の欠失が報告された染色体上のマー

カー，特に17番染色体上のマーカーを主に選択し て施行した，結果の解釈には，腫瘍のDNAの変性 によるシグナルの減少と制限酵素による不完全切 出4 ヒト腫瘍における癌抑制遺伝子の異常5）・6） 遺伝子 染色体部位 異常が検出されている腫瘍 RB 13q14 網膜芽細胞腫，骨肉腫，軟部組織腫瘍， 乳癌，肺癌，膀胱癌，前立腺癌 P53 17p13 大腸癌，肺癌，乳癌，骨肉腫，膠芽細胞 腫，神経線維肉腫，急性・慢性骨髄性白 血病

WT

11p13 _Wilms腫瘍 DCC 18q21 大腸癌 表5 RFLP分析で特異的染色体領域の欠失が検出  された腫瘍5）6） 腫  瘍 欠失部位 頻度（％） Wilms腫瘍 11P 55∼67 横紋筋肉腫 11P 100 網膜芽細胞腫 13q 75 神経芽細胞腫 14q 50 骨肉腫 13q 64 17P 77 多発性内分泌腫瘍2型 1P 50 腎臓癌 3P 76∼100 肺小細胞癌 3P 100 13q 94 17P 100 肺腺癌 3P 83∼100 肺扁平上皮癌 3P 100 子宮頸癌 3P 100 大腸癌 5q 26 17P 75 18q 86 膀胱癌 11P 42 乳癌 11P 27 13q 40 17P 61 聴神経鞘腫 22q 44 髄膜腫 22q 35 近年，RFLP分析によるLOHの報告が増加しており，重要 と思われるものをまとめた 断（partial digestion）の有無に留意して，疑わし い症例に対しては，再検を施行した．必要に応じ

て従来のRFLPマーカーよりヘテロ接合体とな

る頻度が高く，相同染色体を効率よく区別できる VNTR（variable number of tandem repeat）マー カーを使用し，分子量の違いによるシグナルの強 弱の差に注意を払った．  結果としては，他の癌で欠失が多く認められて いる17番染色体上のρ53遺伝子31）近傍のマーカー

であるMYH2においてヘテロ接合性を示した25

例中のうち，わずか1例が明確に欠失を認めた以 外には全て陰性であった．欠失のあった症例26（35 歳・女性例）は多発性腫瘤，前頚筋浸潤，所属リ ンパ節転移が認められた進行例ではあったが，脱 失を認めなかった24例中にも，t4nl以上の進行症 例が10例（症例4，17，19，30，32，41，45，50，

51，57）含まれており，MYH2におけるLOHと

臨床病理学的な諸因子との関連性は特に見出され なかった．ρ53遺伝子の。−DNAであるTP53に対 しては，制限酵素を2種類使い，LOHと構造異常 を検討したが，共に有意な所見は認められなかっ

た．濾胞腺腫で16例中に1例のLOHが報告され

ている1番染色体上のDIS5725）においても，今回

の乳頭癌の検討ではinformativeな22例中で

LOHが認められた症例はなかった，腎臓癌，肺癌 では100％の欠失を認める3番染色体短腕のマー カー，網膜芽細胞腫の原因遺伝子であるRB遺伝 子7）の存在する13番染色体長骨のマーカーにおい てもLOHは認められなかった．また，多発性内分 泌腺腫症第2型の原因遺伝子と判明している10番 染色体23）24）上のプローブにおいてもLOHは認め られなかった．  今回の検討は，既に報告されているような大腸 癌，肺癌などに対する全染色体での欠失検索では ないため，利用したマーカー以外の部位に，乳頭 癌で特異的な欠失部位が存在することも考えられ る．また，乳頭癌はその腫瘍の持つ性質より，染 色体の欠失が稀であるという可能性も考えられ る．いずれにしても，今回対象とした症例が，十 分量の癌組織を獲得する必要性から，腫瘍径の大 きな例や，浸潤型といった進行度の強い症例に片 寄ったという点を考慮に入れれば，甲状腺乳頭癌 における染色体欠失は他の癌における頻度に比較 して極めて低率であった． 腫瘍の形成過程には，複数の癌遺伝子の異常が 関与すると考えられ，甲状腺癌に関しても既知の 癌遺伝子についての解析はかなり進められてきて いる．今回検討は行っていないが，多くの腫瘍で 確認されている名αs遺伝子の突然変異は，甲状腺 腫蕩においても20∼30％の頻度で認められるこ と，比較的初期の段階から起こることが受け入れ られてきている14）∼16）．鷹遺伝子以外の甲状腺腫 瘍における癌遺伝子としては，NIH3T3細胞を使 用したトランスフェクション法により見出された チロシン・キナーゼ群の遺伝子である弼癌遺伝 子，’娩癌遺伝子が重要視されている19）∼22）．外国の 乳頭癌症例では，約25％で活性化されていると報 告があり20），日本人症例から樹立された甲状腺乳 頭癌株においても発現が見られた22）ということよ り，陽性の結果を期待したが，今回の検討では異 常を示す結果は見つからなかった．DNAレベル で二二細胞癌，胃癌をはじめ，様々な腫瘍におい て増幅例が報告されている。・〃z翼遺伝子につい ては，甲状腺腫瘍においてRNAレベルで57％に 発現が認められたという報告があるが，DNAレ ベルでの検討では再配列ないし，増幅は認められ ていない17）．今回の検討では良性腫瘍，バセドウ病 も含めて，DNAの異常は認められなかった．遺伝 子産物が腺上皮細胞の分化・増殖に密接に関わっ ていると言われ，増幅が腺癌で特異的に見られ， 特に乳癌では予後因子との相関が認められつつあ る32）c−6乃β一2についても甲状腺腫瘍においては， DNAレベルの異常は認められていない．今回の 検討でも異常は認められなかった．また，扁平上 皮癌や脳腫瘍（神経膠芽腫）33）で増幅，構造異常の 見られるEGF受容体遺伝子に関しても，異常が 認められなかった．  以上のように，代表的な癌関連遺伝子を用いた サザン・ハイブリダイゼーションについては，

RFLP解析による癌抑制遺伝子の検索結果と同

様に，明確な指標は見つからなかった．しかし， 生物学的悪性度が低いとは言え，甲状腺乳頭癌に も必ず細胞の癌化に関与する細胞内物質や遺伝子 があるはずである．今回の検討で，甲状腺乳頭癌 には他臓器の癌とは異なった遺伝子変化が存在す る可能性が強く示唆された．          結  論  甲状腺癌の中で，組織型別に最も頻度の高い乳 頭癌に関して，多数例を用いて複数のRFLP分析 と既知癌遺伝子による検討を行った．17番染色体

短腕のRFLPマーカーで25例中1例にLOHが

認められた以外には，異常が見られず，明確な

DNA診断の指標は見出せなかった．甲状腺腫瘍 におけるDNA診断は，現在の所，遺伝性甲状腺髄 様癌（多発性内分泌腫瘍2型）で可能となってき たのみで，散発性腫瘍に関しては研究の途上にあ り，分子生物学．的な裏付けはついていない．悪性 度に極端な差がある分化癌と未分化癌の違いな ど，重要な点を解明するためには，今後さらに多 くの甲状腺癌組織のDNAを解析し，癌遺伝子，癌 抑制遺伝子の異常とそれぞれの症例の臨床経過を 比．較検討していく必要があると思われる．  稿を終えるにあたり，御指導，御校閲を賜りました 浜野恭一教授，藤本吉秀教授に深謝致します．本研究 にあたり，終始直接御指導頂きました東京大学医科学 研究所細胞遺伝学研究部，渋谷正史教授に心より感謝 申し上げます．また，研究材料を提供して頂きました 国立がんセンター横田 淳先生，愛知がんセンター高 橋雅英先生に感謝致します。実験に御協力頂きました 東京大学野原道子先生，伊藤病院の皆様に厚く．御礼申 し上げます．なお，今回の実験に使用した主なプロー ブは，日本リサマチ・リソースバンク（JCRB）より供 与されたものです。        文  献   1）We量nberg RA：Oncogenes， antioncogenes     and the nlolecular bases of multistep car−     cinogenesis． Cancer Res 49：3713−3721，1989  ．2）渋谷正史，山本雅編：がん遺伝子研究．中外医     ．学社，東京（1988）   3）Sager R： Tumor suppressor genes：The puz−     zle and the promise． Science 246：1406−1412，     1989   4）Klein G：The approaching erea of the tumor     suppressor genes． Science 238：ユ539一ユ545， 1987   5）横田 淳，鮫島勇一：がん抑制遺伝子．血液・腫     瘍科 21：54−61，199G   6）森．直樹，横田 淳：発癌に伴う染色体の変化．     代謝 27：99−103，1990   7）Wiggs J， Nordensjδld M， Yandel畳Det al：     Prediction of hereditary retinoわlastoma， using     DNA polymorphisms within the retinoblas−     toma gene． N Engl J Med 318：151−157，1988   8）Ponder B：Gene losses in human tumours．     Nature 335：400−402，1988   9）Ress M， Leigh SEA，1）elhanty JDA et a1：     Chrolnosome 5 allele loss in familial and spo・     radic cololectal adenomas． Br J Cancer 59：   361−365， 1989 10）Yokogoshi Y， Yosbimoto K：， Saito S et al：   Loss of heterozygosity on chromosomes l and   ll in sporadic pheochromocytomas． Jpn J Can・   cer Res 81：632−638，1990 11）Yikota J， Wada M， Shimosato Y et al：Loss   of heterozygosity．on chromosomes 3，13， and 17   in sman−cell carcinoma and on chromosome 3   in adenocarcinoma of the lung． Proc Natl Acad   Sci USA 84：9252−9256，1987 12）正undberg C， Skoog上， Cavenee WK et al：   Loss of heterozygosity in human ducta夏breast   tumors indicates a recessive mutation on chro−   mosome l3． Proc Natl Acad Sci USA 84：   2372−2376， 1987 13）Wada M， Yokota J， Mizogucbi H et al：   ．lnfrequent loss of．chromosomal heterozygosity   in human stomach cancer． Cancer Res 48：   2988−2992， 1988 14）Lemoine NR， MayaH ES， Wyllie FS et al：   Activated ㎜s oncogenes in human thyroid   cancers． Cancer Res 48：4459−4463，1988 15）Lemoine NR， Mayall ES， Wyllie FS et al：   High frequency of oncogene activation in all   ．stages of human thyroid tumorigenesis． On・   cogene 4：159−164， 1989 16）Namba H， Rubin SA， Fagin JA：Point muta−   tions of ηzs oncogenes are an early event in   thyroid tumorigenesis。 Mo．l Endoclinol 4：   1474−1479， 1990 17）Terrier P， Sbeng ZM， Schlumberger M et a丑：   Structure and expression of c一初夕‘ and cヲわs   proto−oncogenes in thyroid carc三nomas． Br J   Cancer 57：43−47， 1988 18）Aasland R， Lillehaug JR， Male R et a1：   Expression of oncogenes in thyroid tumours：   Coexpression of c・67ろ、B2／neu and c−6乃β． Br J   Cancer 57：358−363， 1988 19）Fusco A， Grieco M， Santoro M et a1：Anew   oncogen6 in human thyroid papillary car−   cinomas and their lymph−nodal metastases．   Nature 328：170−172，1987 20）Bongarzone I， Piemtti MA， Monzin1 N et al：    Higb frequency of activation of thyrosine   kinase oncogenes in human papillary thyroid   carcinoma． Oncogene 4：1457−1462，1989 21）Grieco M， Santro M， Ber蛙ngieri MT et al：   PTC is a novel rearranged form of the形’   proto・oncQgene and is frequently detected in   vivo in human thyroid papillary carOinomas．   Ce1玉6G：557−563， 1990 22）Ishizaka Y， Itoh F， Tahira T et al： Presence

   of aberent transcripts ofγ8’proto・oncogene in    ahuman papillary thyroid carcinoma cemine．    Jpn J Cancer Res 80：1149−1152，1989 23）Mathew CGP， Chin KS， Easton DF et a1：A    linked genetic marker for multiple endocripe    neoplasia type 2A on chromosome 10 by lin・    ．kage， Nature 328：527−528，1987 24）Simpson NE， Kidd KK， Goodfellow PJ et al：    Assignment of．multiple endocrine neoplasia    type 2A on chromosome 10 by linkage． Nature    328  528−530， 1987 25）Kudo K， Yoshimoto K， Yokogoshi Y et al：    Loss of heterozygosity．on Chromosome 1．p in    thyroid adenoma and medullary carcinoma，    but not in papillary carcinoma． JPn J Cancer    ．Res 82：1097−1103，1991 26．）山本正之，     日本臨床 27）難波裕幸，    18：22−29， 28）Southem 東孝次，中森正二ほか．甲状腺癌． 47：663−668， 1989 和泉元衛：甲状腺癌．癌と化学療法 1991   EM： Detection of specific    sequences among DNA fragments separated by    ge｝electrophoresis． J Mol． Bio198：503−517，    1．975 29）中根一穂編：In situハイブリダイゼーション手    法．pp36−47，学際．企画，東京（1989）． 30）．甲状腺外科検討会編：甲．状腺癌取扱い規約。金原    出版，東京（1991） 31）MiHeτC， Mokandas T， Wolf D et al：Human    p53 gene localized to short arm of chromosome    17．Nature 319：783−784，1986 32）Tsuda H， Hirohasbi S， Shimosato Y et a1：    Correlation between long・te㎜ survival in    breast cancer patients and amplification of two    putative oncogene−coamplification units． Can・    cer Res 49：3104−3108，1989 33）Yamazaki H， Fukui Y， Ueyama Y et a1：    Amplification of the structurally and function−    ally altered epidem｝al growth． factor receptor    gene（c−67ゐβ）in hum．an brain tumors． M．ol Cell    Biol 8：1816−1820，1988