麹菌におけるコウジ酸生合成経路の解析

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(1)麹菌におけるコウジ酸生合成経路の解析コウジ酸は麹菌が生産する美白成分であり，多くの美白化粧品に使用されているが長らく生合成遺伝子は不明であった。麹菌ゲノム解析が終了すると，著者らはその情報を活用することにより，コウジ酸生合成遺伝子（kojA，R，T）の特定に成功した。また，コウジ酸生産阻害となる硝酸ナトリウムの取り込みを行うトランスポーターを破壊することによりコウジ酸の大量生産にも成功した。現在，コウジ酸生合成経路を特定するための解析をすすめられている。著者らが解析を行っているコウジ酸生合成経路に関する知見の一部をご紹介頂いた。. 佐野元昭の後様々な化粧品の美白成分として配合されるように. 1．はじめに. なった 4）。また，美白以外にも抗菌作用や食品の劣化. 現在，各種生物種でゲノム解析が盛んに行われ，そ. を抑える作用も知られている 3）。しかし，2003 年に. のデータを活用した代謝経路の特定が進められている。動物実験で肝がんを引き起こすとされ，厚生労働省か麹菌（Aspergillus oryzae）は 2005 年に研究用株 1）. ら使用中止の通達が出された 5）。その後の安全性試験. RIB40 でのゲノム解析データが報告された。麹菌の. により，2005 年に「医薬部外品において適正に使用. ゲノムサイズは 37.9 Mbp で 12,084 個の遺伝子を持っ. される場合にあっては，安全性に特段の懸念はないも. ていると推定されている。決定された麹菌のデータは. のと考えられる。」との見解が出され，使用中止は撤. 独立行政法人製品評価技術基盤機構のデータベースで. 回されると同時にコウジ酸配合化粧品の製造販売が再. 2）. 公開されている。. 開されるという経緯がある 6）。現在では，化粧品等へ. 筆者らは，このゲノム情報を活用することによりコ. の使用には全く問題がないことが担保されており，多. ウジ酸生合成経路の特定を進めている。今回，コウジ. くの美白化粧品に配合されている。. 酸生合成経路の解析の現状を紹介する機会を頂戴した. コウジ酸は麹菌が生産する二次代謝産物で生育に必. ので，現時点での解析結果について紹介させて頂く。. 須ではなく，麹菌がコウジ酸を生産する目的について. 2．コウジ酸とは. は不明である。コウジ酸が抗菌作用をしめすことから，他の微生物に対する抗菌物質として生産するとも考え. コウジ酸は，日本酒を造る杜氏の手が白くてきれい. られていた。しかしながら，麹菌がコウジ酸を炭素源. なのは，日本酒醸造の過程で使われる麹に肌によい効. として利用することが可能である点から，他の生産目. 能を持つ成分が何か出ていると考えられ発見された物. 的も考えられ更なる解析が待たれるところである。. 質である。肌のシミのもとになるメラニン色素は，紫外線等の. 3．コウジ酸生合成遺伝子の特定. 影響でチロシナーゼが活性化され，人間の体細胞にあ. コウジ酸は 1907 年に発見されて以来，生合成遺伝. るアミノ酸系物質をシミに変換する。このチロシナー. 子が特定されておらず，麹菌のゲノム解析により得ら. ゼの働きをブロックする作用がコウジ酸では認められ. れた情報を活用して，コウジ酸生合成遺伝子の特定が. 3）. ている。1988 年に当時の厚生省より，コウジ酸は. 行われた。コウジ酸は液体培養・固体培養を問わず生. 美白成分として初めて医薬部外品として認可され，そ. 産が行われるが，培地の栄養源に強い影響を受けるこ. Analysis of Kojic Acid Biosynthesis in Aspergillus oryzae Motoaki Sano（Genome Biotechnology Laboratory, Kanazawa Institute of Technology）. 第. 112. 巻第. 1. 号. 9.

(2) とが今までの解析で知られている。特に，硝酸ナトリ. 試みた。コウジ酸の生産に直接関係する kojA 遺伝子. ウムによる影響が大きく，少量添加するだけでコウジ. を高発現させると，第 1 図のようにコウジ酸生産量の. 酸の生産が止まることが確認されていた。そこで我々. 大幅な上昇が確認された。また，kojA，T 遺伝子の. は，コウジ酸生産条件下と硝酸ナトリウムを少量添加. 発現制御を行う kojR 遺伝子を大量発現させた場合で. したコウジ酸非生産条件下で DNA マイクロアレイを. も，大幅なコウジ酸生産量の増加が確認された 8）。. 用いた解析を実施した。. kojR 遺伝子を大量発現させた場合の kojA，R，T 遺. 今回の DNA マクロアレイ解析では，コウジ酸生. 伝子発現量をリアルタイム PCR 解析により確認を行. 産・非生産条件の他に培養時間での比較等を行った。. ったところ，高発現させた KojR だけではなく kojA，. その結果，コウジ酸生産に関わると推定される遺伝子. T 遺伝子でも大幅な発現量の上昇が確認された。こ. を 20 ～ 40 個程度まで絞り込み，該当する遺伝子を破. のように，コウジ酸生合成遺伝子を遺伝子組換え技術. 壊した遺伝子破壊株を作製し，コウジ酸生産への影響. により強く発現させることによりコウジ酸の大量生産. を確認した。その結果，3 つのコウジ酸生合成遺伝子. に結びつけることに成功した。. の特定に至った。今回の解析で特定された遺伝子は，. DNA マイクロアレイ解析より得られた情報を精査. 既に特定されている遺伝子との高い相同性は認められ. し，他のコウジ酸生産遺伝子の特定を進めた。その結. なかったが，モチーフ予測などの解析結果により. 果，機能未知である AO090012000174 や opsin と相同. kojA（AO090113000136）は酸化還元酵素で，kojT. 性を持つ AO090010000221 がコウジ酸生合成遺伝子. （AO090113000138）は膜輸送体であることが推定さ. であると推定された。これらの遺伝子についても，遺. れた。また，kojR（AO090113000137）は kojA 及び. 伝子破壊株を作製しコウジ酸生産への影響の確認を行. kojT を制御する Zn（II）2Cys6 を有する転写制御因. ったところ，遺伝子破壊株で顕著なコウジ酸生産量の. 子であることが判明した。これまでの解析結果より，. 低下が認められた 9）。. コウジ酸生合成にはこれらの 3 つの遺伝子だけではな. 現在までに，コウジ酸生産への関与が認められてい. いが，この 3 つ遺伝子がコウジ酸生産に重要な遺伝子. る遺伝子は 10 個以上確認されている。以前の研究か. 7）. であることが判明している。. ら，コウジ酸はグルコースを変換して生産されると言. 特定されたコウジ酸生合成遺伝子を改良することに. われているが 10），これほど多くの遺伝子が関わって. よりコウジ酸の大量生産を試みた。その手法は，特定. いるとなると，今までの解析で得られたコウジ酸生合. された kojA，R，T 遺伝子を強く発現するプロモー. 成遺伝子は，コウジ酸生産に直接的な影響ではなく，. ターの制御下に置くことによりコウジ酸の大量生産を. 間接的な可能性も考えられる。または，コウジ酸がグルコースから生産される点で疑問の残る結果ともなっている。この疑問を解決するためにもコウジ酸生合成. 量(mM). 160. 経路の完全解明が待たれるところである。. kojA遺伝子高発株. 4．転写制御因子 LaeA について. 120. 転写制御因子 LaeA はヒストンメチルトランスフェラーゼをコードし , クロマチン構造の変化を通して広. コウジ酸. 80. 範囲にわたる転写活性化を引き起し , 分化や二次代謝. 元株. 40 0. 表的な二次代謝産物であり，LaeA 制御下にいる可能性が高く，laeA 遺伝子破壊株を作製しコウジ酸生産. １. ２. ３４培養日数. ５. 第 1 図 kojA 遺伝子高発現株のコウジ酸生産量 10. 生産の制御に関わる 11）。コウジ酸は麴菌における代. への影響の確認を行った。第 2 図のように laeA 遺伝子破壊株ではコウジ酸生産が認められず，laeA 遺伝子破壊株に laeA 遺伝子を導入した laeA 相補（comp）株ではコウジ酸生産が回醸協（2017）.

(3) まず，麹菌のゲノムデータベースから縁菌種で明らかとなっている硝酸ナトリウムトランスポーター nrtA，nrtB 遺伝子と相同性の高い遺伝子の探索を行った 13）。その結果，nrtA 遺伝子と高い相同性のある遺伝子は見出されたが，nrtB 遺伝子と相同性の高いものを存在しなかった。その後の詳細な解析結果，麹菌では nrtA 遺伝子（AO090012000623）のみがゲノム上に存在することが明らかとなった。 nrtA 遺伝子は，窒素源に硝酸ナトリウムを用いると強い発現誘導を受けることが確認された。次に， nrtA 遺伝子破壊株を作製し，硝酸ナトリウムを単一窒素源とした条件下での生育確認を行ったところ，第第 2 図 laeA 遺伝子破壊株と laeA 相補（comp）株のコウジ酸生産量. 3 図のように nrtA 遺伝子破壊株では著しい生育不良が認められた。これらの結果より，nrtA 遺伝子が硝酸ナトリウム取り込みにかかわることが明らかとなった 14）。. 復していた。また，コウジ酸生産遺伝子への影響をリ. nrtA 遺伝子破壊株でコウジ酸生産について確認を. アルタイム PCR 解析で解析をおこなったところ，. 行った。まず，コウジ酸を通常では生産しない硝酸ナ. laeA 遺伝子破壊株でコウジ酸生産遺伝子（kojA，R，トリウムを少量添加した条件下でコウジ酸生産量を確 T）の遺伝子発現量が顕著に減少していることが確認. 認すると，第 4 図のようにコントロール株と比較して. された。このように，コウジ酸生合成経路は転写制御. 大幅なコウジ酸生産上昇が確認されていた。また，通. 因子 LaeA 制御下にいることが示唆された 12）。. 常のコウジ酸生産条件下でもコウジ酸生産速度の上昇. 5．硝酸ナトリウム取り込みの改良について. が確認された。このようにコウジ酸生産遺伝子を直接改良せず，コ. 硝酸ナトリウム存在下でコウジ酸生産は著しく低下. ウジ酸生産遺伝子の発現阻害となる物質の菌体内への. することが今までの解析で明らかとなっている。そこ. 取り込み機構を破壊することで，コウジ酸の大量生産. で，硝酸ナトリウムの取り込みに関わる（硝酸ナトリ. を行うことが可能となった。この様な改良によりコウ. ウムトランスポーター）遺伝子を破壊することで，硝. ジ酸を麹菌が生育しやすい一般的な培養条件下で生産. 酸ナトリウム存在下でコウジ酸生産が可能になるので. が可能となり，コウジ酸生産コストの削減への応用が. はないかと検討を行った。. 期待される。. Control. ∆nrtA. 第 3 図 nrtA 遺伝子破壊株の硝酸ナトリウム下での生育第. 112. 巻第. 1. 号. 11.

(4) コウジ酸量 (mM/ g dry cell weight). 20. 成経路を解明するために，コウジ酸生合成遺伝子間の制御ネットワークの推定を行った。様々な条件下で取得された 412 個の A. oryaze 遺伝. 15. 子発現データを使用し，コウジ酸生合成遺伝子 kojA， R，T と Carbohydrate metabolism 代謝関連遺伝子間の偏相関係数の絶対値が有意に高い 54 遺伝子を選択. 10. した。さらに，これらに対し因子分析を適用することで，kojA，R，T と同じ制御下にあると考えられる. 5. 10 遺伝子を抽出した。次に，これらの遺伝子に， kojA，R，T およびコウジ酸の前駆体の生合成に関与する遺伝子 1 つを加えた 14 遺伝子（本解析で抽出さ. 0. C. れた遺伝子 11 個と kojA，R，T）に対し構造方程式. ∆. ∆nrtA. Control. モデリングを適用し，2 個の特定されていない遺伝子. 第 4 図 nrtA 遺伝子破壊株のコウジ酸非生産条件下でのコウジ酸生産量. （F1，F4）を含むネットワークモデルを推定した 15）。第 5 図にこのネットワークモデルを示す。このモデルを検証するため，kojA，R，T を除く 11 遺伝子の破壊株の作製を試みた。取得された 9 個の遺伝子破壊. 6．コウジ酸生合成遺伝子ネットワークの特定. 株について，コウジ酸生産条件下でのコウジ酸生産量. 現在までの DNA マイクロアレイ解析等によりコウ. の確認を行った。その結果，すべての株で親株と有意. ジ酸生産遺伝子の特定が進んできたが，個々の遺伝子. に差が生じていることが確認された。コウジ酸生産量. のつながりについては全く不明であり，コウジ酸生合. は第 5 図で下向きの矢印で示されたものがコウジ酸の. 96% AO090260000220. 196%. 77%. 71%. AO090009000686 AO090166000090 AO090011000515. kojR AO090113000137. AO090103000126. kojA AO090113000136. F4. 88% F1. AO090003001508. Precursor AO090005001371 AO090001000155 AO090009000554. kojT AO090113000138. 96%. 93%. 89% AO090023000367. AO090113000128. 93% 第 5 図コウジ酸生合成遺伝子のネットワークモデル 12. 醸協（2017）.

(5) 生産量が親株と比較して減少を示し，数字は減少率を. コウジ酸生合成に関連する遺伝子である確証は得られ. 表す。例えば，ネットワーク上で kojA，R，T 遺伝. たが，下流に位置する kojA，R，T 遺伝子をどのよ. 子の上位に位置する AO090260000220 遺伝子破壊株. うに制御しているかについては，現時点で不明のまま. （Δ260-220）では，コウジ酸生産量は親株を 100% と. である。. すると 4% まで大幅な減少している。また，kojA，R，一方，このネットワークモデルで AO090009000686 T 遺伝子発現量は第 6 図のように著しく低下してい. 遺伝子破壊株（Δ009-686）のみが，親株と比較して約. ることが確認された。. 2 倍近いコウジ酸生産量の上昇が確認された。更に，. 更に，AO090166000090 遺伝子破壊株（Δ166-090）. kojA，R，T 遺伝子発現量も第 8 図のように著しい発. でも，コウジ酸生産量は親株の 23% まで減少してお. 現上昇が確認されている。AO090009000686 遺伝子が，. り，kojA，R，T 遺伝子発現量も第 7 図のように著し. 転写制御を行う kojR 遺伝子の遺伝子発現量を上昇さ. く低下していることが確認された。これらの結果より，. せ，その結果 kojA，T 遺伝子発現量も上昇したもの. AO090260000220 遺伝子や AO090166000090 遺伝子は. と考えられるが，制御に関してはこちらも現時点で不. 1.00 0.80 0.60 0.40. 0.17. 0.20 0.00. Control. 1.40. 1.00. 1.00 0.80 0.60. 0.35. 0.40 0.20 0.00. Δ260-220. KojiR kojR. Control. Relative gene expression. 1.20. 1.20. 1.00 Relative gene expression. Relative gene expression. 1.40. KojiA kojA. 1.20. 1.00. 1.00 0.80 0.60 0.40. 0.10. 0.20 0.00. Δ260-220. KojiT kojT. Control. Δ260-220. 第 6 図 Δ260-220 株での kojA，R，T 遺伝子発現量. 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00. KojiR kojR. 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20. 0.08. 0.02 Control. ∆166-090. 1.20. 1.00. 0.00. Control. ∆166-090. Relative gene expression. 1.20. 1.00 Relative gene expression. Relative gene expression. 1.20. KojiA kojA. 1.00. KojiT kojT 1.00. 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00. 0.04 Control. ∆166-090. 第 7 図 Δ166-090 株での kojA，R，T 遺伝子発現量第. 112. 巻第. 1. 号. 13.

(6) 第 8 図 Δ009-686 株での kojA，R，T 遺伝子発現量明である 16）。これらの解析結果より，推定されたネットワークがコウジ酸生合成経路の一部である確証は得られたが，コウジ酸生合成経路の全貌解明の足掛かりをつけたに過ぎない。. 7．おわりにコウジ酸の生合成遺伝子（kojA，R，T）の特定に成功し，遺伝子の改良を行うことでコウジ酸の大量生産にも成功した。また，コウジ酸生産阻害となる硝酸ナトリウムの取り込みを行う遺伝子（nrtA）を破壊することによってもコウジ酸の大量生産に成功している。このようにコウジ酸に関する知見は大幅に増えたが，コウジ酸生合成経路の全貌解明にはまだまだ多くの解析が必要な状況である。今までの解析で特定されたコウジ酸生合成遺伝子を，一つの経路（コウジ酸生合成経路）としてまとめるためには，今後の解析が待たれるところである。今後は次世代シーケンシングやメタボローム解析等を活用していきたいとも考えている。麹菌ゲノムデータベースが公開されて 10 年近くたち，その間に多くの知見も得られデータベースのリニューアルもされている。このような麹菌のゲノム情報を活用することにより，多くの生合成経路が特定され，麹菌の利用価値が更に増すことを期待したい。〈金沢工業大学ゲノム生物工学研究所〉. 引用文献. 438, 1157-1161（2005） 2） http://www.bio.nite.go.jp/dogan/project/view/ AO 3） Bentley R., Nat. Prod. Rep. 23, 1046-62（2006） 4）厚生労働省 Web サイト http://www.mhlw. go.jp/shingi/2005/11/dl/s1102-8c.pdf 5）厚生労働省 Web サイト http://www.piis.pref. mie.lg.jp/dat/pdf/10000857_001.pdf 6）厚生労働省 Web サイト https://www.pref. chiba.lg.jp/yakumu/iyakubugaihin/documents/kouji.pdf 7） Terabayashi Y., Sano M., Yamane N., et al. Fungal. Genet. Biol. 47, 953-961（2010） 8） Marui J., Yamane N., Sano M., et al. J. Biosci. Bioeng. 112, 40-43（2011） 9）佐野元昭 , 堂本光子 , 小池秀明他 , 日本農芸化学会 2010 年度大会要旨集（2010） 10） Kluyver, A. J., Perquin, L. H., Biochem. Z. 266, 68-82（1933）. 11） Bok, J. W., Keller, N. P., Eukaryot Cell, 3, 527535（2004）. 12） Oda K., Kobayashi A., Ohashi S., Sano M. Biosci. Biotechnol. Biochem. 75, 1832-1834（2011） 13） Wang Y., Li W, Siddiqi Y, et al. Fungal. Genet. Biol. 45, 94-102（2008） 14） Sano M. Biosci. Biotechnol. Biochem. in press. 15）田中光，佐野元昭，油谷幸代他，第 66 回日本生物工学会大会要旨集（2014） 16）佐野元昭，田中光，油谷幸代他，第 66 回日本生物工学会大会要旨集（2014）. 1） Machida, M., Asai K., Sano M., et al. Nature 14. 醸協（2017）.

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