アブラナ科野菜中2-チオチアゾリジン-4-カルボン酸(TTCA)のキャピラリー電気泳動法による測定

全文

(1)

(2) . 川崎医療福祉学会誌原著. アブラナ科野菜中チオチアゾリジンカルボン酸（）のキャピラリー電気泳動法による測定楊井理恵½ 河辺聡子¾ 藤井俊子¿. 要約. ）とミセル動電クロマトグラフ法（）を用いて，アブラナ科野菜のキャベツとブロッコリー中の

(3) チオチアゾリジン

(4)

(5) カルボン酸（）を簡便，かつ，迅速に分析する方法について記述した．用泳動溶液は

(6) シクロデキストリン入りの四ほう酸ナトリウム溶液を，用は用泳動溶液に界面活性剤としてキャピラリーゾーン電気泳動法（. のドデシル硫酸ナトリウムを加えた泳動溶液を用いた．. × 長さのものを用い， ℃，の定電圧で測定した．試料注入量は約である．測定波長はを用いた．は，では分，では分に移行した．の検出限界はとのいずれも約で，検量線はの濃度範囲で良好な直線性を示した．本研究をアブラナ科野菜のキャベツとブロッコリー中の分析に応用した結果，はキャベツとブロッコリー中のの定性法として有用であるが，ではキャベツとブロッコリー中の濃度の測定値とによる測定値とがよく一致することが認められた．アブラナ科野菜中の測定法について比較すると，は，に比べて分析時間が短いこと，また，野菜からを水抽出後に適宜水で希釈した試料においても定量できるので，エーテル抽出に要分析条件は，以下の通りである．キャピラリーは溶融シリカ製，内径. する前処理が省けるなどの利点が認められた．. 緒. 薬，アルコール，タバコ，アブラナ科野菜の. 言. 摂取等による尿中への. 有機溶剤中毒のうち，我が国で最初に社会問題を引き起こしたのは二硫化炭素（. の排泄などが報. 告されるようになった．これらの要因のうち，アブ. ）中毒である． . ラナ科野菜のキャベツやブロッコリーなどは日常比. . は主としてレーヨンや木材パルプの産業で用いられ，. 較的多量に摂取する食品であるために，尿中. 硫黄を含む有機化合物の合成用試薬として，また，種. 濃度のバックグラウンド値への寄与率が高いと考え. 々の工業用溶剤として広範囲に使用されている．. られる．したがって，アブラナ科野菜中の. は経気道および経皮経由で吸収されたのち，その. 濃度を調査する必要がある．. . . 濃度は，高速液体クロマトグラフ法（）により測定されることが多いが，では分析試料をエーテル抽出する必要が. は未変化のまま呼気に排泄されるが，残りは未変.

(7) チオチアゾリジン

(8)

(9) カル），チオカルバミド，

(10) メルカプト

(11)

(12) チアゾリノン

(13) 等の代謝産物になって尿中に排泄される．これらの代謝産物のうち，濃度は曝露量との相関が高いことが認められており，取扱い作業者の特殊健康診断では，検査項目として尿中濃度の測定が定められている．これまでは曝露者尿以外からは検化体のまま，あるいは，. ボン酸（. あり，試料調製の前処理操作が煩雑であること，分析に長時間を要することなどの短所がある．本研究では，アブラナ科野菜中の微量の. . を簡便に，かつ，精度高く短時間に分析できる方法. ）による方は高分離能，短時間分析，. としてキャピラリー電気泳動法（法を検討した．. 出されないと考えられていたが，最近になって農. 試料負荷量や使用試薬量少量，操作簡便などの特徴を. 山口県立大学生活科学部栄養学科川崎医療短期大学介護福祉科川崎医療福祉大学医療技術学部臨床栄養学科山口県山口市桜畠丁目山口県立大学（連絡先）楊井理恵〒 . .

(14) . 楊井理恵・河辺聡子・藤井俊子. もつ微量分析法として発展してきている．今回は. の分離モードのうち，キャピラリーゾーン電気泳動法（電荷をもつ試料の分離に適用．以下）とミセル動電クロマトグラフ法（電荷をもたない試料. の泳動溶液にイオン性界面活）を用いた．分析は，，および曝露者尿の濃度測定に使用されているの計つの分. の分離に適用．. 性剤を添加して分析．以下. 析法を用いて，分析試料を水抽出とエーテル抽出試料に分けて，先ず. 標準溶液の分析法バリデー. ションを実施し，次にキャベツとブロッコリー. の定性および定量分析を行って比較検を用いて，アブラナ科野菜中のを簡便，かつ，精度高く，短時間に. 中の. 討した．その結果，. 分析できることが認められたので報告する．. （. % と略す）は和光純薬工業株式会社製を用いた．. ．泳動溶液および移動相の調製法）用泳動溶液の調製法. 用溶液（

(15) % ，四ほ . （）. う酸ナトリウム溶液）：四ほう酸ナトリウム. に少量の蒸留水を加えてスターラーを用いて溶解し，. に定容した（ + 4 ）．この溶液に

(16) % を添加し，スターラーを用いて溶解後，メンブランフィルター（ %!!

(17) ，，東洋濾紙株式会社製，では以後同じ）を用いて濾過し，超音波洗浄器で分間脱気した．（）用溶液（ % ，

(18) % ，四ほう酸ナトリウム溶液）：用溶液に % を添加し，スターラーを用いて溶解後，メンブランフィルターを用いて濾過. 方. 法. ．分析装置と分析条件）. し，超音波洗浄器で. 分間脱気した．. ）用移動相下記の溶液. と ) を用いて送液は表のタイム. プログラムにしたがってグラジエント法で行った．. 分析装置：フォトダイオードアレイ検出器付キャ. !

(19). ，大塚電子株式会社製）；キャピラリー，溶融シリカ製（内径，；長さ，；検出器までの長さ，）．分析条件：印加電圧，；測定温度， ℃；測定波長，；注入量，約（落差方式， × "# ）．. 表. ピラリー電気泳動装置（. 送液プログラム. ）.

(20)

(21) ； $ ；脱気装置，%&'$ ；カラムオーブン， (

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(23) )；システムコントローラー，

(24) )；コミュニケーションバスモジュール， )

(25) ；フォトダイオードアレイ紫外可視検出器，%

(26) *+；カラム，, -."./ 0

(27) 1（内径，；長さ，；#. 社製）．分析条件：測定温度， ℃；測定波長，；注入量，；流速， ,；移動相，（酢酸溶液）)（アセトニトリル）．分析装置：島津製作所製. 送液ユニット（ポンプ），. ： )：. 酢酸. を蒸留水でに定容し，超音波. 分間脱気したもの（酢酸）．. 洗浄器で. アセトニトリル．. ．標準溶液の調製法. を 3 溶液でに 5 ）を調製した．この標準原液を用いて用と用定容して標準原液（. の標準溶液を以下のように調製した．）用標準溶液希釈標準溶液：目的の濃度に合わせて，標準原液を. ．試薬および試薬調製法. は 2.,- -# ．．製を用いた．塩化ナトリウム（試薬特級，3 と略す），高速液体クロマトグラフ用蒸留水，ジエチルエーテル（過酸化物フリー），アセトニトリル，メタノールはナカ. 塩酸，酢酸，四ほう酸ナトリウム（試薬特級），

(28) シクロデキストリン（

(29) % と略す），ドデシル硫酸ナトリウムライテスク株式会社製を用いた．. 3 溶液で適宜希釈し，メンブランフィル分間脱気した．. ターを用いて濾過し，超音波洗浄器で. エーテル抽出標準溶液：希釈標準溶液を試験管に. 取り，塩酸とジエチルエーテル. を加えて遠心分離（ 5 .+ ，分間，以後同じ）後，上清を分取した．試験管の残りの液に，再び塩酸とジエチルエーテル. を加えて，遠心分離後，上清を分取し，.

(30) アブラナ科野菜中先に分取した上清と合わせて. とし，窒素ガスを. 用いてエーテル層を除去した．残存する乾固物に. 3 溶液を加え，メンブランフィル分間脱気した．. ターを用いて濾過し，超音波洗浄器で）用標準溶液. 希釈標準溶液を上述のようにエーテル抽出し，残. を加 %!!

(31) ，，東洋濾紙株式会社製，では以後同じ）を用いて濾過し，超音波洗浄器で分間脱気した．. 存する乾固物に. . メタノール溶液. え，メンブランフィルター（. の測定. . 後の上清をメンブランフィルターで濾過し，超音波洗浄器で. 分間脱気した．. ）キャベツ. . を千切りにし，蒸留水とともに均質化した後時（）生キャベツ溶出液；生キャベツ. 間攪拌した．液相部分を採取し野菜試料とした．. . を千切りにで分間茹でた．茹で汁と茹で. （）茹でキャベツ；生キャベツし，蒸留水. キャベツに分け，茹で汁はそのままを野菜試料とし. とともに均質化時間攪拌し，液相部分を野菜試料とした．（）キャベツジュース；生キャベツを千切りにしてジューサー（ <=,#. ,>,#. ，!')!! 0! 製，以後同じ）にかけた．濾過後液相. た．茹でキャベツは蒸留水した後. ．標準溶液の調製法分析法バリデーションのうち，併行精度，室内再現精度，検出限界および直線性を調べた．併行精度（. 0#+#363/,,67 . 8,6-,$"#.,#" +.#,$. ", ）は，短時間の間に同一条件下で測定する場合 !6#.#2,36# +.#,", . )#69##$"#.,#" +.#,", ）は，同一施設内にお. の精度を，室内再現精度（. 部分を野菜試料とした．）ブロッコリー. . . （）生ブロッコリー溶出液；生ブロッコリー. いて，試験日，試験実施者，器具，機器等を変えて. を一口大にきざみ，蒸留水とともに均質化した後時間攪拌した．液相部分を採取し野菜試. 測定する場合の精度をいう．検出限界（. 料とした．. 料中に存在する分析対象物の検出可能な最小濃度または量をいう．直線性（. ,#3.,67 ）は，一定の濃度. 一口大にきざみ，蒸留水. 茹で汁と茹でブロッコリーに分け，茹で汁はそのま. 範囲内で試料中の分析対象物の濃度（量）と直線関. まを野菜試料とした．茹でブロッコリーは蒸留水. ,,6" : 2#6#6, . %#6#6, ,,6"；以下 (% ）は，試. . を. で分間茹でた．. （）茹でブロッコリー；生ブロッコリー. 係にある測定値を与える能力のことで，本研究では. とともに均質化した後時間攪拌し，液相. 回帰直線と相関係数で示した．. 部分を野菜試料とした．. ，とものエーテル抽出標準溶液を用いて求めた．併行精度は同一日に続けて回の標準溶液の分析を行い，室内再現精度は日間日回（ ; ）の標準溶. フィルターで濾過後，濾液を超音波洗浄器で. 液の分析を行った．各精度は，移行時間，ピーク面. 脱気した．. 併行精度と室内再現精度は，. に. （）ブロッコリージュース；生ブロッコリーを一口大にきざみ，ジューサーにかけた．濾過後液相部分を野菜試料とした．以上の野菜試料を遠心分離し，上清をメンブラン. 分間. 積，ピーク高の相対変動係数（標準偏差／平均値×. ，以下 0% ，）で表した． (%は，分析対象物を既知の低濃度で含有する試.

(32) ．分析試料の調製法. 料のシグナルをベースラインノイズと比較して求め. では，下記の水抽出試料とエーテル抽出試料を分析試料とした．では，水抽出試料では分. た．検出限界の設定には，シグナル対ノイズ比を. 析が出来ないのでエーテル抽出試料だけを分析した．. . ：とするのが一般的であるため，本研究ではベース. 倍値を用いた．回帰直線と相関係数をのエーテル抽出標準溶液のつの濃度（，，，および）についてピーク面積の測定値から求め，直. 分析に供した．. 線性を調べた．. 準じてエーテル抽出して分析試料とした．. ラインにおけるノイズ面積の平均値の. ．野菜試料の調製岡山県内で無農薬栽培されたキャベツとスティックブロッコリー（以後ブロッコリーと略す）から，以下の野菜試料を調製した．各野菜試料は遠心分離. ）水抽出試料上記の野菜試料をそのまま，または適宜希釈して）エーテル抽出試料. を標準溶液のエーテル抽出法に. 野菜試料. 結果および考察. ．標準溶液の分析. 標準溶液（）の紫外部吸収スペク.

(33) 1. 楊井理恵・河辺聡子・藤井俊子. '

(34) 形日立製であった．そこで，，ともに測定波長をに設定した．図にエレクトロフェログラムと . トルをダブルビーム分光光度計（. 作所製）で測定した結果，極大吸収波長は. 表. 検出限界. の吸収曲線を示す．本条件下では，分離モード別に. はでは平均分，では分に移行した．希釈標準溶液とエーテル抽. 見ると平均. 出標準溶液とでは移行時間はほぼ同じであった．. クロマトグラムとの吸収曲線を示す．ピークの保持時間は平均分で図に. あった．. ．分析法バリデーション. 濃度がの範囲において，本，ともに回帰直線は良好な直線性を示し，相関係数もきわめて高いことが認められ（ ≧ 444 ），の定量が可能であることが認められた．回帰直線と相関係数は表に示すように，. . エーテル抽出標準溶液の併行精度を表に，. 室内再現精度を表に示す．併行精度は. 表. 分析法. 標準溶液の回帰直線と相関関数. のいずれにおいても移行時間，ピーク面積，ピーク高. 0%が . の. 以内できわめて高かった．室内再現精. 度は移行時間では. 0%が . 以内で精度がきわめ. て高かったが，ピーク面積，ピーク高は. やでも . 以上を示し，. で. 以上となった．. これらのことから，ピーク面積やピーク高を用いて. 定量する場合には，測定日毎に標準溶液の測. 定により補正をする必要があることが示唆された．表. ．アブラナ科野菜試料のエレクトロフェログラム. 併行精度. 生キャベツと生ブロッコリーの水抽出試料のエレ. ）と図（）. クトロフェログラムを図（. に，エーテル抽出試料のエレクトロフェログラムを. ）と図（）に示す．野菜試料中のは，のいずれでも他の成分図（. と分離したピークとして認められた．. ．アブラナ科野菜試料のクロマトグラム表. 室内再現精度. 生キャベツと生ブロッコリーのエーテル抽出試料の. クロマトグラムを図（ 3：生キャベツ，/：においても . 生ブロッコリー）に示す．. は他の成分と分離したピークとして認められた．. ．アブラナ科野菜中濃度の測定. 濃度の測定をとで行った．水抽出試料で分析したものを ? ，エーテル抽出試料で分析したものを ? で表し，はエーテル抽出試料を分析した．分析法別の濃度を表にアブラナ科野菜中. (% を表に示す．本では，検出限界濃度がであったが，これまでに，，などの報告が見られ，本 (% はこれらより低い．検出限界量は本成績では + であるが， + や 1 + とする報告も見られる．の (% についての報告はこれまでに見られない．. 示す．キャベツ，ブロッコリーともに生，茹でたも. 種類についてみると，同一の試料の濃度は水抽出試料を分析した ? ，エーテル抽出試料を分析した ? およびエー. の，ジュースの.

(35) アブラナ科野菜中. 図. 4. エレクトロフェログラムと吸収スペクトル標準溶液，

(36) ．. 図. テル抽出試料を分析した. の測定. クロマトグラムと吸収スペクトル標準溶液，

(37) ．. のつの分析法で. 比較的近い値を示していることが認められた．. の成分が少し重なる可能性があると考えられる．なお，アブラナ科野菜中の. は植物による代謝. 濃度についての報告では，生キャベツの濃度として，, らが，@,=-, らがと報告している．本成績では生キャベツのはで 1 で前述の報告よりも低濃度であるが，. が限定されていることなどから，多量の試料を分析. これはキャベツの種類や個体差によるものと考えら. は一個体について. アブラナ科野菜の. 産物であり，個体別の含有量の変動幅が大きい．また，本研究で用いた野菜は無農薬栽培品で収穫時期することが出来ず，その上，野菜試料は保存がきわめ. . て難しく冷蔵保存では腐敗が速かったので，表に. れる．. 分析施行の成績を示した．今後，例数をあげてアブラナ科野菜中の微量の . ピークを. 濃度測定について検討する予定である．. では , らがキャベツので確認しているが，定量値の報告は見られない．なお，本研究でもによるアブラナ科野菜の濃度測定を試みているが，, らが指摘するように，ではピークと他. 本研究は，平成年度川崎医療福祉大学プロジェクト研究費の助成をうけて行ったものの一部である．.

(38) . 楊井理恵・河辺聡子・藤井俊子. 図. 図. アブラナ科野菜中のエレクトロフェログラムアブラナ科野菜の水抽出試料を分析．. アブラナ科野菜中のエレクトロフェログラムアブラナ科野菜の水抽出試料を分析．.

(39) アブラナ科野菜中. 図. 図. の測定. アブラナ科野菜中のエレクトロフェログラムアブラナ科野菜のエーテル抽出試料を分析．. アブラナ科野菜中のエレクトロフェログラムアブラナ科野菜のエーテル抽出試料を分析．. .

(40) . 楊井理恵・河辺聡子・藤井俊子. 図. アブラナ科野菜中のクロマトグラムアブラナ科野菜のエーテル抽出試料を分析．. 表. アブラナ科野菜中濃度（）. 文献. ），

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(298) の分析法に関する研究．平成年度川崎医療福祉大学大学院医療技術学研究科臨床栄養学専攻修士論文，( ，&,,4 ．（平成%年 % 月日受理）.

(299) . 楊井理恵・河辺聡子・藤井俊子.

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