ラッ ト高眼圧モデルの網膜神経節細胞変化 伊 藤

原 著

ラッ ト高眼圧モデルの網膜神経節細胞変化

伊 藤

石 川

11

久 子

和 淑

宮 野

間 高

l12

代 志 彦

幾 仁 和

黒 崎 村

大 山 正

111

浩 美 満

友

黒 時 滞

大 目 中

忠 太

抄録 ラッ トの上強膜静脈 を焼灼 して眼圧 を上昇 させ,高眼圧状態 を保持す る ことによ り,高眼圧モデル を作成 した.

ケ月 間高眼圧状態 を保持 した ラッ ト

,及びコン トロール ラッ ト

の網膜神経節細胞数 を

i I 蛍光色素 を用 いて逆行 性 にラベル して測定 し比較検討 した.上強膜静脈 を焼灼 した ラッ ト

の眼圧は無処置 ラッ ト

の眼圧 と比較 して有意 に上昇 していた.網膜神経節細胞数は,高眼圧モデルではコン トロール と比べて有意 に減少 していた. ラッ トの高眼 圧モデルは緑内障モデル とな りうると考え られる.

弘前医学

キーワー ド:緑内障;ラッ ト;網膜神経節細胞.

OR. GI NALARTI CLE

CHANGE OF RETINAL GANGLION CELLS IN THE OCUI.AR m RTENSION MODEL RAT

Tadashiltol'

,

,

,

,

,

,

,

Mitsuru Nakazawal), KazuhikoShoumura2'

Abstractltisknownthatglaucomatousopticneuropathyiscausedbyselectivecelldeathofretinalganglioncells (RGC)byelevatedintraocularpressure(lop)andothercauses.Inthepresentstudy,WeinvestigatedRGCdeathin experimentalglaucomamodelrats(22rateyes)producedbycauteryofthreeepiscleral/limbalveins.Ascontrols,

10rateyeswithnormal二opwereused.Aftercauteryofepiscleralveins,theaverageof二opwassignificantly higherascomparedwithcontrolsduring6monthsaftertheoperation.ThenumberofretrogradelabeledRGCs wassignificantlydecreasedinhighlopeyesascomparedwithnormal二opeyes.Thereforetheepiscleral/limbal veinsocclusionmodelgaveaconsistencethatlong‑term elevationof二opleadstolossofRGCsandisusefulasan experimentalglaucomamode

l .

HirosakiMed.J.56:15‑20,2004 Keywords;glaucoma;rat;retinalganglioncell.

緒

緑内障は成人における失明の主要な原 因のひ と つである.本症 の主体 は特異な緑内障性視神経障

害であるが, これ には眼圧上昇 に伴 う原発および 続発緑内障 と眼圧が正常範囲内である正常眼圧緑 内障の

種類がある.最近の研究 によれば視神経 障害 の原 因 として網膜神経節細胞 のアポ トー シス

1)DepartmentofOphthalmology,Hirosaki UniversitySchoolofMedicine

2)TheFirstDepartmentofAnatomy,Hirosaki UniversitySchoolofMedicine

Correspondence:T.Ito

Receivedforpublication,March26,2004 Acceptedforpublication,September6,2004

1 )弘前大学医学部 眼科

)弘前大学 医学部解剖学第一

別刷請求先 :伊藤 忠

平成

年

月

日受付

平成

年

月

日受理

16 _{伊 藤 ,他}

が関与す る ことが知 られている

. この網膜神 経節細胞 のアポ トー シス を引き起 こす機序 として 神経栄養 因子 の枯渇,虚血

,硝子体 中のグル タミン酸濃度の上昇

ぉよび, 自己免疫等 の関与

1日 2

) が示唆 されている.

しか しなが ら,緑 内障のメカニズムの全貌は依 然明 らか にされてお らず,その解 明 と治療研究 は 今後 の課題である.緑 内障の病態 の一端 を明 らか にす るた め には, 動物 の緑 内障 モ デル の作 成 は 重要な手がか りを与 えるもの と期待 され る.今 回 我 々は眼圧 によ る網膜 神経 節細 胞 の障害 に着 目 し, ラッ トの高眼圧 モデル を作成 してその高眼圧 による網膜変化 について検討 したので報告す る.

目 的

ラ ッ トの眼圧 を上昇 させ,高眼圧状態 を保持す る ことによ り,緑 内障モデル を作成す る.

ケ月 間高眼圧状態 を保持 した ラッ トの網膜神経節細胞 数 を測定 し,眼圧上昇前後 の網膜神経節細胞 の変 化 を比較検討す る.

方 法

雄 の ウィス ター ラ ッ ト

,週齢 お よそ

週齢)

匹 を使用 した.飼 育 中は室 温 を

に保 ち,照明は

時間毎 の明暗サ イ クル ( 明 :

時

時,暗 :

時

時) と し,食餌及び水は 自由に摂取で きるよ うにした.

麻酔 は塩酸 ケタ ミン

及びキ シラジ ン塩 酸塩

を腹腔 内注射 して,麻酔下 にて眼 球 を十 分 に露 出 した上で, 眼科 手術 用バ ク レン ( はんだや製) を用 いて上強膜静脈 を

本焼灼 し て眼圧 を上昇 させ た.眼圧 の測定は,同様 に麻酔 下 にて眼圧 計

を用 いて測 定 し た.眼圧 日内変動 による差 を考慮 して測定 の時間 帯 を

時前後 に統一 した.測定はすべて同一検者 が行 った.眼圧は

ケ月毎 に測定 した.眼圧 が下 降 していた場合は上強膜静脈 の焼灼 を追加 し,高 眼圧状態 を保持す るよ うに した.対照 として正常 眼圧 ラッ トの眼圧 も 1ケ月毎 に測定 した.経過観 察 中に死亡 した個体は除外 した.

上側

6

カ月後 に麻 酔 下 にて 左 右 の頭 頂 部 の頭 蓋 骨 をはず し, マイ ク ロ シ リンジ を用 いて 上丘 よ り

( 以下,

i I 蛍光色素) を

で

に溶解 して注入 した.Di I 蛍光 色 素は軸索 輸送 によ り神 経線維 を伝わ って網膜神経節細胞 に到達す る.

時間後 にジエチルエー テル による深麻酔で死亡 さ せた直後 に眼球 を摘 出 し, 4%パ ラホルム アルデ ヒ ドで固定後 に網膜伸展標本 を作成 して蛍光顕微 鏡

社製)下で観察 した.

i I 蛍光色素 によ り,神経線維お よびそれ に連な る網膜神経節 細胞 の細胞質が染色 され る ことで網膜神経節細胞 が観察 で きる.染色 された網膜神経節細胞 の数 を 測定 した.測定 は図

のよ うに,

象限それぞれ につ いて

Lni Z の領域 を決 め,

象限 につ き それぞれ 中心側, 中間周辺部お よび周辺部 の

箇 所,計

箇所で網膜神経節細胞数 を測定 し,それ ぞれ を

2 当 りの数 に換算 した. 対照 として, 同齢 の正 常 眼圧 ラ ッ トに対 して 同様 の操 作 を行 い網膜神経節細胞数 を測定 した.有意差検定 には

( 叫

∈∈ ) 出 藍

Student‑t

検 定法 を用 い,危 険率

未満 を有意 とした.

結 果

D

i I 蛍光 色 素 にて染 色 され た網膜 神 経 節細胞 は 神経線維お よびそれ に連 な る細胞体 の細胞質が赤 色 に染色 され 同定 は容易で あ り,組織計測 上 と く

に問題 とな る ことはなか った.高眼圧 ラ ッ トの眼 圧 は平均

( 平均値 ±標準偏差)

で経過 した. それ に対 して, 正 常 眼圧

ラ ッ トの眼圧 は

.

で 経過 した ( 図 2 ) .高眼圧 ラッ トの上強膜静脈焼灼 前後で は焼灼後 の方 が焼灼前 と比べて有意 に眼圧 が上昇 していた

01) .

網膜神経節細胞数 の変化 の検 討 につ いては,正 常眼圧 ラッ トの平均網膜神経節細胞数が

±

個

であったの に対 し,高眼圧 状態 を

ケ月間保持 した ラッ トの平均網膜神経節 細胞数 は

個

と有意 に 低下 して いた

( 図

) .測定部位 による 有意差 は認めなかった.

術

18 _{伊 藤,他}

考 察

ラッ トの上強膜静脈 を焼灼 して眼圧 を上昇 させ た報告 は過去 にもい くつかある.それ らはいずれ も 2週 間か ら4ケ月程度 の観察で あったが,今 回 我 々は

ケ月間 と,比較的長期 にわたって高眼圧 状態 を保持す る ことがで きた. ラッ トの高眼圧 モ デル を作成す る方法 として,主 に上強膜静脈 を焼 灼す る方法

' と,角膜輪部付近 を光凝固す る こ

とで繊 維柱帯 の房水流 出を抑制す る方法

な どがある.

ら

' は角膜輪部 の光凝固によ り, 対 照 と比べて平均 して

程度 の眼圧 上昇 を得 られた と述べている. また

ら

は角膜輪部 の光凝 固 と上強膜静脈 の直接光凝 固を併用 した群 と,角膜輪部 の光凝固のみ を行 っ た群での比較 をお こなってお り

つの方法 を併 用 した群 では対 照 と比べて約

倍 の眼圧 上昇 を 得 られて いるのに対 して,角膜輪部 の光凝固のみ を行 った群 では約

倍 の眼圧 上昇 に とどまって いた

ら1 3 ' は,高眼圧 を保持す る方法 とし て

を使用す ることによ り,

(zLuLuJ

寧 ) 東 壁 患 海 蝕 走 些 蛋 0 0 0 0 0 0 0 5 0 3 2 フL 50 0 0 00 50 0 ｢]l il

流出路 の再開通 を阻害す る方法 を用 いている. し か し今 回我々の行 った上強膜静脈 を焼灼す る方法 のみで も,上強膜静脈の焼灼 を随時追加 した こと によ り,十分高眼圧 を保持す る ことが可能であっ た. ラッ トの眼圧測定の問題点 としては, ヒ トの 場合 と比べて眼球 自体 の前後 の可動性が大 きいた めに,眼圧計 を眼球 に接触 させた際に,眼球 自体 が眼宿の奥 に移動 して しまうことである.そのた め,厳密 には眼圧 の値その ものは正確 とはいえな いが正常眼圧および高眼圧 の

群 間を比較す る と いう意味では有用である と考 え られた. また, 眼 圧測定 の際の誤差 を極 力避 けるため,すべて同一 検者が測定 し,値 にば らつきが出た場合は繰 り返 し測定 し,一番高 い値 と一番低 い値 を除外 した上 で平均値 をとった.

眼圧 上昇 に伴 う網膜神経節細胞数の減少 につ い て,

ら

1 ' は, 眼圧 を上昇 させ て か ら最初 の 3週 間 までは毎週 12%減 少 し, 3週 間 以降か ら2ケ月までは減少率が毎週 2%ずつ減少 し, 2 ケ月間で平均す ると網膜神経節細胞数が毎 週

ず つ減 少 した と述べ て い る. また,

I ★

対照ラッ ト 鵡高眼圧モデルラッ ト

図3 網膜

ら

は網膜神経節細胞 層 の細胞 数が, 眼圧 上昇か ら 3日後 には約 20%の減 少 を認 め た と報告 して いる. いずれ の報告で も眼圧 上昇か ら比較的短 い 期間で大 きな減少がみ られ,時間経過 と共 にそ の 減少率が小 さ くな って いる.今 回の我 々の実験で は

カ月間で平均す る と網膜神経節細胞数が毎週 2. 1%ず つ減 少 して いた. この ことか ら, 6ケ月 間 とい う長期 間で さ らにそ の後半で減少率が小 さ くな って いる可能性が ある と思われ た. この こと を立証す るため にはよ り短期 間での網膜神経節細 胞数 の測定 を追加す る必要がある.

今 回 の実 験 で, ラ ッ トの高 眼圧 モ デル にお い て, 網 膜 神 経 節細 胞 数 が有 意 に減 少 して いた こ とよ り, 高眼圧 ラ ッ トの網膜 に緑 内障性 の変化 が 起 こって いる ことが推測 された. この ことか ら, ラッ トの高眼圧 モデルが緑 内障モデル とな りうる と考 え られた.

ラッ トの緑 内障モデル を確立す る ことによ り, 今後それ らを使用 して緑 内障のメカニズムや網膜 の緑 内障性変化,及 び緑 内障治療薬 の開発等 の研 究 に有用 とな りうる ことが示唆 された.

参 考 文 献

1

,

2)OkisakaS,MurakamiA,MizukawaA

,

3)KaushikS,PandavSS,Ram ∫.Neuroprotection inglaucoma.∫PostgradMed2003

;

4)QuigleyHA,NickellsRW,KerriganLA,Pease ME,ThibaultDJ,ZackDJ.Retinalganglion celldeath in experimentalglaucomaand afteraxotomy occursby apoptosis.Invest OphthalmolVisS°i1995;36:774‑86.

5)McKinnonSJ,LebmanDM,Kerrigan‑Baumrind LA

,

,

L

2002;43:1077‑87.

6)ChungHS,HarrisA,EvansDW,Kagemann L,GarzoziHJ,MartinB.Vascularaspectsin thepathophysiology ofglaucomatousoptic neuropathy.SurvOphthalmol1999;43(Suppl

l

) :

7)Yamamoto T,Kitazawa Y.Vascular pathogenesisofnormal‑tension glaucoma:

apossiblepayhogeneticfactor,Otherthan intraocularpressure,ofglaucomatous optic neuropathy.Prog Retin Eye Res.

1998;17:127‑43.

8)Flammer∫.Thevascularconceptofglaucoma.

SurvOphthalmol1994;38(Suppl):S3‑6.

9)Vorwerk CK,Lipton SA,ZurakowskiD

,

B

10)OtoriY,WeiJY,BarnstableCJ.Neurotoxic effectsoflow dosesofglutamateonpurified ratretinalganglioncells.investOphthalmol VisS°i1998;39:972‑81

.

ll

12)CartwrightMJ,GrajewskiAL,FriedbergML

,

A case‑controlstudy. Arch Ophthalmol 1992;110:500‑2.

13)MittagTW,Danias

∫

,

l .

14)WoldeMussieE,RuizG,WijonoM,WheelerLA.

Neuroprotectionofretinalganglioncellsby brimonidineinratswithlaser‑inducedchronic ocularhypertension.InvestOphthalmolVis Sci2001;42:2849‑55.

15)AhmedF,TorradoM,JohnsonE,Morrison

20 伊 藤,他

J,Tomarev S

I

16)BakalashS,KesslerA,MizrahiT,Nussenblatt R,SchwartzM.Antigenicspecificity of immunoprotectivetherapeuticvaccination forglaucoma. InvestOphthalmolVisS°i 2003;44:3374‑81

.

17)MabuchiF,AibaraM,Mackey M

R

InvestOphthalmolVisS°i2003;44:4321‑30.

18)Martin KRG,Quigley HA,Zack DJ,

Levkovitch‑VerbinH,Kielczewski∫,Valenta D,Baumrind L,eta

l

protection:Retinalganglion cellsin arat glaucomamode

l

19)Levkovitch‑Verhin H,Quigley HA,Martin KRG,ValentaD,BaumrindLA,PeaseME.

Translimballaserphotocoagulation to thetrabecularmeshwork asamodelof glaucomainrats.InvestOphthalmoIVisS°i 2002;43:402‑10.

20)Lam TT,KwongJMK,TsoMOM.Earlyglial responsesafteracuteelevatedintraocular pressureinrats.InvestOphthalmolVisS°i 2003;44:638‑45.

2

1

Neuroprotectionofretinaュganglioncellsby brimonidineinratswithlaser‑inducedchronic ocularhypertension.InvestOphthalmolVis Sci2001;42:2849‑55.