平成
23 年度新潟薬科大学薬学部卒業研究Ⅱ
論文題目
肥満マウスにおける桑葉の効果
Effect of mulberry leaf in the obesity mouse
臨床薬理学研究室 6 年
06P025 風間 美緒
要 旨
日本肥満学会において、肥満とは脂肪組織の過剰な蓄積状態と定義され、Body Mass Index(BMI)（kg／m2）≧25 が肥満と規定されている。近年、生活習慣の変化から BMI25 以上の肥満が増加傾向にある。糖尿病や高血圧、脂質異常症などの様々な生活習慣病は、 肥満に起因し、心筋梗塞や脳梗塞など命に係わる病気を引き起こす要因ともなる。 桑 と は 、 ク ワ 科 ク ワ 属 の 総 称 で 、 葉 は 蚕 の 飼 料 と し て 使 わ れ て い る 。 近 年 、 桑 葉 (Murbelly: MB) は ペ ル オ キ シ ソ ー ム 増 殖 剤 活 性 化 受 容 体 (peroxisome proliferator-activated receptor: PPAR）シグナル経路に作用し、肥満に対する効果があ ると報告されている。PPAR はステロイドホルモン受容体スーパーファミリーに属する核内受容体の一種であり、・・の 3 種類のサブタイプが存在する。PPAR は、様々な組織での
脂質代謝に深く関与している。
そこで今回の研究では、肥満マウスを用いて、MB2.5%と MB25%における肥満に対す る効果の検討を行った。
方法として、各群6 匹のマウスに高脂質餌(Hight Fad Diet32: HFD32)を与えたのち、
MB を 食 べ さ せ 、 体 重 、 血 糖 値 、 中 性 脂 肪 、 総 コ レ ス テ ロ ー ル を 測 定 し 、 肝 臓 の Hematoxilin-eosin (HE)染色と蛋白の発現を行った。 結果としては、MB 投与群では肝臓における PPAR、PPAR、retinoid X receptor (RXR)の活性化を介して、脂肪酸代謝と脂肪細胞の分化を促進し、肥満を改善した。特に MB2.5 群では、体重の大きな減少や PPARとRXRの発現が有意な上昇を見せているこ とから、桑葉の濃度は 25％より 2.5％の方がより肥満の効果が高いと考えられた。さらに、中 性脂肪や血糖値も改善したことから肥満だけでなく、糖尿病やメタボリックシンドロームも改 善させる効果があるのではないかと推定された。
キーワード
1. 肥満
2. Body Mass Index (BMI) 3. 桑葉(Murbelly: MB)
4. peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) 5. retinoid X receptor (RXR)
6. MF 餌
7. Hight Fad Diet (HFD) 8. Western Blotting 法 9. 血糖値
10. 中性脂肪
11. 総コレステロール
12．Hematoxilin-eosin(HE)染色
13. LiverWeight (LW)/ Body Weight (BW)
14．脂肪酸の酸化
目 次
１．はじめに ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 1 ２．方法 ・・・・・・・・・・・・・・・ 1 ３．結果 ・・・・・・・・・・・・・・・ 3 ４．おわりに ・・・・・・・・・・・・・・・ 6 謝辞 ・・・・・・・・・・・・・ ７ 引用文献 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 81
論 文
１．はじめに 日本肥満学会において、肥満とは脂肪組織の過剰な蓄積状態と定義され、Body Mass Index(BMI)（kg／m2）≧25 が肥満と規定されている1)。近年、食生活など生活習 慣の変化からBMI25 以上の肥満が増加傾向にあり、特に男性では約 30%を占め、過去 30 年間で 2 倍に増えている 2)。肥満は、糖尿病や高血圧、高脂血症などの様々な生活 習慣病を招き、また心筋梗塞や脳梗塞など命に係わる病気を引き起こす要因となる3)。 ペ ル オ キ シ ソ ー ム 増 殖 剤 活 性 化 受 容 体(peroxisome proliferator-activated receptor: PPAR）はステロイドホルモン受容体スーパーファミリーに属する核内受容体の 一種であり、・・の3 種類のサブタイプが存在する。PPAR は、脂質代謝において重 要な役割を担っている。特にPPARは肝臓に多く存在し、脂肪酸の酸化を促進しトリグ リセリド合成を低下させると報告されている4)。 桑とは、クワ科クワ属の総称で、葉は蚕の飼料として用いられ、糖尿病の予防や治療に 生薬として用いられてきた 5)。最近の研究で桑葉は、動脈硬化や高血圧、肥満を予防す る効果があると報告され、機能性食品として期待されている 6)。特に肥満における効果で は PPAR 経路に作用し、肥満を改善させると報告されている7)。本研究では、マウスを用 いて、桑葉の肥満に対する効果を検討した。 ２．方法 2-1. 動物・体重・血糖値 Crlj：CD1(ICR)雄マウス、7 週齢を 24 匹用いた。マウスを 6 匹ずつ 4 群に分けた。そ れぞれの群の詳細は表1 に記す。各群において、週 1 回体重を量り、血糖値は初日と桑 葉投与前と投与後に測った。2
表1
正常(N）群 普通の餌(MF) 12 週間
非治療 (HFD) 群 高脂質餌(Hight Fad Diet32: HFD32） 8 週間→MF 4 週間 桑葉2.5% (MB2.5)群 HFD32 8 週間→桑葉(MB）2.5% 4 週間 桑葉25% (MB25)群 HFD32 8 週間→桑葉(MB)25% 4 週間 2-2. 血中脂質の測定 エーテル麻酔下にて、マウスの血液を取り出した。血液は 4 度で 3000 回転で遠心し、 上清を取り、総コレステロール、中性脂肪を測った。 2-3. Western Blotting 法による蛋白の発現
取り出した肝臓をLysis Buffer (50mM Tris HCl pH7.4, 200mM NaCl, 20mM
NaF, 1mM Na3VO4,2-Mercaptoethnol, Protease inhibitor) 1mL にそれぞれの
0.1g の組織を砕いて入れ、ホモジナイズした。4 度で 10 分、3000 回転で遠心し、上清を
取り原液とした。原液と2×Sample Buffer を 1:1 で混和し、95 度で 5 分間熱処理し、サ
ンプルとした。
10(w/v)% Sodium dodecyl sulfate - polyaclylamide gel
electrophoresis(SDS-PAGE)ゲルを用い、電気泳動を行い、ニトロセルロース膜に転写 した。その後、1×TBS・Tween20(20nM Tris, 137nM NaCl, 0.5% Tween-20）で、メン ブレンを洗浄し、5%Blocking スキンミルクを用い、Blocking を行った。ECLplas(アマシ
ャム RPN-2132）を調整し、蛋白を検出した。
1 次抗体は、PPAR抗体1:500, PPAR抗体1:500, retinoid X receptor(RXR)抗
体: 1:500. である。また、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) 1:1000 をコントロールとした。1 次抗体は全て santa cruz 社の物である。 2-4. 組織染色(Hematoxilin-eosin:HE 染色) 肝臓を切り出し、10%ホルマリンで固定し、パラフィン包埋切片を脱パラフィン処理し、 HE 染色を行った。 2-5. 統計処理 数値は平均値±標準誤差で表し、統計学的検討にはone-way ANOVA、tukey 法、 unpaired t-test 法を用い、p < 0.05 を有意とした。
3 ３．結果 3-1. 体重・血糖値 N 群では 12 週間徐々に体重が増加した。MB 投与群では、治療開始前の 8 週間は体 重の増加が見られたが、桑葉を投与開始後の8 週目以後体重の減少が見られた。また、 HFD 群でも、8 週間体重が増加し、8 週目から体重の減少が見られた。これは、HFD 群 では8 週目から、餌を MF に変えたためだと考えられる。(図 1-A) 血糖値の結果は、N 群では初日に比べ 12 週間後血糖値が低下した。HFD 群と MB2.5 群、MB25 群では 8 週目まで血糖値の上昇が見られたが、8 週目以降は降下が 見られた。(図1-B) A B 25 35 45 55 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 N HFD MB2.5 MB25 (wk) 体 重 (g) 65 25 35 45 55 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 N HFD MB2.5 25 35 45 55 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 N HFD MB2.5 MB25 (wk) 体 重 (g) 65 80 100 120 140 160 180 200 0 2 4 6 8 10 12 N HFD MB2.5 MB25 (wk) 血 糖 値 (mg /dl) 80 100 120 140 160 180 200 0 2 4 6 8 10 12 N HFD MB2.5 MB25 80 100 120 140 160 180 200 0 2 4 6 8 10 12 N HFD MB2.5 MB25 (wk) 血 糖 値 (mg /dl) 図 1. マウスの体重と血糖値の推移。A:体重 縦軸：g、 横軸：週(wk)。 B:血糖値 縦 軸：mg/dl. 横軸：週(wk)。 N:MF 12 週間。 HFD: HFD 8 週間→MF 4 週間。 MB2.5: HFD 8 週間→MB2.5 4 週間。 MB25: HFD 8 週間→MB25 4 週間。 3-2. 肝臓と体重比 (LW/BW) N 群と HFD 群を比較すると、HFD 群で有意に LW/BW 値は増加した(*p<0.05 vs. N.)。しかし、今回の研究において MB 投与群では、HFD 群と比較して LW/BW 値の変 化は見られなかった。（図2）
4 N HFD MB 2.5 MB 25 0.00 0.02 0.04 0.06 L W /BW * p<0.05 vs. N * N HFD MB 2.5 MB 25 0.00 0.02 0.04 0.06 L W /BW * p<0.05 vs. N *
図2. マウスの体重における肝臓の重さの比較。LW/BW: Liver Weight/ Body Weight.
*p<0.05 vs. N. 3-3. 中性脂肪・総コレステロール 中性脂肪ではN 群に比べ HFD 群で高値を示したが( * p<0.05 vs. N.)、MB 投与群 ではHFD 群と比べ低い値となった。特に、MB2.5 群では有意に減少した( # p<0.05 vs. HFD.)。(図 3-A) 総コレステロールは、今回の研究においてどの群においても差は見ら れなかった。(図 3-B) A B N HFD MB 2.5 MB 25 0 50 100 150 T ri a c y lg ly c e ro l( m g /d L ) * p<0.05 vs. N; # p<0.05 vs. HFD * ＃ N HFD MB 2.5 MB 25 0 50 100 150 T ri a c y lg ly c e ro l( m g /d L ) * p<0.05 vs. N; # p<0.05 vs. HFD * ＃ * p<0.05 vs. N; # p<0.05 vs. HFD * ＃ * ＃ N HF D M B2 .5 MB 25 0 50 100 150 T o t a l Ch o l e s t e r o l ( m g / d L )
図3. A: Triacylglycerol(mg/dL)、B: Total Cholesterol(mg/dL)
* p<0.05 vs. N; # p<0.05 vs. HFD. 3-4. 蛋白の発現
PPARと RXRの発現量において、N 群と比較して HFD 群では有意な減少が見ら
5 vs. HFD.)。また、RXRでは、MB25 群においても HFD 群と比較し発現量の有意な増 加を示した(# p<0.05 vs. HFD.)。(図 4-A.C) PPARでは、発現量がN 群に比べ HFD 群で低下した。MB 投与群では、HFD 群と 比較し発現量が増加した。(図 4-B) A B N HF D MB 2. 5 MB 25 0 5 10 15 20 25 L i v e r P P A R / G A P D H * # * p<0.05 vs. N; # p<0.05 vs. HFD GAPDH PPARα N HFD MB2.5 MB25 N HFD MB2. 5 MB 25 0 5 10 15 20 25 L iv e r P P A R /G A P D H * # * p<0.05 vs. N; # p<0.05 vs. HFD GAPDH PPARα PPARα N HFD MB2.5 MB25 N HFD MB2.5 MB25 N HF D MB 2. 5 MB 25 0 20 40 60 80 100 L i v e r P P A R / G A P D H G A P D H PPARγ N HFD MB2.5 MB25 N HFD MB 2.5 MB 25 0 20 40 60 80 100 L iv e r P P A R /G A P D H GAPDH PPARγ N HFD MB 2.5 MB 25 0 20 40 60 80 100 L iv e r P P A R /G A P D H GAPDH GAPDH PPARγ PPARγ N HFD MB2.5 MB25 N HFD MB2.5 MB25 C G A P D H * p<0.05 vs. N; # p<0.05 vs. HFD * # # N HFD MB 2.5 MB 25 0 20 40 60 80 Li v e r R XR /G A PD H RXRα N HFD MB2.5 MB25 GAPDH * p<0.05 vs. N; # p<0.05 vs. HFD * # # N HFD MB 2.5 MB 25 0 20 40 60 80 Li v e r R XR /G A PD H RXRα GAPDH GAPDH * p<0.05 vs. N; # p<0.05 vs. HFD * # # N HFD MB 2.5 MB 25 0 20 40 60 80 Li v e r R XR /G A PD H * # # N HFD MB 2.5 MB 25 0 20 40 60 80 Li v e r R XR /G A PD H N HFD MB 2.5 MB 25 0 20 40 60 80 Li v e r R XR /G A PD H RXRα RXRα N HFD MB2.5 MB25 N HFD MB2.5 MB25 図 4.肝臓での PPARGAPDH(A)、PPAR/GAPDH(B)、RXR/GAPDH(C)の発現 量。* p<0.05 vs. N; # p<0.05 vs. HFD. 3-5. HE 染色 HFD 群では N 群と比べ、細胞の形が乱れ細胞中に空洞（脂肪沈着）が多く見られる。 また MB 投与群では、HFD 群と比べ細胞の形の乱れや脂肪沈着が改善したことが見ら れた。(図 5)
6 HFD MB2.5 MB25 N 100Ｘ 200Ｘ HFD MB2.5 MB25 N 100Ｘ 200Ｘ 図5. マウスの肝細胞の脂肪沈着度の比較。100×は 100 倍、200×は 200 倍。 ４．おわりに PPAR はステロイドホルモン受容体スーパーファミリーに属する核内受容体の一種であ り、・・の3 種類のサブタイプが存在する。PPAR は、RXR とヘテロダイマーを形成し、
標的遺伝子のペルオキシソーム増殖剤応答領域(peroxisome proliferator response
element: PPRE)に結合して転写活性を制御している。PPARは、おもに心臓や肝臓な ど脂肪酸酸化が盛んな臓器に多く存在し、ミトコンドリアでの脂肪酸の酸化に関与して いる 8）9）。PPARは、体内組織の広範囲に発現しているが骨格筋における酸化や脂 肪組織での脂質代謝に関与している 10）。PPARは脂肪組織に多く存在し、脂肪細胞の 分化を促進し、血中トリグリセリドの低下をもたらす11）。 桑とは、クワ科クワ属の総称で、葉は古くから中国で糖尿病の予防や治療に生薬として 用いられていた 5）。最近の研究によると、高脂肪食を与えたラットに桑葉を投与すると PPAR シグナル経路の発現や脂肪酸の酸化の促進や脂肪形成が抑制されるという報 告があり7)、また桑葉に含まれる1-デオキシノジリマイシンという-グルコシダーゼ阻害作 用を持ち抗糖尿病効果がある成分が、ラットの肝臓において酸化を活性化させ、脂肪 蓄積を抑制したと報告されている12)。 今回の研究において、桑葉は肝臓における PPARとそのヘテロダイマーである RXR、PPARを活性化し、脂肪酸代謝と脂肪細胞の分化を促進し、肥満を改善するこ とが判明した。特に、PPAR、RXRの発現量で有意な上昇を示したことから、肝臓で桑
7 葉はよりPPARに作用を示すのではないかと考えられる。桑葉の濃度を比較した結果で は、MB2.5 群で、体重の大きな減少や PPARとRXRの発現が有意な上昇を見られて いることから、桑葉の濃度は 25%より 2.5%の方がより肥満の効果が高いと考えられる。さ らに、中性脂肪や血糖値も改善したことから肥満だけでなく、生活習慣病である糖尿病 やメタボリックシンドロームも改善させる効果があるのではないかと推定された。
謝 辞
実験、論文作成についてご指導を賜りました新潟薬科大学臨床薬理学研究室の渡辺賢 一教授、張馬梅蕾助手にお礼を申し上げます。8
引 用 文 献
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