博 士 （ 医 学 ） 工 藤 隆 之
学位論文題名
ヒト卵胞液における Plasma Kallikrein の分子動態と 卵胞内組織 Plasminogen Activator(tPA) 活性化機構
学位論文内容の要旨
緒言
組 織Plasminogen Activator（tPA）ーplasminogen（ 以下PLG）‑plas min系 は ，排 卵に 先立 つ 卵 胞 壁 の 脆 弱 化 に 重 要 な 役 割 を 担 う と 考 え ら れ てい る． この うちtPAは ，前 駆体 の1本 鎖型
（sctP A)よ り2本鎖 型（2ctP A)へ の変 換を 受け 活性 化さ れ ることが知られているが，ヒト卵巣 顆 粒 膜 細 胞 で 産 生 さ れ るtPAの 卵 胞 内 活 性 化 機 序 は 未 だ 解 明 さ れ て い な い ． こ の機 序に 関連 し て， 本研 究て は， 体外 受精 時 に得 られ たヒ ト卵 胞液 を材 料に ヒトPlasma Kallikrein（hPK） の 分 離 精 製 を 行 い ， 精 製 品 を 用 い て ヒ トsctPA活 性 化 能 の 有 無 に つ い て 検 討 し た ． 研究材料およぴ 方法
1．卵胞液hPKの分離精製
1996年10月 〜 12月 の 期間 に， 北海 道大 学医 学部 附属 病院 産婦 人科 にお いて ， 体外 受精 の際 に得られた卵胞 液を材料とした（GnRHa‑hMG‑hCG過排卵刺激周期），
卵 胞 液 上 清 に6倍 量P BSを 加え て希 釈し ，40％硫 安塩 析に て析 出し た分 画を 脱 塩透 析し た．
こ の 分 画 をDEAE‑cellvlose(DE‑52） 陰イ オン 交換 カ ラム （pH8.5）に 通し ，吸 着 成分 をO〜0.2 M NaCl連 続 濃 度 勾 配 に て 溶 出 し た と こ ろ ， カ ラ ム に 非 吸 着 のThr.＃1， 吸 着 し0.05M，0.13M NaClに より 溶出 され たElt.＃1，Elt.＃2の3つのhPK分 画が 分離 され た.Thr． ＃1はCM‑cellulo‑
se(CM‑52） 陽イ オン 交換 カラ ム （pH8.0）に 吸着 し，NaCI連 続濃度勾配により溶出された．この 分 画 は 更 にbenzamidine‑Sepharose 6Bカ ラ ム を 用 いて 精製 され た．Elt．#1は ，CM‑52カ ラム をpH6.0に平 衡化 した 以外 はThr.＃1と同 じ方 法で 精製 され た，Elt .#2は，濃縮後Sephacryl S‑
300カ ラ ム を 用 い た ゲ ル ろ 過 お よ びheparin‑Cellulofineカ ラ ム を 用 い て 精 製 さ れ た ． hPK活 性の 測定 には ，合 成MCA（4‑m et hy】coumaryl‑7‑amide）基質を用いた．検体を基質と pH8.0，37℃ で30分間 反応 させ た後 ，反応停止試薬（pH4.3）を加えて反応を停止した．分光光度 計 を 用 い て 波 長370nmで 励 起 さ れ た 波 長460nmの 螢 光 強 度 を 測 定 し ， 遊 離 し た7‑amino‑4‑
methylcoumarin（AMC） 濃 度 に 換 算 し ，1分 間 あ た り の 遊 離AMC濃 度 をhPK活 性 と し た ， 2．各分画の特性の検討
a)8種 類 のMCA基 質 を 用 い て3分 画 の 基 質 特 異 性 を ， ま た ，12種 類 の 蛋 白 分 解 酵素 阻害 剤を 添加して3分画の活性に対する阻害効果を比 較検討した．
b)Thr．＃1，Elt．＃1に対しては，還元下，非還元下で10％polyacrylamide gelを用いてSDS ‑P AGEお よ び 銀 染 色 を ， ま た， ウサ ギ抗hPK抗体 を用 い たWestern blot法 を行 った ．Elt .#2に対 し て は ，2〜 15％gradient native PAGE gelを 用 いてnative PAGEおよ びCoomassie Brill‑
iant Blue（CBB） 染 色 を， そし てウ サギ 抗hPK抗体 およ ぴヒ ツジ 抗ヒ トa2‑macroglobulin（以 下ha 2‑M）抗体 を用いたWest ern blot法を行った．また，Thr．＃1，Elt.＃1について，Sephacryl S ‑200カ ラ ム を 用 い て ゲ ル ろ 過 を 行 い ，Elt.#2の 精製 過程 にお ける ゲル ろ過 の 結果 も併 せて 分子量を推定し た．
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c)3分 画 の 精 製 品 と ヒ トsctPAお よ び 合 成MCA基 質 を 用 い て ，aprotinin存 在 下 で 選 択 的 に tPA活性を測定し，3分画のsctPA活性化能の相違を検討した．
d)3分 画 の精 製品 に， 種々 の量 のウ サギ 抗hPK抗体 を加 えて 免疫 沈降 を 行っ た．4℃ で17時間 静 置 後10%Staphyrosorbを 加 え ， 軽 く 撹拌 しな がら 更に4時間 静置 した 後遠 心分 離し ，上 清の 残 存hPK活 性 を 測 定 し て 対 照 と 比 較 し た.Elt.#2に 対 し て は ， ヒ ツ ジ 抗a2‑M抗 体 を 用 い た 免 疫 沈 降 法 を も 行 い ， 残 存hPK活 性 に 加 え て 残 存sct PA活 性 化 能 に つ い て も 検 討 し た ． 3．単ー卵胞の卵胞液総hPK活性の測定
1995年9月 〜1996年2月 の 期 間 に ，1．に 示し た方 法で 卵胞 ごと に採 取 ，‑80℃ で保 存さ れた 卵 胞液 （270検体 ）の 上清8皿1を用 いて ，1， に準じて総hPK活性を測定し，卵胞液量 との相関の 有無を検討した． また，手術時に採取した自然排卵周期（LH surge前）の 卵胞液（6検体）につい ても，同様にhPK活性を測定した．
卵 胞 液 の 採 取 に あ た っ て は ， 対 象 患 者 か ら 予 め 文 書 で 本 研 究 に 対 す る 同 意 を 得 た ． 結果
1．精製
Thr.＃1，Elt.＃1，Elt.＃2各々より，specific activity 63.2，54.4，11.8（nm oI／min／mgprote‑
in)，収率2.69，1．06，9.42（ゲ。），精製倍率341.85，294.00，48.76（倍）の最終精製品が得られた．
2．各分画の特性
3分 画 の 基 質 特 異 性 に は ，peptide末 端 のArg‑X結 合 を 特 異 的 に 切断 する こと など 血漿 由来 のhPKと 共通 の傾 向が 認め られ た， いず れも 活性 はDFP（diisopropylfluorophosphate），leu ‑ peptinに強 く阻 害さ れて おり ，serine proteinase群に属すると考えられた，ただしpolypepti‑
de性阻害剤のElt.＃2に対する作用は弱かった，
非 還 元 下S DS‑P AGEで はThr.＃1は 分子 量87kDaの 位置 に，Elt． ＃1は90kDaの 位置 に単 一の バ ン ド と して 検 出さ れた ．こ れら のバ ンド はWestern blot法 でも 検出 さ れた ．還 元下 では50k Daの 位 置 に 両 者 共 通 の バ ン ド が 認 め ら れ た ．Elt．#2はPAGEで は730kDaの 位置 に単 一の バン ド と し て 検 出 さ れ ， こ れ は 抗hPK抗 体 はも とよ り， 抗ぱz‑M抗 体を 用い たWestern blot法 にお いても検出された ．ゲルろ過により，Thr．＃1，Elt.＃1，＃2の分子量は各々約80，89，725kDaと推 測 さ れ た ．い ず れもin vitroでsctPAを活 性 化し 得た が，Elt.#2の 活性 化能 が最 も高 かっ た．
Thr.＃1，Elt.＃1とも，免 疫沈降法により残存したhPK活性は用量依存的に低下した．Elt．#2 に つ い て は 抗hPK抗 体 ， 抗 口2‑M抗 体 の い ず れ を 用 い た 場 合 も 残 存hPK活性 は消 失， ある いは 著 明 に 低 下 し た が ， 残 存sctPA活 性 化 能に つい ては ，抗 ロ2‑M抗体 の添 加に より 低下 を認 めた ものの，抗hPK抗体を用いた場合は殆ど変化しなかった，
3．卵胞液量と卵胞液総hPK活性との関連
個 別 保 存 さ れ た 卵 胞 液270検 体 を 用 い て 測 定 し た 総hPK活 性 は11.56土4.93nmol／ml／min
（m土S D)であ り， 活性 は卵 胞液 量と は相 関 しな かっ た． 自然 排卵 周期 の卵 胞液6検体 の総hPK 活性は9.29土3.18nmol／ml／min（m土SD)であった．
考察
本研 究で 分離 精製 され た3分 画は ，酵 素化 学的 ，免 疫学 的に は いず れもhPKの性質 を有する．
こ の う ちElt.＃1は その 推定 分子 量な どか らfree hPKであ ると ，ま たThr.＃1はhPKと 分子 量は 異 な る も の の 機 能 的 に は 同 一 で ，hPKのisomerであ ると 考え られ た． こ のisomerは，hPKとは 荷 電状 態が 異な る， 極端 に塩 基性 の 分子 であ り，hPKのtranscate formであると思わ れる．この isom erが存 在す る生 理的 意義 とし て， 卵胞 内のpH， 荷電 状態 な どが 変動 しても，常にsctPA活 性化能を一定の水準以上に維持できるという点が挙げられる．
Elt.＃2は ，強 カなproteinase inhibitorてあ るh口2‑MとhPKとの 複合 体である， この分画の sctPA活 性 化 能 は3分 画 で 最 も 強 カ で あ っ た が ， こ の 分 画 よ り 免 疫沈 降 法でhPKを除 去し ても 同 程 度 のsctPA活 性 化 能 を 認 め た こ と よ り ，hPKと は 異 な るtPA activating enzyme(以 下TA E）の 存 在が 示唆 され る， この 酵素 もま たh口2‑Mと複 合体 を形 成 して いる と考えられる，口2‐ Mと 結 合 し て も な お 活 性 を 示 す 酵 素 は こ れ ま で に 報 告 さ れ て い な い ． ヒ ト 卵 胞 内sctPA活 性 化を主導しているのは，このTAEであろう．
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卵胞液総hPK活性が卵胞液量と無関係であったことは，卵胞液中hPKは血漿由来であると いう見解に矛盾しない，
以上より，ヒト卵胞破裂に関与するproteinase cascadeの新しいモデルを作成した，即ち，卵 胞発育とともに血漿中よりhPKおよびそのisomer(以下hPKs），PLG，高分子kininogen（以下 HMWK)が 卵胞 内ヘ 移行 し，TAEととも に蓄 積す る.sctPAはLH surgeに伴い卵胞内ヘ分泌さ れると，速やかにTAE，hPKsにより2ctPAに変換され，PLGを活性化する．生じたplasminは直 接的に，あるいはmatrix metalloproteinasesを介し間接的に卵胞壁を脆弱化し，並行してhP KsはHMWKよりbrady kininを遊離して周囲の血管透過性を亢進させ，血漿成分のさらなる流 入により卵胞容量は増大し，卵胞破裂に至ると考察される．
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学位論文審査の要旨
学位論文題名
ヒト卵胞液における Plasma Kallikrein の分子動態と 卵胞内組織Plasminogen Activator(tPA) 活性イヒ機構
組織Plas minogen Activato r(tP A) ‑plas min ogen‑plas min系は，排卵に先立つ卵胞壁の脆弱 化 に 重 要 な 役 割 を 担 う ．tPAは ， 前 駆 体 の1本 鎖 型(sctPA)よ り2本鎖 型(2ctPA)への 変換 を 受 け 活 性 化 さ れ る が ， ヒ ト 卵 巣 顆 粒膜 細 胞 で 産 生 さ れ るtPAの 卵胞内 活性 化機 序は 未解 明 で ある ．本 研究で は， ヒト 卵胞 液を 材料にヒトPlasma Kallikrein (hPK)の分離精製を行い，
ヒトsctPA活性化能について検討した．
卵 胞 液 上 清 に6倍 量PBSを 加 え ，40％ 硫 安 塩 析 に て 析 出 し た 分 画 を 脱 塩 透 析 し た ． こ の 分 画 をDEAE‑cellulose(DE‑52)陰 イ オ ン 交 換 カ ラ ム(pH8．5） に 通し ，吸 着成 分を0〜0.2M NaCl連 続 濃 度 勾 配 に て 溶 出 し た とこ ろ ， カ ラ ム に 非 吸 着 のThr.#l， 吸 着 し0.05M，0.13M NaClに より 溶出さ れたElt. #1，Elt.#2の3つのhPK分画が分離された．精製の結果，Thr.#l， EJt.#l，Elt.#2各々より，specific activity 63.2，54.4，9.0 (nmol/min/mg protein)，収率2.69， 1.06，9.42（ ％ ） ， 精 製 倍 率341. 85，294.00，48.76（ 倍 ） の 最 終 精 製 品 が 得 ら れ た ． hPK活 性 の 測 定 に は ， 合 成MCA(4‑methylcoumaryl‑7‑amide)基 質 を 用 い た ． 検 体 を 基 質 とpH8.0，37℃で30分 間反 応さ せた 後， 反応停 止試 薬(pH4．3） を加えて反応を停止した．波 長3 70nmで 励 起 さ れ た 波 長460nmの 螢 光 強 度 を 測 定 し ， 遊 離 し た7‑amino‑4‑methyl‑
coumarin (AMC)濃 度 に 換 算 し ，1分 間 あ た り の 遊 離AMC濃 度 をhPK活 性 と し た ． 8種 類 のMCA基 質 を 用 い て3分 画 の 基 質 特 異 性 を ， ま た ，12種 類 の 蛋 白 分 解 酵 素 阻 害 剤 を 添 加 し て3分 画 の 活 性 に 対 す る 阻 害 効 果 を 比 較 し た 結 果 ，3分 画 の 基 質 特 異 性 に は ， p ep tide末 端のArg ‑X結 合を 特異 的に 切断す るこ とな ど血 漿由 来のhPKと共通の傾向が認め ら れ， いずれも活性はDFP（diisopropyfluorophosphate)，leupeptinに強く阻害されており，
serine proteinase群に属すると考えられた．ただしpolypeptide性阻害剤のElt.#2に対する作 用は弱かった．
