博 士 （ 水 産 科 学 ） 西 村 一 彦
学 位 論 文 題 名
脂肪酸螢光誘導体の高速液体クロマトグラフイー／
質量分析法に関する研究
学位論文内容の要旨
脂質はタ ンパク質 ，炭水化 物ととも に日常の 食生活においてなくてはならない栄養 素であり ，また， 細胞膜を はじめと する生体 の重要な 構成成分でもある．脂質を構成 する脂肪 酸には炭 素数と二 重結合数 の異なる 多数の同 族体が存在し，それぞれ生体内 での作用 の異なる ことが知 られている．生体内で合成されないりノール酸やa―リノレ ン酸など の必須脂 肪酸につ いては， その測定 法，食品 中での含量，生体内での働き，
立体配置 等に関し て従来か ら数多く の研究が 行われて いる．近年は抗ガン作用や痩身 効果を有 する共役 リノール 酸などが 新たに関 心を集め ており，天然物中での分布や新 たな生理 機能及び 分析法に ついて活 発に研究 が行われ ている．また，脂肪酸（遊離脂 肪酸）は 水産物， 食用油， 乳製品等 の品質評 価因子の ーっであり，近年，バターから の異臭に より製品 が回収さ れた事例 もあるこ とから， 風味や品質にも影響を与える製 品中の脂 肪酸を正 確に定量 し，その 組成の詳 細を明ら かにすることは食品衛生上から も必要で あると考 えられる ．このよ うに，脂 肪酸の精 密分析は脂質研究において必要 不可欠で あり，古 くから重 要な研究 課題にな っている ．
脂肪酸の 分析には 通常ガスクロマトグラフィー(GLC)が用いられるが，最近では操作 の簡単さ から高速 液体クロ マトグラ フィー(HPLC)で 分析する方法，特に脂肪酸を誘導 体化して 高感度で 分析する 方法がよ く使用さ れている ．これまで種々の誘導体試薬が 使われて いるが， その中で も，9―ア ンスリル ジアゾメ タン(ADAM)を用い て脂肪酸 を 9―アンス リルメチ ルエステ ル誘導体 （通称ADAM誘 導体，Fig.1）に変換し，これを逆 ―195―
相HPLC で分析する方法は操作が簡単で高感度であることから生物試料の分析にしば しば用いられている．しかし，HPLC カラムはキャピラリーGLC カラムに比べて一般に 分解能が低いため，植物油のように比較的単純な脂肪酸組成を示す試料の分析では良 好な分離が得られるものの，魚油のように構成脂肪酸が複雑な場合は16:1 と14:0 な ど ECN 値 (equivalent carbon number: ア シル 基の 総炭素数―2x 二重結合数）の
等 し い 成 分 同 士 が 重な り ， 同 定 が 困 難 と な る ． 丶丶
また，標準品の入手が難しいために，これを使 ′）
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用して同定することが困難な脂肪酸もしばしば ． 観 察 さ れ る ， さ ら に， 過 去 に 報 告 さ れ た 飽 和 及
び不飽和脂肪酸ADAM誘導体の逆相HPLCでの溶 Fig．1Strvctur。of fatty acid 9‑anthry｜m●thy｜。stors 出順番を比較すると，同じカラムと同系移動相
を 用 い て 分 析 し た 場 合 で も ， 異 な る 溶 出 順 を 示 す 例 が み ら れ る ． 脂 肪 酸 の 精 密 な 組 成 分 析 を 行 う に あ た っ て は ， 逆 相HPLCで の 個 々 の 脂 肪 酸 の 分 離 挙 動 を 明 ら か に す る と と も に ， 各 成 分 を 同 定 す る た め に 分 子 量 情 報 の 得 ら れ るHPLC/質 量 分 析(MS)の 使 用 が 有 効 で あ る と 考 え ら れ る が ， こ れ ら に っ い て は ほ と ん ど 検 討 さ れ て い な い ． 本 研 究 で は ， 脂 肪 酸ADAM誘 導 体 の 逆 相 HPLCに よ る 精 密 分 析 法 の 確 立 を 目 的 と し ， 以 下 の 項 目 に つ い て 検 討 し た ． (1)エ イ コ サ ペ ン タ エ ン 酸(EPA)や ド コ サ ヘ キ サ エ ン 酸 (DHA)な ど 高 度 不 飽 和 脂 肪 酸 を 含 む 種 々 の 脂 肪 酸ADAM誘 導 体 の 逆 相HPLCで の 分 離 挙 動 ，(2) HPLC/MSに よ る 魚 油 脂 肪 酸 の 精 密 分 析 ，(3)食 品 中 に 少 量 存 在 す る 生 理 活 性 脂 肪 酸 （ 共 役 リ ノ ー ル 酸 ） の 分 析 ，(4)食 品 の 品 質 評 価 因 子 の ー っ で あ る 遊 離 脂 肪 酸 の 組成分析．
(1)逆 相HPLCを 用 い て 飽 和 及 び 不 飽 和 脂 肪 酸ADAM誘 導 体 の 分 離 挙 動 を 詳 細 に 検 討 し た 結 果 ， 移 動 相 を メ タ ノ ー ル か ら ア セ ト ニ ト リ ル ヘ 変 化 さ せ た と き ， 保 持 時 間 は 直 線 で は な く ，U字 型 の 曲 線 を 描 く こ と を 見 出 し た ． こ の 時 ， 不 飽 和 度 が 低 い 脂 肪 酸 ほ ど 保 持 時 間 の 増 加 が 大 き く ， ECN値 が 類 似 し て 不 飽 和 度 に 差 の あ る 14:1と20:5の よ う
な脂 肪酸 聞で 溶出 順が 逆転した．このような現象はADAM 誘導体以外の誘導体や遊離脂 肪酸 でも 認め られ たこ とから，誘導体部分よりも脂肪酸部分が溶出挙動を決定してい るこ とが 明ら かに なっ た．したがって，逆相HPLC 分析では，脂肪酸ばかりでなく，ト リグ リセ リド やり ン脂 質でも同様の逆転現象が起こるものと推測された．移動相の水 含量 を増 加さ せた 場合 ，鎖長の長い脂肪酸ADAM 誘導体の保持時間増加量が大きく，そ の結 果， 有機 溶媒 100% の移動相で接近して溶出し，鎖長に差のある脂肪酸聞で溶出順 が逆転した．このことから魚油などの複雑な脂肪酸混合物を正確に分析するためには，
移 動 相 の 水 含 量 の 調 整 が 極 め て 重 要 で あ る こ と が 明 ら か に な っ た ． (2) 脂肪 酸ADAM 誘 導体 をエレ クト ロス プレ ーイ オン 化法(ESI/MS) で分析すると，正イ オンモードで［M 十Na ］゛のべースピークと誘導体のエステル部分で開裂した[M 一RCOO] → (m/z 191 相 対 強 度 15y0) の 両 イ オン が検 出さ れた ．これ らの イオ ンを 用い る選 択イ オン 検出 では ，O ． Ing の誘 導体 混合 物を HPLC カラ ムに注入した場合でもS/N 比5 以上 で個々の成分を検出することが可能であった．一方，大気圧化学イオン化法(APCI/MS) では，正イオンモードで［M ―RCOO] ゛(m/z 191) が，負イオンモードでは[RCOO] −がそれ ぞれ べー スピ ーク とし て検 出さ れた ．こ れら の結 果から ESI とAPCI を 用い るHPLC/MS 法 は ， 脂 肪 酸 ADAM 誘 導 体 の 同 定 に 極 め て 有 効 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た ． HPLC/ESI −MS 法を ミン ククジラのべーコンから調製した脂肪酸混合物の組成分析に適 用し た結 果， 得ら れた 各脂肪酸のピーク面積％は螢光検出HPLC で測定した結果と良く 一致 した こと から ，HPLC/ESI ―MS 法は成分の同定だけでなく，組成分析法としても有 用であることが明らかとなった，
(3) これ らの 結果 をも とに食 用油 脂中 に少 量含 まれ ，生理活性を有する共役リノール
酸(CLA) の分 析法 を検 討した ．CLA は 異性 化す るこ となく ADAM 試薬 と反 応し ，誘 導体
に変換されることを明らかにした．水ノメタノールのグラジェント溶離法を適用するこ
とに より ，乳 及び 乳製 品に 含ま れて いる 主用 な脂 肪酸16 成分からCLA を明りょうに分
離することに成功した．その結果，CLA は牛乳中に総脂肪酸中O ．9 ％(2. 2mg/g fat) ，
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バターに1．4％(4. Omg/g fat)，チーズ中に2．5Y0 (5. 7mg/g fat)存在することを一度 の分 析 で明らか にするこ とが可能 になった ，この技 術は，魚油 に含まれ るCLAの分析 にも有効であることが認められた．
(4)食品衛 生の観点 から，水 産物，食 用油，乳 製品等の 品質評価因 子のーっ である 遊離脂肪 酸を簡単に 抽出し， 個々の遊 離脂肪酸 成分を個 別に定量する高感度分析を検 討した． 少量のサン プルから 固相抽出 カートリ ッジを用 い遊離脂肪酸を簡便に抽出す る方法を確立した，水ノメタノールのグラジェント溶離法で炭素数4〜 20，二重結合数 0‑‑‑3までの16種の脂肪 酸を互い に明りょ うに分離 定量でき るHPLC法を確立 した．本 分析法で 得られたを 遊離脂肪 酸量から 算出した 酸価は従 来の滴定法で求めた値と良く 一致して ことから， 本法は簡 便で，従 来法より も詳細な 分析が可能であり，水産物を 含む食品一般に広く適用できると考えられる，
以 上， 本 研 究で はHPLCとMSを 用い て脂肪 酸ADAM誘導体 の分析法 を確立し， 水産物 の脂 肪 酸組成の 精密分析 ，食品に 含まれるCLAや遊離脂 肪酸の高感 度分別定 量を可能 にした．本法は，種々の生体試料中，の脂肪酸の組成分析に適用できるものであり，今 後水産を含む多くの分野での利用が期待される．
学 位 論 文 審 査 の 要 旨 主査 教授 板橋 豊 副査 教授 宮下和夫 副査 助教授 安藤靖浩 副査 鈴木敏之
（東北区水産研究所主任研究員）
学 位 論 文 題 名
脂 肪 酸 螢 光 誘 導 体 の 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ イ ー ／ 質 量 分 析 法 に 関 す る 研 究
脂 肪 酸 は 脂 質 を 構 成 す る 基本 成分 であ り， その 精確 な分 析は 生 物の 脂質 を研 究 するあらゆる分野で必要とされる．通常，脂肪酸の組成分析にはガスクロマトグラフィ ー(GLC)が 用 い ら れ る が ， 最 近 で は 操 作 性 に 優 れ た 高 速液 体ク ロ マト グラ フィ ー (HPLC)も 広く 使わ れて いる ．一 般に ， 脂肪 酸は 誘導 体に変換 した後分析されるが，
種々 の誘 導体 の中 で， カル ボキ シル 基 を9ーア ンス リル メチ ルエ ス テル （通 称ADAM 誘 導 体 ） に 変 換 し ， こ れ を 螢光 検出 逆相HPLCで分 析す る方 法が ， 誘導 体の 調製 が 容易で高感度であることから，生物試料の分析によく用いられている．しかしながら，
魚 油 の よ う に 構 成 脂 肪 酸 の 数が 多く 組成 が複 雑な 場合 ，HPLC法 で は分 離の 困難 な 成分 や同 定で きな い成 分が しば しば 観 察さ れた り， 個々の成 分の溶出順が分析者に よって 異なっていたり，分析法としての不完全さが認められる ．本研究では，螢光検 出 逆 相HPLC法 にHPLC/MS（ 質 量 分 析 法 ） を 併 用 し て 脂 肪 酸ADAM誘 導 体 の 精 密 分析 法を 確立 し， その 水産 物や 食品 へ の応 用を 検討 したもの である．得られた成果 は以下のように要約される．
(1) ADAM誘 導 体 の 逆 相HPLCで の 分 離 挙 動 を 詳 細 に 検討 した 結果 ，移 動相 をメ タノ ー ルか らア セト ニ トリ ルヘ変化させたとき，及び少量の水を含む移動相を用 いたと き ， 保 持 時 間 の 推 移 は従 来明 らか にさ れて いる 直線 型で はな くU字 型の 曲線 を描 き ，不 飽和 度の 小 さい 脂肪酸や長鎖脂肪酸ほどその傾きの大きいことを見出 した．
こ のこ とか ら， 幾 っか の脂肪酸間で溶出順の逆転することが明らかになった ．溶出 順 の 逆 転 現 象 はADAM誘 導 体 以 外 の 誘 導 体 や 遊 離 脂 肪 酸 で も 認 め ら れ た こ と か ら ，ADAM誘 導 体 の 溶 出 挙 動 を 決 定 す る の はADAM部 分 で は な く ， 脂 肪 酸 部 分 で ある こと が結 諭 され た．これらの結果から，魚油など複雑な組成を示す脂 肪酸を HPLCで 精確 に分 析 する ため には ，た とえ 少量 の水 であ って も， 移動 相組 成 を正し く 調 整 す る こ と が 極 め て 重 要 で あ る こ と が 明 ら か に な っ た ． (2) ADAM誘 導 体 のMSを 詳細 に検 討し た結 果， エレ クト ロス プレ ーイ オ ン化 法(ESI)
で，［M十Na］゛とエステル部分が開裂した[M−RCOO]゛の両イオンを検出することに 成 功 し た ． 選 択 イ オン 検出 では ，O.lngの 誘導 体混 合物 をHPLCカ ラ ムに 注入 した 場 合 で もS/N比5以 上 で 個 々 の 成 分 を 検 出 す る こと が可 能で あっ た ，一 方， 大気 圧 化 学 イ オ ン 化 法(APCI/MS)で は ， ［M―RCOO]゛ と[RCOOl‑あ ィ オ ン の 検 出 さ れ る こ と を 見 出 し た ． こ れ ら の 結 果 か ら ，ESIとAPCIを 用い るHPLC/MS法は ，脂 肪 酸ADAM誘 導 体 の 同 定 に 極 め て 有 効 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た ， (3)上 述 し たADAM誘 導 体 の 逆 相HPLC法 とHPLC/MS法 を ミ ン ク ク ジ ラ の べ ー コ ン から 調製 した 脂肪 酸 混合 物の 組成 分析 に適 用し た． その 結果 ，移 動相 組成などの 分析条件 を最適化することにより，ドコサヘキサエン酸やドコサペンタエン酸などの 高 度 不 飽 和 酸 を 含 む 種 々 の 脂 肪 酸 が ， 螢 光 検 出HPLCで もHPLC/MSで も 比 較 的 短 時 間 で 明 瞭 に 分離 でき るこ とが 明 らか にな った ．ま た，HPLC/MS法 で得 られ た 各 脂 肪 酸 の ピ ー ク 面 積 ％ は ， 螢 光 検 出HPLCで得 られ た値 と互 い に良 く一 致し た こ と か ら ，HPLC/MS法 は水 産油 脂脂 肪酸 の同 定だ けで なく ，組 成 分析 法と して も有用で あることが認められた．
(4)本研 究で 確立 した 方法 は， 水産 脂質 ばか りで なく，抗腫瘍活性や抗肥満効果など 種 々 の 生 理 活 性 を 有 す る 共 役 脂 肪 酸(CLA)の 分 析 や 乳 ， 乳 製 品 及 ぴ 油 脂 食 品 に存 在す る遊 離脂 肪酸の定性・定 量分析にも適用できることを示した，前者は，少 量 の 試 料 （lg)か ら 抽出 した 脂質 をケ ン化 して 脂肪 酸を 調製 し， こ れをADAM誘導 体 に 変 換 し て 分 析 する もの で， 食品 中 に微 量存 在す るCLAの 簡易 ス クリ ーニ ング 法と して 有用 であ ることが明らか にされた．後者の方法は，少量の試料から遊離脂 肪 酸 を 固 相 抽 出 し た 後 ，ADAM誘 導 体 に 変 換 し てHPLC分 析 す る も の で あ る ． 遊 離脂 肪酸 は食 品の 品 質評 価因 子の ーっ とな って いる こと から ，簡 便な 分析法の開 発 は 食 品 関 連 分 野 に お い て 有 益 で あ る ， 本 研 究に おい て確 立し た 方法 は高 感度 で操 作が 簡単 であ る こと から ，食 品中 の遊 離脂 肪酸 の定 性・ 定量 分析 に広く適用 できると 考えられる．
以 上 の 成 果 は ， 高 度 不 飽 和 脂 肪 酸 を 含 む 種 々 の 脂 肪 酸 のADAM誘 導 体 の 逆 相 HPLCで の 分 離 挙 動 を 明 ら かに した もの であ り， ま たHPLC/MS法 を併 用し て水 産 物 の 脂 肪 酸 組 成 分 析 法 と 食 品 に 含 ま れ る 共 役 脂 肪 酸 や 遊離 脂肪 酸の 高感 度分 別 定 量 法を 確立 した もの であ り，審査員一同は本研究が博士（水産科学 ）の学位を授与 さ れる 資格 のあ るも のと 判定 した 。
