博 士 （ 水 産 科 学 ） 清 水 茂 雅
学位論文題名
培養併用螢光彪sitrtt ハイブリダイゼーション法を用いた 食中毒細菌の高精度定量検出に関する研究
学位論文内容の要旨
食 品の微 生物検査 は，安全 な製品 を製造・ 販売す る上で欠かせない過程である。現在，この検査 は 培養法が 主流で あるが， これは 多大な労 カを要 する過程である。また最終結果を得るまでに長い 時 間を要す るため ，食品が 摂食さ れた後に 結果が 判明することも少なくない。したがって，消費者 へ の食品危 害リス クを低減 するた めには， 迅速か つ高精度な食品微生物検査法が必須である。そこ で本研究では，公定法に採用されている培養法と特異検出に優れたFluorescence in situ hybridization (FISH)法 を組 み 合 わせ た 培 養 併用FISH (FISHFC)法 を用 い た 食中 毒 細 菌 の迅 速 定 量検 出 法 の確 立を試みた。
第1章で は，損 傷したC． perfr ingensを高感度検出するための培地，回復剤および培養条件を検 討 した。加 熱処理(54゜C）し たC．perfringensの 検出菌数 を種々 の培地を 用いて調ぺた結果，TSC 培 地で検出 菌数が 多く，加 熱損傷 菌を含め た検出 のできる培地であることが確認できた。次に加熱 損 傷C． perfringensのさ らなる回復を目的に，回復効果のある物質を探索したところ，他の細菌と 同 様 に ピル ピ ン 酸ナ ト リ ウム(Pyr)の 添加によ って最 も回復効 果が認め られ， その最適 添加濃 度 は0.3％ で あった 。さらに 回復に適 した培 養条件が ，発育 至適温度 の43‑46aCより低い370Cおよび pH7‑8であることも明らかとなった。
第2章で は，第1節でC． perfr ingensでのFISHFC法の最適反応条件の検討，第2節では汚染食品 モ デルにおけるFISHFC法によるc．perfringensの定量検査法を確立した。まず，C．perfringensでの FISHFC最 適反 応 条 件を 検 討 し た結 果 ，固定 は100％ エタノ ールに一 時的に 曝し(Omin)， ハイブリ ダ イゼーシ ョンは46°C，30分間が 適当であ った。 供試菌58菌株に対するC・ perfringens検出プ口 ー ブCLP‑180の特異性 を評価 したところ，C，perfringensのみに陽性シグナルが検出され，CLP―180 プ 口ーブが 極めて 特異性の 高いプ 口ーブで あるこ とが明らかとなった。0.3％Pyr‑TSC培地を用いて
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加熱損傷C． perfringensを培養し，最適なマイクロコ口二ー形成時間を調ベ，7時間培養が適当と判 断レた。2種類の食品へ加熱損傷C． perfringensを人為的に接種し，FISHFC法と従来法（培養法）
および損傷回復培養法での生菌数測定値を比較したところ，これらの問には有意差が認められなか ったことから，本章で開発したFISHFC法が培養法と同等以上の検出精度で生菌数を測定できる方 法であることが証明された。
第3章では，第1節でSalmonella検出のためのFISHFC反応条件の検討，第2節で汚染食品モデ ルを用いて検出精度評価を行った。まず，Salmonella検出プ口ーブとして23S rRNA塩基配列を標 的としたSAL343を新たに設計し，その反応条件と性能を評価した。その結果，SalmonellaのFISHFC 法の最適条件は検出陽性率および螢光染色されたコロニーと背景とのS/N比から固定30分間，ハ イプリダイゼーション46°C，30分間が最適と判断した。また，供試菌34菌株に対するSAL343プ 口ーブは ，Salmonellaのみに反応するプ口ーブであった。次に加熱や凍結ストレスを受けた Salmonellaを検出す るためのFISHFC法に適した培地を検討し，MLCB培地が回復効率に優れ，
FISHFC法に適していることが明らかとなった。また，Salmonellaのマイクロコ口二ー形成時間は，
7時間培養が最適であった。河川水および食品7種にSalmonella3株(S. Enteritidis，STyphimurium，
＆ Infantis)の混合菌液を接種し，FISHFC法の検出精度を調べたところ，一般的にSalmonella検出 に用いる平板法との間に有意な差はなく，同等の検出結果が得られることが明らかとなった。
第4章では，食品の汚染指標菌として最も一般的に検査されるE coliのFISHFC法による定量検 出法を確立した。まずE coli検出プ口ーブとして16S rRNA塩基配列内からEC0636プローブを新 規に設計し，その反応条件と特異性を評価した。その結果，固定30分間，ハイブリダイゼーショ ン46°C，60分間が最適なFISHFC反応条件であり，供試34菌株に対する検出特異性評価から，
EC0636プ口ーブがE．coliを特異的に検出できるプ口ープであることが明らかとなった。しかし，
EC0636プ口ーブは，Ecoliと極めて近縁である赤痢菌(Shigella属）も検出するプローブであった。
次にFISHFC法に用いる培地を検討したところ，SEL培地に胆汁酸塩を0.056％添加して選択性を 持たせて培養するのが良いことを見出し，コ口二ー形成時間は，7時間が適切であった。牛挽肉に E coliを接種し，FISHFC法の検出精度を調べたところ，公定法に準拠した平板法と同等の結果の 得られる方法であることが証明された。
第5章では，SalmonellaおよびEcoliの検出を同時に行うため，前章までのFISHFC法を各々最 適化し，Multiplex‑FISHFC法の確立を試みた。まず，両菌の同時検出を可能とするために，E．coli 用に設計した0.056％胆汁酸塩加SEL培地におけるSahnonellaのコ口二ー形成能について調べた。
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その結果，Salmonellaにおいても7時間以上の培養でFISHFC法での検出可能なコロニーサイズと なったことから，SalmonellaおよびEcoliでのMultiplex‑FISHFC法における培養時間は7時間とし た。また，このMultiplex‑FISHFC法の反応条件は第3章および第4章の結果から，固定30分問，
ハ イプ リ ダイ ゼ ー ショ ン46°C，60分 間 が 最適 と 判断 し た 。最 後 にSalmoneHaとEcoliの Multiplex―FISHFC法 で の 検 出 精 度 を 確 か め る た めに 食 品 サン プ ルに 両 菌 を接 種 し，
Multiplex‑FISHFC法と培養法での生菌数測定値の比較を行った。その結果，SAL343およびEC0636 プ口ーブによるFISHFCでの計数値は，SalmonellaまたはE．coli検出用培地での生菌数と同等の検 出結果が得られた。
実際の食品微生物検査で行われている培養法のみに依存した方法では，確かな最終結果を得るに は，様々な確定試験を必要とするため，少なくとも2‑3日間の時間を要する。しかし，本研究で開 発したFISHFC法によればぃずれの菌種においても9時間以内で検出可能となった。したがって，
本研究で確立したFISHFC法は，培養法に準じた生菌のみをモ二夕リングできる迅速定量技術を提 供し，自主衛生管理の場において食品の微生物汚染リスクを高精度に把握することで食品の安全性 を確保することが可能となる。
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学位論文審査の要旨 主査 教 授 川合 祐史 副査 教 授 澤辺 智雄 副査 准教授 山崎浩司
学 位 論 文 題 名
培養併用螢光励Sitzt ハイブリダイゼーション法を用いた 食中毒細菌の高精度定量検出に関する研究
食 品の 微生 物検 査は 、 安全な製品を製造、販売する上で不可欠であり、消費者 への食品危害リ スク を低 減す るた めに 、 より迅速かつ高精度な手法が要求されている。そこで本 研究では、公定 法に 採用 され てい る培 養 法と 特異 検出 に優 れた 螢光in situハイブリダイゼーシ ョン(FISH)法を 組 み 合 わ せ た培 養併 用FISH (FISHFC)法 を用 いて 食中 毒細 菌の 損傷 菌を も高 精度 に検 出可 能 な 迅 速 定 量 検 出 法 の 確 立 を 試 み て い る 。 得 ら れ た 成 果 は 以 下 の よ う に 要 約 さ れ る 。 1．ウェルシ ュ菌の高精度定量検出法の確立
ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)の特異検出プローブとし て16S rRNA塩基配列を標的と したCLP―180を設 計し 、FISHFC条件を最適化するとともに、損傷回復検出培地と して0．3％ピル ビン 酸ナ トリ ウム 添加TSC培 地を 開発 し、 加熱 損傷C．peサf門gP門sを7時間培養 でマイクロコロ ニーの検出が可能であった（全工程9時間以内）。また、このときの 回復培養条件は、発育至適温 度の43‐46℃より低い37℃およびpH7‐8であることも明らかにした。
2種 類の 食品 へ加 熱損 傷C．pPサf門ぴ門sを人為的に接種し、FISHFC法と従来法 （培養法）およ び損 傷回 復培 養法 での 生 菌数測定値を比較したところ、これらの間には有意差が 認められなかっ たこ とか ら、 本研 究で 開 発し たFISHFC法が 培養 法と 同等 以上 の検 出精 度で 生菌 数を測定できる ことを実証した。
2．サルモネ ラ属細菌の高精度定量検出
サルモネラ（駈加？0門P〃ロ）属細菌 の特異検出プローブとして23SrRNA塩基配列を標的とした SAL343を 設 計し 、FlSHFC条件 を最 適化 し、 勵加 〇門Pぬの 損傷 菌回 復検 出用 培地 とし てMLCB培 地を 用い て7時 間培 養に より 螢光 検出 が可 能と なっ た。河川水およぴ食品7種に勵fm〇〃ビぬ3株
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(S. Enteritidis，STyphimurium，SInfantis)の混合菌液を接種し、FISHFC法の検出精度を調べたと こ ろ、 一般 的にSalmonella検出に用いる平板法との間に有意な差はなく、培養法と 同等の検出精 度で検出可能 であることを明らかにした。
3.大腸菌の高 精度定量検出法の確立
食品の汚染 指標菌として最も一般的に検査される大腸菌(Escherichia coli)の検出プローブとし て16S rRNA塩 基 配列 内か らEC0636プロ ーブ を新 規に 設計 し、FISHFC条件 を最 適化 し、0.056％ 胆 汁酸 塩添 加SEL培地 で選 択性 を持 たせ て7時 間培 養す るこ とに より 、マ イク ロコ ロニーの螢光 検 出が 可能 とな った 。EC0636プローブは、E．coliと極 めて近縁である赤痢菌(Shigella属）も検 出 する プロ ーブ であ った が 、有害菌の誤検出は実用上容認できると判断した。牛挽 肉にE coliを 接 種し 、FISHFC法の 検出 精 度を 調べ たと ころ 、公 定法 に準 拠し た平 板法 と同 等の 検出精度が得 られることを 実証した。
4.サルモネラ と大腸菌の同時高精度定量検出法の確立
E coli用 に 設 計 し た0.056％ 胆 汁 酸 塩 添 加SEL培 地 に お い てSalmonellaとEcoliの Multiplex‑FISHFC法 を最 適化 し、FISHFCに よるSalmonellaとEcoliの同 時検 出法 を構 築し た。
食品試料に而 菌を接種し、Multiplex‑FISHFC法と培養法でのSalmonellaとE．ピ〇ぬの生菌数測定値 の 比較 を行 った とこ ろ，SAL343およ ぴEC0636プロ ーブ によ るFISHFCでの 計数 値は 、Salmonella ま た はE， coli検 出 用 培 地 で の 生 菌 数 と 同 等 の 検 出 精 度 が 得 ら れ る こ と を 確 認 し た 。 実際 の食 品微 生物 検査 で 行われている培養法のみに依存した方法では、確かな最 終結果を得る に は、 各種 確定 試験 を必 要 とす るた め、 少な くと も2‑3日問の時間を要する。しか し、本研究の FISHFC法 に よ れ ばぃ ずれ の菌 種に おい ても9時間 以内 で、 培養 法に 準じ た生 菌の みの モニ タリ ン グ（ 迅速 定量 ）が 可能 と なる。本研究の成果は、自主衛生管理の場において食品 の微生物汚染 リ スク を迅 速か つ高 精度 に 把握することを可能とする技術を提供し、水産食品も含 めた食品安全 性 向上 技術 の発 展に 大き く 寄与するものとして高く評価できる。よって審査員一同 は申請者が博 士（水産科学 ）の学位を授与される資格のあるものと判定した。
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