チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ 阻 害 剤 ゲ フ ィ チ ニ ブ の ABCG2 阻 害 作 用 と 癌 化 学 療 法 及 び 光 線 力 学 診 断 へ の 応 用
The Inhibition Effect of Gefitinib, EGFR Tyrosin Kinase Inhibitor, on ABCG2 and its Application to Cancer Chemotherapy and Photodynamic Diagnosis
平 成 ２ ３ 年 度 入 学
井 上 裕 貴 （Inoue, Yutaka）
指 導 教 員
吉 田 久 博
目 次
序 論
実 験 の 部
第 1 章 ゲ フ ィ チ ニ ブ に よ る CPT-11 の 抗 腫 瘍 効 果 に 及 ぼ す 影 響
第 1 節 Real -Time PCR に よ る ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 発 現 解 析
1 - 1 ) 使 用 細 胞 1 - 2 ) 試 薬
1 - 3 ) 細 胞 培 養 法
1 - 4 ) 全 R N A の 調 製 法
1 - 5 ) R e v e r s e Tr a n s c r i p t i o n p o l ym e r a s e C h a i n R e a c t i o n ( RT- P C R ) 1 - 6 ) R e a l - Ti m e P C R
第 2 節 ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ 法 に よ る ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 発 現 解 析
2 - 1 ) 使 用 細 胞 2 - 2 ) 試 薬
2 - 3 ) 細 胞 培 養 法 2 - 4 ) 蛋 白 質 の 抽 出 2 - 5 ) 蛋 白 質 の 定 量
2 - 6 ) S D S -ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動
2 - 7 ) ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 に よ る A B C ト ラ ン ス ポ ー タ ー 発 現 解 析
2 - 8 ) ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 に よ る E G F R 発 現 解 析
1
11 11 12 12 13 13
13 14 14 14 15 15
15 16
第 3 節 gefitinib 併 用 投 与 時 の 各 薬 物 臓 器 内 濃 度 変 化
3 - 1 ) 使 用 細 胞 3 - 2 ) 試 薬
3 - 3 ) 細 胞 培 養 法 3 - 4 ) 細 胞 数 測 定 法
3 - 5 ) 細 胞 中 薬 剤 蓄 積 濃 度 測 定 法
第 4 節 Flp-In-293 細 胞 に お け る 基 質 薬 剤 の 薬 剤 感 受 性 測 定
4 - 1 ) 使 用 細 胞 4 - 2 ) 試 薬
4 - 3 ) 細 胞 培 養 法 4 - 4 ) 細 胞 数 測 定 法 4 - 5 ) 薬 剤 感 受 性 試 験
第 5 節 ヌ ー ド マ ウ ス に お け る ゲ フ ィ チ ニ ブ 併 用 投 与 に よ る 各 薬 物 血 中 濃 度 へ の 影 響
5 - 1 ) 動 物 5 - 2 ) 使 用 細 胞 5 - 3 ) 細 胞 培 養 法 5 - 4 ) 腫 瘍 移 植 法 5 - 5 ) 試 薬
5 - 6 ) 薬 剤 及 び 溶 解 方 法
5 - 6 - 1 ) イ リ ノ テ カ ン 塩 酸 塩 5 - 6 - 2 ) ゲ フ ィ チ ニ ブ
5 - 7 ) 投 与 経 路 及 び 投 与 方 法 5 - 8 ) グ ル ー プ 定 義
5 - 9 ) サ ン プ ル 採 取 法
17 17 17 17 17
18 18 18 19 19
20 20 20 20 20 20 20 21 21 22 23
5 - 1 0 ) 血 中 濃 度 測 定 5 - 11 ) 倫 理 規 定
第 6 節 ヌ ー ド マ ウ ス に お け る ゲ フ ィ チ ニ ブ 併 用 投 与 に よ る 各 薬 物 腫 瘍 内 濃 度 及 び 抗 腫 瘍 効 果 へ の 影 響
6 - 1 ) 動 物 6 - 2 ) 使 用 細 胞 6 - 3 ) 細 胞 培 養 法 6 - 4 ) 腫 瘍 移 植 法 6 - 5 ) 試 薬
6 - 6 ) 薬 剤 及 び 溶 解 方 法 6 - 7 ) 投 与 経 路 及 び 投 与 方 法 6 - 8 ) グ ル ー プ 定 義
6 - 9 ) サ ン プ ル 採 取 法 6 - 1 0 ) 腫 瘍 内 濃 度 測 定 6 - 11 ) 腫 瘍 体 積 測 定 6 - 1 2 ) 倫 理 規 定
第 2 章 光 線 力 学 診 断 へ の ABCG2 阻 害 剤 ゲ フ ィ チ ニ ブ の 応 用
第 1 節 脳 腫 瘍 細 胞 株 U87MG 細 胞 に お け る ABCG2 の 発 現 解 析
1 - 1 ) 使 用 細 胞 1 - 2 ) 試 薬
1 - 3 ) 細 胞 培 養 法
1 - 4 ) 全 R N A の 調 製 法
1 - 5 ) R e v e r s e Tr a n s c r i p t i o n p o l ym e r a s e C h a i n R e a c t i o n ( RT- P C R ) 1 - 6 ) R e a l - Ti m e P C R
23 25
25 25 25 25 26 26 26 26 27 27 27 27
28 28 28 29 29 29
1 - 7 ) 蛋 白 質 の 抽 出 1 - 8 ) 蛋 白 質 の 定 量
1 - 9 ) S D S -ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動
1 - 1 0 ) ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 に よ る A B C G 2 発 現 解 析
第 2 節 ゲ フ ィ チ ニ ブ 併 用 に よ る 細 胞 内 蛍 光 強 度 へ の 影 響
2 - 1 ) 使 用 細 胞 2 - 2 ) 試 薬
2 - 3 ) 細 胞 培 養 法 2 - 4 ) 細 胞 数 測 定 法
2 - 5 ) 細 胞 中 薬 剤 蓄 積 濃 度 測 定 法
第 3 節 ゲ フ ィ チ ニ ブ 併 用 に よ る 細 胞 内 プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ 濃 度 へ の 影 響
3 - 1 ) 使 用 細 胞 3 - 2 ) 試 薬
3 - 3 ) 細 胞 培 養 法 3 - 4 ) 細 胞 数 測 定 法
3 - 5 ) 細 胞 中 プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ 濃 度
3 - 6 ) プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ の 培 地 中 へ の 排 出 3 - 7 ) H P LC 条 件 【 プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ 】
第 4 節 ゲ フ ィ チ ニ ブ 併 用 に よ る 腫 瘍 内 プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ 濃 度 へ の 影 響
4 - 1 ) 動 物 4 - 2 ) 使 用 細 胞 4 - 3 ) 細 胞 培 養 法 4 - 4 ) 細 胞 数 測 定 法
30 30 30 30
31 31 31 31 32
32 32 32 33 33 33 33
34 34 34 35
4 - 5 ) 腫 瘍 移 植 法 4 - 6 ) 試 薬
4 - 7 ) 薬 剤 及 び 溶 解 方 法
4 - 7 - 1 ) ア ミ ノ レ ブ リ ン 酸 塩 酸 塩 （A L A） 4 - 7 - 2 ) ゲ フ ィ チ ニ ブ
4 - 8 ) 投 与 経 路 及 び 投 与 方 法 4 - 9 ) グ ル ー プ 定 義
4 - 1 0 ) サ ン プ ル 採 取 法 4 - 11 ) 腫 瘍 濃 度 測 定 4 - 1 2 ) 倫 理 規 定
第 5 節 ゲ フ ィ チ ニ ブ に よ る ALA を 用 い た 光 線 力 学 治 療 へ の 影 響
5 - 1 ) 使 用 細 胞 5 - 2 ) 試 薬
5 - 3 ) 細 胞 培 養 法 5 - 4 ) 細 胞 数 測 定 法 5 - 5 ) 薬 剤 感 受 性 試 験
結 果 ・ 考 察 の 部
第 1 章 ゲ フ ィ チ ニ ブ に よ る CPT-11 の 抗 腫 瘍 効 果 に 及 ぼ す 影 響
第 １ 節 R e a l - Ti m e P C R に よ る A B C ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 発 現 解 析
第 ２ 節 ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ 法 に よ る A B C ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 発 現 解 析
第 ３ 節 フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー に よ る 細 胞 内 蛍 光 強 度 測 定 第 ４ 節 F l p - In - 2 9 3 細 胞 に お け る 基 質 薬 剤 の 薬 剤 感 受 性 測 定
35 35 35 35 35 36 36 37 37 37
37 37 38 38 38
39
39 40 41
第 ５ 節 ヌ ー ド マ ウ ス に お け る ゲ フ ィ チ ニ ブ 併 用 投 与 に よ る 各 薬 物 血 中 濃 度 へ の 影 響
第 ６ 節 ヌ ー ド マ ウ ス に お け る ゲ フ ィ チ ニ ブ 併 用 投 与 に よ る 各 薬 物 腫 瘍 内 濃 度 及 び 抗 腫 瘍 効 果 へ の 影 響
第 2 章 光 線 力 学 診 断 へ の ABCG2 阻 害 剤 ゲ フ ィ チ ニ ブ の 応 用
第 １ 節 脳 腫 瘍 細 胞 株 U 8 7 M G 細 胞 に お け る A B C G 2 の 発 現 解 析 第 ２ 節 ゲ フ ィ チ ニ ブ 併 用 に よ る 細 胞 内 蛍 光 強 度 へ の 影 響
第 ３ 節 ゲ フ ィ チ ニ ブ 併 用 に よ る 細 胞 内 プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ 濃 度 へ の 影 響
第 ４ 節 ゲ フ ィ チ ニ ブ 併 用 の 腫 瘍 内 プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ 濃 度 へ の 影 響
第 ５ 節 ゲ フ ィ チ ニ ブ に よ る A LA を 用 い た 光 線 力 学 治 療 へ の 影 響
総 括
謝 辞
引 用 文 献
43
43
45 45
46
46
47
49
54
55
略 語
ABC ATP-binding cassette
CPT-11 Irinotecan (7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]–
carbonyloxycamptothecin) hydrochloride CPT Camptothecin
DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium DMSO Dimethyl sulfoxide
DTT Dithiothreitol
FRT Flp recombination target HRP Horseradish peroxidase
MTT 3-(4,5-dimethyl-2-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide
PBS Phosphate buffered saline
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis
序 論
投 与 さ れ た 薬 剤 が 細 胞 内 に 取 り 込 ま れ る と 、 代 謝 酵 素 に よ る 代 謝 や 薬 物 ト ラ ン ス ポ ー タ ー に よ る 輸 送 を 受 け る 。 薬 物 ト ラ ン ス ポ ー タ ー は 、 各 臓 器 に お け る 発 現 レ ベ ル と ト ラ ン ス ポ ー タ ー 自 体 の 機 能 に 依 存 し て 、 そ の 基 質 薬 剤 の 体 内 動 態 に 影 響 す る 。 し た が っ て 、 薬 物 ト ラ ン ス ポ ー タ ー は 、 薬 物 の 体 内 動 態 に お い て 極 め て 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る と 言 え る 。 こ の こ と か ら 、 薬 物 ト ラ ン ス ポ ー タ ー を 選 択 的 に 阻 害 す る こ と に よ り 、 癌 化 学 療 法 お よ び 光 線 力 学 療 法 の 治 療 効 果 の 向 上 が 期 待 さ れ も の と 考 え る 。
現 在 、 日 本 人 の 死 因 で 最 も 多 い の は 悪 性 新 生 物 で あ る 。 近 年 、 癌 診 断 や 癌 化 学 療 法 の 進 歩 に よ り 、 癌 治 療 は 急 速 な 発 展 を 遂 げ て き た 。 特 に リ ン パ 腫 な ど の 造 血 器 癌 や 小 児 癌 で は 、 抗 癌 剤 治 療 に よ る 治 癒 率 ・ 生 存 率 が 上 昇 し て い る 。 こ れ ま で 、 抗 癌 剤 に は 様 々 な 作 用 機 序 の 抗 癌 剤 が 登 場 し 、 癌 化 学 療 法 に 用 い ら れ て い る 。 例 と し て 、 ア ル キ ル 化 剤 は DNA の グ ア ニ ン を ア ル キ ル 化 し 、 二 重 鎖 DNA 間 で 架 橋 さ せ る こ と に よ り DNA 合 成 を 阻 害 し 、 抗 腫 瘍 効 果 を 発 揮 す る 。 こ の よ う に 、DNA 間 あ る い は DNA 内 で 架 橋 形 成 す る も の に 、 シ ス プ ラ チ ン や カ ル ボ プ ラ チ ン な ど の 白 金 製 剤 な ど が あ る 。 ま た 、 他 の 主 な 抗 癌 剤 の 作 用 機 序 と し て 微 小 管 重 合 阻 害 や 微 小 管 脱 重 合 阻 害 、 代 謝 拮 抗 阻 害 、 ト ポ イ ソ メ ラ ー ゼ 阻 害 に 加 え 、 近 年 で は ゲ フ ィ チ ニ ブ や エ ル ロ チ ニ ブ の よ う な 低 分 子 分 子 標 的 薬 や 抗 体 を 用 い た 分 子 標 的 治 療 薬 な ど が 登 場 し た 。
ま た 、 癌 診 断 に お い て は 、PET-CT や MRI な ど を 用 い た 画 像 診 断 技 術 の 発 達 に よ り 、 癌 の 早 期 発 見 が 可 能 と な っ て き た(1)。 特 に 近 年 で は 、 光 線 力 学 診 断 と 呼 ば れ る ポ ル フ ィ リ ン を 用 い た 生 体 に お け る 蛍 光 分 子 イ メ ー ジ ン グ 法 に よ る 癌 の 診 断 が 行 わ れ て い る(2 )。 光 線 力 学 診 断 は 、 腫 瘍 組 織 へ の 集 積 性 を 持 つ ポ ル フ ィ リ ン な ど の 光 感 受 性 物 質 を 患 者 に 投 与 し 、 腫 瘍 組 織 に
選 択 的 に 蓄 積 さ せ た 後 、 特 定 波 長 の 光 を 照 射 す る こ と で 発 せ ら れ る 蛍 光 色 を 観 察 す る こ と に よ り 腫 瘍 部 位 を 特 定 す る 診 断 方 法 で あ る 。 こ の 方 法 に よ り 、 腫 瘍 組 織 と 正 常 組 織 を 容 易 に 鑑 別 す る こ と が で き る よ う に な る 。 ま た 、 光 線 力 学 治 療 す な わ ち 、 ポ ル フ ィ リ ン な ど の 光 感 受 性 物 質 と 光 照 射 を 併 用 し 悪 性 腫 瘍 内 で 光 化 学 反 応 を 起 こ し 、 そ れ に よ り 生 成 す る 活 性 酸 素 を 利 用 し て 選 択 的 に 腫 瘍 組 織 を 死 滅 さ せ る 治 療 方 法 も 現 在 臨 床 応 用 の 段 階 に あ る 。
と こ ろ で 、DNA ト ポ イ ソ メ ラ ー ゼ に は Ⅰ 型 と Ⅱ 型 の 2 つ の タ イ プ が あ り 、DNA を 切 断 し て 再 結 合 す る こ と に よ り 、 超 ら せ ん 構 造 を 解 消 す る 酵 素 で あ る 。 ト ポ イ ソ メ ラ ー ゼ Ⅰ と ト ポ イ ソ メ ラ ー ゼ Ⅱ は 、 原 核 生 物 か ら 真 核 生 物 に 至 る ま で 広 く 存 在 す る 酵 素 で あ り 、 細 胞 内 で は 主 に ク ロ マ チ ン に 結 合 し 、 そ の 酵 素 活 性 は 分 裂 増 殖 の 盛 ん な 癌 細 胞 や 、DNA 合 成 期 の 細 胞 に お い て 増 大 す る こ と が 知 ら れ て い る 。 癌 細 胞 に お い て こ れ ら の 酵 素 を 阻 害 す る こ と で 、DNA の 合 成 を 阻 害 し 、 殺 細 胞 効 果 を 示 す こ と が で き る(3 )。 ト ポ イ ソ メ ラ ー ゼ Ⅰ を 阻 害 す る 薬 剤 と し て イ リ ノ テ カ ン 塩 酸 塩 （CPT- 11） と ノ ギ テ カ ン が 、 ト ポ イ ソ メ ラ ー ゼ Ⅱ を 阻 害 す る 薬 剤 と し て エ ト ポ シ ド や ド キ ソ ル ビ シ ン な ど が あ る 。
CPT-11（ 図 1） は 、 中 国 原 産 の 喜 樹 (Camptotheca acuminata) な ど の 植 物 に 含 有 さ れ て い る 抗 腫 瘍 性 ア ル カ ロ イ ド 、 カ ン プ ト テ シ ン （ 図 1） か ら 合 成 さ れ た 水 溶 性 の 誘 導 体 で あ り 、 ト ポ イ ソ メ ラ ー ゼ I を 阻 害 す る こ と に よ り DNA 合 成 を 阻 害 し 、 抗 腫 瘍 効 果 を 示 す 。 本 剤 は 高 い 抗 腫 瘍 活 性 と 広 い 抗 腫 瘍 ス ペ ク ト ル を 有 す る 抗 癌 剤 で あ る 。 小 細 胞 肺 癌 、 非 小 細 胞 肺 癌 、 子 宮 頸 癌 、 卵 巣 癌 、 胃 癌 (手 術 不 能 ま た は 再 発)、 結 腸 ・ 直 腸 癌 (手 術 不 能 ま た は 再 発)、 乳 癌 (手 術 不 能 ま た は 再 発)、 有 棘 細 胞 癌 、 悪 性 リ ン パ 腫 (非 ホ ジ キ ン リ ン パ 腫) 等 々 の 難 治 性 癌 に 対 し て 抗 腫 瘍 効 果 が 認 め ら れ て お り(4 )、 そ の 奏 効 率 は 20%~数 十%と 報 告 さ れ て い る 。 現 在 、 小 細 胞 肺 癌
の 治 療 に お い て シ ス プ ラ チ ン に 替 わ る 世 界 的 な 標 準 薬 と な り つ つ あ る 。 本 剤 の 母 化 合 物 で あ る CPT は 、1966 年 に 米 国 の Wall ら に よ っ て 抗 悪 性 腫 瘍 剤 と し て 開 発 が 進 め ら れ た 。CPT は 、 α-hydroxyl-δ-lactone moiety （E 環 ） を 5 員 環 構 造 中 に 有 し 、 ラ ク ト ン 環 構 造 が 可 逆 的 に 開 閉 し 、 中 性 あ る い は 塩 基 性 条 件 下 で は 開 環 体 （carboxylate form） を 形 成 し 、 酸 性 条 件 下 で は 閉 環 体 （lactone form） に 戻 る 特 徴 を も つ （ 図 2）(5 )。CPT の 閉 環 体 は 水 に 対 し て 難 溶 性 で あ る こ と か ら 、 当 初 臨 床 試 験 に は 開 環 体 が 用 い ら れ て き た 。 し か し 、 抗 腫 瘍 活 性 は 殆 ど 認 め ら れ ず(6 -8 )、 ま た 出 血 性 膀 胱 炎 な ど の 強 い 副 作 用 が 発 現 し た こ と か ら(9 )、CPT の 臨 床 試 験 は 1970 年 代 初 頭 に 中 断 さ れ た 。 そ の 後 、CPT よ り も 抗 腫 瘍 効 果 が 強 く 、 か つ 毒 性 を 軽 減 し た 誘 導 体 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin （SN-38、 図 1） が 合 成 さ れ(1 0 )、 さ ら に 安 定 化 を 図 る と と も に ラ ク ト ン 環 を 開 環 さ せ る こ と な く 水 溶 性 を 向 上 さ せ た CPT-11 が 合 成 さ れ た(11 )。CPT-11 は 、 主 に 肝 臓 で カ ル ボ キ シ ル エ ス テ ラ ー ゼ に よ り 代 謝 さ れ 、 活 性 代 謝 物 で あ る SN-38 に 変 換 さ れ て 効 果 を 示 す プ ロ ド ラ ッ グ で あ り(12 )、 ト ポ イ ソ メ ラ ー ゼ 阻 害 効 果 は CPT-11 の 250 か ら 1000 倍 強 い 。SN-38 は 、 ト ポ I 触 媒 作 用 の 単 鎖 切 断 (cleavage)、 鎖 通 過 (strand passage)、 再 結 合 (reunion、ligation) の う ち 、 ト ポ I が DNA に 結 合 し た 反 応 中 間 体 で あ る DNA-ト ポ I 共 有 結 合 複 合 体 (cleavable complex) に 対 し 、 強 い 親 和 性 を 有 す る （ 図 3）。 す な わ ち SN-38 存 在 下 、 in vivo 及 び in vitro に お い て も 、DNA-ト ポ I 共 有 結 合 複 合 体 を 安 定 化 し 、 切 断 状 態 に あ る DNA と ト ポ I か ら な る 複 合 体 を 蓄 積 さ せ る 。 そ の 結 果 、 DNA の 1 本 鎖 は 切 断 さ れ た ま ま と な り 、DNA の 複 製 に よ っ て 2 本 鎖 切 断 が 誘 起 さ れ 、 細 胞 増 殖 が 抑 制 さ れ て ア ポ ト ー シ ス に 至 る と 現 在 推 測 さ れ て い る 。
と こ ろ で 、CPT-11 は 現 在 、 臨 床 現 場 で は 静 注 投 与 が 基 本 で あ る 。CPT-11
は こ れ ま で 、 経 口 投 与 に つ い て は 様 々 な 検 討 が 試 み ら れ て い る が 、 血 中 濃 度 の 上 昇 が 充 分 で な く 、 期 待 で き る 抗 腫 瘍 効 果 を 発 揮 し て い る と は 言 い 難 い 。 そ の 原 因 と し て 、CPT-11 の 低 い バ イ オ ア ベ イ ラ ビ リ テ ィ （8%） が 挙 げ ら れ る 。CPT-11 は 、 消 化 管 上 皮 細 胞 に 発 現 し て い る 薬 物 ト ラ ン ス ポ ー タ ー に よ り 腸 管 管 腔 内 へ と 排 泄 さ れ 、 肝 臓 に 発 現 し て い る 薬 物 ト ラ ン ス ポ ー タ ー に よ り 胆 汁 中 へ と 排 泄 さ れ る 。 こ れ ら の 薬 物 ト ラ ン ス ポ ー タ ー は ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー と 呼 ば れ る 一 群 の 膜 蛋 白 質 で あ り 、CPT-11 及 び SN-38 の 輸 送 に 関 わ る の は 、 主 に ABCB1/MDR1 及 び ABCG2/BCRP の 2 つ の ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー で あ る(13, 14 )。 し た が っ て 、 こ れ ら の ト ラ ン ス ポ ー タ ー を 阻 害 す る こ と に よ り 、CPT-11 及 び SN-38 の 体 内 動 態 に 影 響 を 及 ぼ す こ と が 期 待 で き る(15 )。
現 在 、ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー フ ァ ミ リ ー は 、 配 列 と 構 造 の 相 同 性 を 基 に ABCA~ABCG ま で の 7 つ の サ ブ フ ァ ミ リ ー に 分 類 さ れ て い る(16 )。ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー フ ァ ミ リ ー に は 、6 回 膜 貫 通 β ヘ リ ッ ク ス ド メ イ ン 及 び 細 胞 質 内 に 局 在 す る 細 菌 か ら ヒ ト に 至 る ま で 非 常 に よ く 保 存 さ れ た モ チ ー フ Walker A, Walker B 及 び Signature C を 有 す る 200 ア ミ ノ 酸 残 基 に わ た る ATP 結 合 ド メ イ ン が 交 互 に 2 回 連 な る full type と 、 そ れ ぞ れ 1 つ ず つ か ら 構 成 さ れ る half type が あ る 。 そ れ ぞ れ ト ラ ン ス ポ ー タ ー 、 チ ャ ン ネ ル 、 受 容 体 等 多 様 な 機 能 を 持 っ た 膜 蛋 白 質 に 分 類 さ れ る が 、 そ の 多 く は ATP を 加 水 分 解 し 、 そ の エ ネ ル ギ ー を 利 用 し て 基 質 薬 剤 を 能 動 的 に 輸 送 す る こ と が 知 ら れ て い る 。 こ れ ら ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー は 、 消 化 管 上 皮 細 胞 や 肝 臓 、 腎 臓 だ け で な く 、 血 液 脳 関 門 や 血 液 胎 盤 関 門 な ど で も 発 現 し て い る
（ 表 1）。 主 な 生 物 学 的 役 割 は 、 低 分 子 性 異 物 や 生 体 内 物 質 の 吸 収 ・ 排 泄 過 程 の 輸 送 を 担 い 、 異 物 か ら 細 胞 や 組 織 を 保 護 す る 機 能 に あ る 。 す な わ ち 、 ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー は 、 薬 剤 の 細 胞 へ の 取 り 込 み 及 び 代 謝 な ど と 共 に 、
薬 剤 の バ イ オ ア ベ イ ラ ベ リ テ ィ を 規 定 す る 重 要 な 因 子 と な る も の と 考 え ら れ る 。 現 に こ れ ら ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー の う ち 代 表 的 な も の と し て 、 ABCB1/P 糖 蛋 白 質 （ABCB1/MDR1、 図 4）、ABCG2/breast cancer resistance protein（ABCG2/BCRP、 図 4） や ABCC1/multidrug resistance associated protein1（MRP1） な ど の ABCC サ ブ フ ァ ミ リ ー が 薬 剤 の 吸 収 や 排 泄 に お い て 中 心 的 な 役 割 を 担 っ て い る こ と が 明 ら か に さ れ て い る （ 表 2）(17 -19 )。 ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー に よ る 輸 送 を 回 避 す る ア プ ロ ー チ と し て 、 各 種 ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 基 質 と な ら な い 薬 剤 を 開 発 す る こ と は も ち ろ ん の こ と 、 阻 害 剤 を 用 い て ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 輸 送 機 能 を 阻 害 す る 薬 剤 の 開 発 が 考 え ら れ る 。 阻 害 剤 の 探 索 は 、 基 質 と な る 既 知 の 薬 剤 の 有 効 性 を 向 上 す る 上 で 重 要 で あ り 、 か つ ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 生 理 的 機 能 の 解 明 に 好 個 の 材 料 と な る こ と は 論 を 待 た な い 。 薬 物 輸 送 機 構 の 解 析 を 行 い 、 そ の 情 報 に 基 づ い た 創 薬 分 子 デ ザ イ ン の 研 究 は 、 癌 患 者 に 対 す る 最 適 な 薬 剤 選 択 や 薬 剤 の 開 発 に 重 要 で あ り 、 臨 床 に お け る 化 学 療 法 の 問 題 を 解 決 す る 上 で 新 し い 治 療 法 の 開 発 に 繋 が る と 考 え る 。 特 に ABCB1 及 び ABCG2 に 対 す る 阻 害 剤 の 探 索 は 、 こ れ ら ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 基 質 と な る 薬 剤 に よ る 治 療 成 績 を 向 上 す る と い う 点 で 重 要 で あ り 、 臨 床 に お け る 抗 癌 剤 耐 性 の 問 題 を 解 決 す る 新 し い 治 療 法 の 開 発 に も 繋 が る と 考 え ら れ る 。
と こ ろ で Kruijtzer ら は 、ABCG2 及 び ABCB1 の 両 ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 阻 害 剤 で あ る GF120918 を 投 与 し た マ ウ ス に お い て 、 同 時 に 経 口 投 与 し た ト ポ テ カ ン の AUC が 2 倍 以 上 増 大 し た こ と を 報 告 し て い る(20 )。 さ ら に Jonker ら が 、 エ ラ ク リ ダ ル と ト ポ テ カ ン を ABCB1 ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス に 経 口 投 与 し た 場 合 に お い て も 、 マ ウ ス 血 中 の ト ポ テ カ ン 濃 度 が 上 昇 し た こ と を 報 告 し て い る こ と か ら(21 )、 エ ラ ク リ ダ ル に よ る ト ポ テ カ ン の AUC の 上 昇 は 、 消 化 管 の ABCG2 阻 害 が 主 た る 原 因 で あ る と 推 論 で き る 。 す な わ
ち こ れ ら の 結 果 は 、ABCG2 阻 害 作 用 の あ る 薬 剤 と ABCG2 の 基 質 と な る 経 口 抗 癌 剤 の 併 用 は 、 抗 癌 剤 の 効 果 を 充 分 に 増 強 す る 可 能 性 が あ る こ と を 支 持 す る も の で あ る 。 実 際 、ABCB1 基 質 薬 剤 で あ る 経 口 パ ク リ タ キ セ ル と ABCB1 阻 害 剤 で あ る 経 口 シ ク ロ ス ポ リ ン A の 併 用 は 、 臨 床 に お い て も そ の 有 効 性 と 安 全 性 が 非 小 細 胞 肺 癌 を 対 象 と し た 第 2 相 試 験 で 証 明 さ れ て
お り(22 )、 経 口 抗 癌 剤 と 薬 剤 排 出 ポ ン プ の 阻 害 作 用 の あ る 薬 剤 と の 併 用 は
非 小 細 胞 肺 癌 患 者 に 対 し て 有 効 な レ ジ メ ン と 考 え ら れ る 。
一 方 、 上 皮 成 長 因 子 受 容 体 チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ 阻 害 剤 の ゲ フ ィ チ ニ ブ は ABCB1 及 び ABCG2 を 阻 害 す る こ と が 報 告 さ れ て い る(2 2-24 )。 す な わ ち Nakamura ら は 、 高 濃 度 の SN-38 で 処 理 し た 細 胞 中 に ABCG2 高 発 現 SN- 38 耐 性 細 胞 株 を 得 、 本 細 胞 を 用 い て 、 ゲ フ ィ チ ニ ブ 共 存 下 に お け る ABCG2 基 質 薬 剤 の 薬 剤 感 受 性 に 対 す る 影 響 と ABCG2 阻 害 機 構 の 解 明 を 試 み 、 そ の 結 果 、ABCG2 に 対 す る 阻 害 様 式 と し て 、 ゲ フ ィ チ ニ ブ が ABCG2 の 基 質 と は な ら ず 、 基 質 認 識 部 位 へ の 結 合 阻 害 に よ り ABCG2 の ATPase 活 性 を 阻 害 す る こ と を in vitro に お い て 明 ら か に し た(23 )。 し か し 一 方 で 、Yanase ら は 、 ゲ フ ィ チ ニ ブ が ABCG2 を 阻 害 す る の み な ら ず 、 ABCG2 の 基 質 に な り う る と い う 報 告 を し て い る(24 )。 さ ら に 、 ゲ フ ィ チ ニ ブ が ABCB1 を も 阻 害 す る と の 報 告 が あ り(25 )、 ゲ フ ィ チ ニ ブ に よ る 阻 害 標 的 部 位 の 特 定 、 そ の 詳 細 な 阻 害 機 構 に 関 す る 諸 説 は 、 未 だ 不 明 瞭 な 点 が 多 い 。
ま た 、Saito ら は 定 量 的 構 造 活 性 相 関 （QSAR） 解 析 に よ り 、 ヘ テ ロ 環 が 重 合 し た 平 面 構 造 を 持 つ 化 合 物 が ABCG2 に 輸 送 さ れ や す く 、 ま た プ リ ン 環 類 縁 体 や キ ナ ゾ リ ン 骨 格 を 持 つ 化 合 物 が ABCG2 輸 送 活 性 を 強 く 阻 害 す る こ と を 報 告 し て い る （ 図 5）(26 )。 さ ら に 、An ら は プ リ ン 環 類 縁 体 と し て 、 ロ ス コ ビ チ ン な ど の サ イ ク リ ン 依 存 性 キ ナ ー ゼ 阻 害 剤 （ 図 5） の 光 線
力 学 診 断 や 光 線 力 学 治 療 へ の 応 用 に つ い て 検 討 を 行 っ た(27 )。 し か し 、 サ イ ク リ ン 依 存 性 キ ナ ー ゼ 阻 害 剤 は 臨 床 で 用 い ら れ て お ら ず 、 そ の 安 全 性 に つ い て 不 明 な 点 が 多 い 。 し た が っ て 著 者 は 本 研 究 に お い て 、ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー 阻 害 剤 と し て 、 キ ナ ゾ リ ン 骨 格 を 持 ち 現 在 す で に 臨 床 で 用 い ら れ て い る ゲ フ ィ チ ニ ブ に 着 目 し た （ 図 5）。
ま た 近 年 、 プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ に よ り 腫 瘍 部 位 を 特 定 す る 光 線 力 学 診 断 が 、 髄 膜 腫 や グ リ オ ブ ラ ス ト ー マ の 外 科 的 手 術 に 用 い ら れ て い る(28 -31 )。 プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ は ヘ ム 合 成 の 中 間 代 謝 物 で あ り 、 赤 い 蛍 光 を 発 す る
（ 図 6）。 ア ミ ノ レ ブ リ ン 酸 （ALA） が ペ プ チ ド ト ラ ン ス ポ ー タ ー(PEPT)1 及 び PEPT2 に よ り 細 胞 内 に 取 り 込 ま れ る か 、ALA 合 成 酵 素 に よ り 細 胞 内 で グ リ シ ン と ス ク シ ニ ル CoA よ り 合 成 さ れ る と 、 多 段 階 の 代 謝 を 受 け て コ プ ロ ポ ル フ ィ リ ノ ー ゲ ン Ⅲ が 合 成 さ れ る 。 コ プ ロ ポ ル フ ィ リ ノ ー ゲ ン Ⅲ は ABCB6 に よ り ミ ト コ ン ド リ ア 内 に 輸 送 さ れ 、 コ プ ロ ポ ル フ ィ リ ノ ー ゲ ン Ⅲ 酸 化 酵 素 に よ り プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ノ ー ゲ ン へ と 代 謝 さ れ 、 プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ノ ー ゲ ン は プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ に 代 謝 さ れ る 。 プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ は 、 フ ェ ロ キ ラ タ ー ゼ に よ り 鉄 が 配 位 さ れ る と ヘ ム に な り 、 細 胞 質 へ と 輸 送 さ れ 、 ビ リ ベ ル ジ ン 、 ビ リ ル ビ ン へ と 代 謝 さ れ て い く （ 図 7）。 癌 細 胞 で は 、 活 性 代 謝 物 の プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ が 蓄 積 し や す い た め 、 周 囲 の 正 常 組 織 と 区 別 す る こ と が で き る 。
プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ が 腫 瘍 集 積 性 を 示 す 理 由 は 明 確 に は な っ て い な い が 、PEPT1 や コ プ ロ ポ ル フ ィ リ ノ ー ゲ ン Ⅲ 酸 化 酵 素 が 過 剰 に 発 現 し て い る こ と が 報 告 さ れ て お り(3 2 )、 そ の 結 果 プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ が 腫 瘍 内 に 蓄 積 さ れ る と 推 測 さ れ て い る 。 ま た 、 プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ へ の 鉄 付 加 を 触 媒 す る フ ェ ロ キ ラ タ ー ゼ の 活 性 が 抑 制 さ れ る こ と に よ り 代 謝 が 阻 害 さ れ 、 プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ が 蓄 積 す る こ と も 報 告 さ れ て い る(33 )。 こ の よ う に
し て プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ が 腫 瘍 内 に 特 異 的 に 蓄 積 す る と 現 在 考 え ら れ て い る 。 例 と し て 、 乳 癌 で は 周 囲 の 正 常 組 織 に 比 べ 、 腫 瘍 内 の プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ 濃 度 は 2.2 倍 か ら 5.5 倍 高 く な る と 報 告 さ れ て い る(34 )。
ALA を 用 い た 光 線 力 学 診 断 を 用 い る こ と で 、 よ り 正 確 に 腫 瘍 組 織 を 正 常 組 織 と 区 別 す る こ と が 可 能 と な っ た 。 特 に 、 胃 癌 な ど と 異 な り 、 周 囲 の 正 常 組 織 ご と 腫 瘍 組 織 を 取 り 除 く こ と が 難 し い 悪 性 脳 腫 瘍 の 外 科 的 治 療 に お い て 、 正 確 に 腫 瘍 組 織 を 取 り 除 く こ と は 、 患 者 の QOL 向 上 に 非 常 に 有 効 で あ る 。
神 経 膠 腫 （ グ リ オ ー マ ） は グ リ ア 細 胞 由 来 の 腫 瘍 で 、 悪 性 度 毎 に 4 段 階 に 分 類 し 、 最 も 悪 性 度 の 高 い グ レ ー ド 4 に 属 す る 腫 瘍 を 膠 芽 腫 （ グ リ オ ブ ラ ス ト ー マ ） と 呼 ぶ 。 脳 内 へ の 薬 剤 の 移 行 は 、 血 液 脳 関 門 に よ り 制 限 さ れ て い る 。 血 液 脳 関 門 に は ABCB1 と ABCG2 が 発 現 し て い る た め 、 そ の 基 質 と な る よ う な 薬 剤 は 脳 内 に 移 行 し 難 い と い う 問 題 が あ る(35 -39 )。 そ の た め 、 グ リ オ ー マ 治 療 は 外 科 治 療 に よ り 可 能 な 限 り 腫 瘍 を 取 り 除 き 、 そ の 後 化 学 療 法 を 行 う の が 一 般 的 で あ る 。 し か し 、 グ リ オ ー マ は 周 囲 に 浸 潤 し 、 正 常 組 織 と の 境 界 が 不 明 瞭 な 場 合 が 多 い た め 、 摘 出 は 困 難 で あ る(4 0 )。 そ こ で 現 在 、ALA が グ リ オ ー マ の 診 断 薬 と し て 認 可 さ れ 、 臨 床 で 術 中 に 腫 瘍 部 位 を 特 定 す る た め に 用 い ら れ て い る(41 )。
一 方 、 プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ が ABCG2 の 基 質 と な り 細 胞 外 へ 排 出 さ れ 、 光 線 力 学 診 断 や 光 線 力 学 治 療 の 効 果 を 低 下 さ せ る こ と が 報 告 さ れ て い る
(42 -4 6 )。 腫 瘍 内 の プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ 濃 度 の 決 定 因 子 に は 、 プ ロ ト ポ ル
フ ィ リ ン Ⅸ を 細 胞 外 へ と 排 出 す る ABCG2 の 他 、ALA を 細 胞 内 に 取 り 込 む PEPT1、 ヘ ム 合 成 経 路 に 関 わ る 酵 素 で あ る コ プ ロ ポ ル フ ィ リ ノ ー ゲ ン Ⅲ と フ ェ ロ キ ラ タ ー ゼ が あ る 。ABCG2 に よ り プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ が 周 囲 の 正 常 組 織 に 漏 出 し て し ま う と 、 腫 瘍 組 織 と 正 常 組 織 の 境 界 線 が 不 明 瞭 に な
り 、 正 確 に 癌 組 織 を 鑑 別 す る こ と が 難 し く な る 。 し た が っ て 、ABCG2 を 阻 害 す る こ と で 、 光 線 力 学 診 断 の 効 率 向 上 に つ な が る も の と 期 待 で き る 。 こ れ ま で 述 べ て き た よ う に 、ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー は 薬 物 動 態 の 重 要 な 決 定 因 子 と な り 、 こ れ ら の 働 き を 制 御 す る こ と に よ り 、 基 質 薬 剤 の 体 内 動 態 や 副 作 用 を コ ン ト ロ ー ル で き る 可 能 性 が 示 唆 さ れ 、 今 回 著 者 は こ の 点 に 特 に 注 目 し 研 究 を 遂 行 し た 。 す な わ ち 、 阻 害 剤 と し て ゲ フ ィ チ ニ ブ を 用 い 、 そ の ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー 阻 害 効 果 と 癌 化 学 療 法 及 び 光 線 力 学 療 法 へ の 応 用 に つ い て 検 討 を 行 っ た 。
第 1 章 で は 、 ゲ フ ィ チ ニ ブ の 標 的 と な る ト ラ ン ス ポ ー タ ー に 対 す る 阻 害 の 選 択 性 を 検 討 す る 目 的 で 、ABCB1 及 び ABCG2 発 現 細 胞 を 用 い た in vitro 実 験 を 行 い 、 ゲ フ ィ チ ニ ブ は ABCB1 よ り ABCG2 を よ り 選 択 的 に 阻 害 す る こ と を 明 ら か に し た(47)。 ま た 、 腸 管 や 肝 臓 に 発 現 し て い る ABCB1 及 び ABCG2 に 着 目 し 、in vivo に お け る こ れ ら ト ラ ン ス ポ ー タ ー 阻 害 剤 に よ る 効 果 の 検 討 を 加 え る た め に 、 ゲ フ ィ チ ニ ブ を ヌ ー ド マ ウ ス に 前 投 与 し 、 ABCB1 の 基 質 と な る CPT-11 を 併 用 投 与 し 、CPT-11 及 び CPT-11 の 活 性 代 謝 物 で あ る SN-38（ABCG2 の 基 質 ） の 体 内 動 態 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 検 討 を 行 な っ た 。 そ の 結 果 、 ゲ フ ィ チ ニ ブ が ABCG2 を よ り 選 択 的 に 阻 害 す る こ と を 明 ら か に し た 。 ま た 、 ゲ フ ィ チ ニ ブ 及 び CPT-11 の 併 用 投 与 に よ り 、SN-38 の 血 中 薬 剤 濃 度 及 び 腫 瘍 内 薬 剤 濃 度 が 増 加 す る こ と を 明 ら か に
し た(47 )。
第 2 章 で は ABCG2 阻 害 に よ る 細 胞 内 プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ の 蓄 積 へ の 影 響 に つ い て 検 討 す る 目 的 で 、 ヒ ト グ リ オ ブ ラ ス ト ー マ 細 胞 株 U87MG と ABCG2 阻 害 剤 と し て ゲ フ ィ チ ニ ブ を 用 い た in vitro 実 験 を 行 っ た 。 ま た 、 in vivo に お け る ゲ フ ィ チ ニ ブ の 腫 瘍 内 プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン IX 濃 度 へ の 影 響 に つ い て も 検 討 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 ゲ フ ィ チ ニ ブ を 併 用 す る こ と で 、
in vitro 及 び in vivo で 、 細 胞 内 の プ ロ ト ポ ル フ ィ リ ン Ⅸ 濃 度 を 増 加 さ せ る こ と を 明 ら か に し た(48 )。 ま た 、 ゲ フ ィ チ ニ ブ 併 用 に よ り ALA 投 与 後 の 光 照 射 に よ る 殺 細 胞 効 果 が 増 強 す る こ と を in vitro で 明 ら か に し た(48 )。
こ れ ら の 結 果 か ら 、ABCG2 阻 害 剤 を 用 い 、 基 質 薬 剤 の 薬 物 動 態 を 改 善 す る 治 療 法 は 、 新 た な 癌 治 療 戦 略 と な り う る と い え る 。
実 験 の 部
第 １ 章 ゲ フ ィ チ ニ ブ に よ る CPT-11 の 抗 腫 瘍 効 果 に 及 ぼ す 影 響
第 １ 節 Real-Time PCR に よ る ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 発 現 解 析 1-1) 使 用 細 胞
ヒ ト 小 細 胞 肺 癌 培 養 細 胞 親 株 PC-6、ABCB1 遺 伝 子 導 入 細 胞 株 Flp-In- 293/ABCB1、 ABCG2 遺 伝 子 導 入 細 胞 株 Flp-In-293/ABCG2 及 び ベ ク タ ー の み 導 入 し た Flp-In-293/Mock を 用 い た 。PC-6 細 胞 は 長 崎 大 学 医 学 部 第 二 内 科 学 教 室 中 村 洋 一 博 士 よ り 供 与 さ れ 実 験 に 用 い た 。Flp-In-293/ABCB1、 Flp-In-293/ABCG2、Flp-In-293/Mock 細 胞 は 理 化 学 研 究 所 横 浜 研 究 所 石 川 智 久 博 士 よ り 供 与 さ れ 実 験 に 用 い た 。Flp-In-293 細 胞 は 、 ヒ ト 胎 児 由 来 腎 臓 細 胞 HEK293 を 親 株 と し 、S. cerevisiae 由 来 Flp リ コ ン ビ ナ ー ゼ と Flp リ コ ン ビ ナ ー ゼ 標 的 （FRT） 部 位 を 利 用 し た 部 位 特 異 的 な 組 換 え に よ り 、 染 色 体 の 特 定 の 位 置 に 目 的 遺 伝 子 を 組 込 み 、 目 的 蛋 白 質 を 安 定 的 に 発 現 さ せ た 細 胞 で あ る （ 図 8）。Flp-In シ ス テ ム で は 、 ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン し た 全 て の 細 胞 の 染 色 体 上 の 特 定 部 位 に 目 的 遺 伝 子 を 組 込 む こ と が 可 能 で あ る 。1 回 の Flp-In ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン に よ り 同 一 遺 伝 子 を 有 す る 相 同 で 安 定 な 発 現 細 胞 集 団 が 得 ら れ る 上 、 目 的 遺 伝 子 を 特 定 部 位 1 ヶ 所 に 組 込 む の で 発 現 の 際 の 染 色 体 上 の 部 位 効 果 を 制 限 で き る 。 こ の た め 、 異 な る 染 色 体 へ の 複 数 の 組 込 み や 単 一 組 込 み に よ る 不 安 定 な 影 響 が な く 複 数 の 遺 伝 子 を 再 現 性 高 く 解 析 で き る こ と が 可 能 な シ ス テ ム で あ る 。
1-2) 試 薬
DMEM、RPMI1640（ 以 上 SIGMA）、100μg/mL Hygromycin B（ ナ カ ラ イ テ ス ク ）、 L-グ ル タ ミ ン 、PBS（ 以 上 日 水 製 薬 ）、1%(v/v) antibiotic-
antimycotic（ABAM）、0.05% ト リ プ シ ン-EDTA、0.4% ト リ パ ン ブ ル ー
（ 以 上 GIBCO）、 牛 胎 児 血 清 （HyClone）、ISOGEN（ 和 光 純 薬 工 業 ）、
ReverTra Dash（ 東 洋 紡 績 ）、LightCycler® FastStart DNA Master PLUS SYBR Green I（ ロ シ ュ ・ ダ イ ア グ ノ シ ス ） を 用 い た 。
1-3) 細 胞 培 養 法
Flp-In-293/ABCB1、Flp-In-293/ABCG2、Flp-In-293/Mock の 培 養 は 次 の よ う に 行 っ た 。 す な わ ち 、DMEM に 牛 胎 児 血 清 （ 最 終 濃 度 10%）、ABAM 5mL 及 び L-グ ル タ ミ ン （0.3mg/mL） を 加 え 、37℃ 、5%の 炭 酸 ガ ス 存 在 下 、 シ ャ ー レ で 培 養 を 行 っ た 。 尚 、Hygromycin B は 継 代 の 際 、 細 胞 を 入 れ る 直 前 に 培 地 に 添 加 し た 。
PC-6 は RPMI1640 に 牛 胎 児 血 清 （ 最 終 濃 度 10%） を 加 え 37℃ 、5%の 炭 酸 ガ ス 存 在 下 で 培 養 を 行 っ た
1-4) 全 RNA の 調 製 法
ISOGEN の 添 付 文 書 に 従 っ て 行 っ た 。 す な わ ち 、 シ ャ ー レ で 培 養 し た PC-6、Flp-In-293/ABCB1、Flp-In-293/ABCG2、Flp-In-293/Mock 細 胞 に 、 培 地 を 取 り 除 い た 後 ISOGEN 1mL を 直 接 添 加 し 、 緩 や か に ピ ペ ッ テ ィ ン グ を し た 後 、 室 温 で 5 分 間 放 置 し た 。 次 い で 、 ク ロ ロ ホ ル ム 0.2mL を 添 加 し て 3 分 間 放 置 し 、4℃ 、12,000×g で 15 分 間 遠 心 分 離 後 、 水 層 を 採 取 し た 。 採 取 し た 水 層 に イ ソ プ ロ パ ノ ー ル 500μL を 加 え 、 室 温 で 5 分 間 放 置 後 、4℃ 、12,000×g で 10 分 間 遠 心 分 離 し た 。 さ ら に 、70% エ タ ノ ー ル で 沈 殿 を 2 回 洗 浄 後 、 全 RNA を 氷 中 下 、 適 量 の TE 溶 液 [10mM ト リ ス- 塩 酸 （pH 8.0）、1mM EDTA] に 溶 か し 、 試 料 と し た 。260nm に お け る 吸 光 度 を 測 定 し RNA 量 を 求 め た 。
1-5) Reverse Transcription polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
RT-PCR は ReverTra Dash の プ ロ ト コ ー ル に 従 っ て 行 っ た 。 得 ら れ た 全 RNA 1μg 相 当 を 、oligo (dT)プ ラ イ マ ー を 用 い て ①42℃ 20 分 間 、 ②99℃
5 分 間 、 ③4℃ 5 分 間 の 条 件 下 で 逆 転 写 反 応 を 行 っ た （iCycler、Bio-Rad）。
1-6) Real-Time PCR
Real-Time PCR は 、LightCycler® FastStart DNA Master PLUS SYBR Green I の プ ロ ト コ ー ル に 従 っ て 行 っ た 。 得 ら れ た cDNA 溶 液 1μL を 次 の 条 件 下 で 反 応 さ せ た （LightCycler、 ロ シ ュ ・ ダ イ ア グ ノ シ ス ）。
①95℃ 10 分 間 、 ②95℃ 10 秒 間 、60℃ 10 秒 間 、72℃ 10 秒 間 、 ③95℃ 0 秒 間 、 ④65℃ 15 秒 間 、 ⑤95℃ 0 秒 間 、 ⑥40℃ 30 秒 間 （ ② は 45 サ イ ク ル 行 っ た ）
Real-Time PCR に 用 い た プ ラ イ マ ー を 以 下 に 示 す 。
ABCB1 gene： 上 流 5’-CCATAGCTCGTGCCCTTGTTAGA-3’
下 流 5’-CGGTGAGCAATCACAATGCAG-3’
ABCG2 gene： 上 流 5’-CTAAGCAGGGACGAACAATCATC-3’
下 流 5’-TCCTGCTTGGAAGGCTCTATG-3’
GAPDH gene： 上 流 5’-AATTCCATGGCACCGTCAA-3’
下 流 5’-CATGAGTCCTTCCACGATACCA-3’
第 ２ 節 ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ 法 に よ る ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 発 現 解 析
2-1) 使 用 細 胞
非 小 細 胞 肺 癌 細 胞 株 PC-9 、 PC-6 、 Flp-In-293/ABCB1 、 Flp-In- 293/ABCG2、Flp-In-293/Mock を 用 い た 。
2-2) 試 薬
PBS（ 日 水 製 薬 ）、DTT（ 和 光 純 薬 工 業 ）、Triton X-100（SIGMA）、 プ ロ テ ア ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー カ ク テ ル 、Protein Assay Bicinchoninate Kit、Sample Buffer Solution with Reducing Reagent for SDS -PAGE（ 以 上 ナ カ ラ イ ）、
7.5% ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 、 ト ラ ン ス ブ ロ ッ ト® Turbo™ ミ ニ ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 転 写 パ ッ ク （ 以 上 Bio-Rad）、 ブ ロ ッ ク エ ー ス （DS Pharma Biomedical）、 抗 ヒ ト ABCB1 抗 体 C219（Calbiochem）、 抗 ヒ ト ABCG2 抗 体 BXP-21（Kamiya Biochemical Company）、 抗 β-actin 抗 体 C4（Santa Cruz Biothechnology ） 、 抗 EGFR 抗 体 sc-03 （ Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）、HRP 標 識 anti-mouse IgG 抗 体 （Cell Signaling Technology）、HRP 標 識 anti-mouse IgG (H+L) 抗 体 （Vector Laboratories）、HRP 標 識 anti-rabbit IgG 抗 体 （Vector Laboratories）、
Immobilon-Western Chemiluminescent HRP reagent（Millipore） を 用 い た 。
2-3) 細 胞 培 養 法
Flp-In-293/ABCB1、Flp-In-293/ABCG2、Flp-In-293/Mock の 培 養 は 次 の よ う に 行 っ た 。 す な わ ち 、DMEM に 牛 胎 児 血 清 （ 最 終 濃 度 10%）、ABAM 5mL 及 び L-グ ル タ ミ ン （0.3mg/mL） を 加 え 、37℃ 、5%の 炭 酸 ガ ス 存 在 下 、 フ ラ ス コ で 培 養 を 行 っ た 。 尚 、Hygromycin B は 継 代 の 際 、 細 胞 を 入 れ る 直 前 に 培 地 に 添 加 し た 。
PC-6 と PC-9 は RPMI1640 に 牛 胎 児 血 清 （ 最 終 濃 度 10%） を 加 え 37℃ 、 5%の 炭 酸 ガ ス 存 在 下 で 培 養 を 行 っ た
2-4) 蛋 白 質 の 抽 出
細 胞 を PBS で 8,500×g、4℃ 、10 分 間 の 遠 心 分 離 を 3 回 繰 り 返 し 洗 浄 後 、
溶 解 バ ッ フ ァ ー [50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、1 mM DTT、 1% (v/v) Triton X-100、protease inhibitor cocktail for general use ]に 再 懸 濁 し 、27G 針 を 取 り 付 け た シ リ ン ジ で 10 回 吸 い 出 し て 細 胞 を 破 壊 し た 。800 × g、4℃ 、10 分 間 の 遠 心 分 離 後 、 上 清 を 集 め た 。
2-5) 蛋 白 質 の 定 量
2-4)で 得 ら れ た 上 清 は 、 ビ シ ン コ ニ ン 酸 法 に よ り 蛋 白 質 の 定 量 を 行 っ た 。 ビ シ ン コ ニ ン 酸 法 は Protein Assay Bicinchoninate Kit の プ ロ ト コ ー ル に 従 っ て 行 っ た 。 サ ン プ ル 100μL に 対 し 、 硫 酸 銅 溶 液 と ビ シ ン コ ニ ン 酸 溶 液 を 1：50 で 混 和 し た 溶 液 （Working Solution） 2mL を 混 和 し 、37℃ 、30 分 で 反 応 さ せ た 。 そ の 後 、 分 光 光 度 計 を 用 い 562 nm の 吸 光 度 を 測 定 し た 。 標 準 液 と し て ウ シ ア ル ブ ミ ン を 用 い て 検 量 線 を 作 成 し 、 サ ン プ ル の 定 量 を 行 っ た 。
2-6) SDS-ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動
サ ン プ ル を SDS-PAGE 用 サ ン プ ル バ ッ フ ァ ー 液 に 溶 か し 、 沸 騰 水 中 で 3 分 間 熱 処 理 を 行 っ た 。7.5% ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル に サ ン プ ル 溶 液 を 添 加 し （10～20 μg）、 電 気 泳 動 を 行 っ た 。
2-7) ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 に よ る ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー 発 現 解 析
SDS-PAGE 展 開 後 、 ゲ ル 中 の 蛋 白 質 を ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 に 転 写 し た 。 転 写 後 の ゲ ル は ク マ シ ー ブ リ リ ア ン ト ブ ル ー で 染 色 し 転 写 状 況 を 確 認 し た 。 転 写 後 の ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 は T-PBS で 数 回 洗 浄 後 、 非 特 異 的 吸 着 を 最 小 限 に 抑 え る た め 、 ブ ロ ッ ク エ ー ス に 4℃ で 一 晩 浸 透 し ブ ロ ッ キ ン グ を 行 っ た 。 次 に T-PBS で 10 分 間 3 回 洗 浄 を 行 っ た 。 そ の 後 、 抗 ヒ ト
ABCB1 抗 体 C219（200 倍 希 釈 ）、 抗 ヒ ト ABCG2 抗 体 BXP-21（2,500 倍 希 釈 ） ま た は 抗 ヒ ト β-actin 抗 体 C4（5,000 倍 希 釈 ） に 4℃ 、 一 晩 浸 透 し て 抗 原 抗 体 反 応 を 行 い 、T-PBS で 10 分 間 3 回 洗 浄 を 行 っ た 。 次 い で 、 ABCB1 と ABCG2 に 対 し て は 3,000 倍 に 希 釈 し た HRP 標 識 anti-mouse IgG 抗 体 に 、 β-actin に 対 し て は 10,000 倍 に 希 釈 し た HRP 標 識 anti-mouse IgG (H+L)抗 体 に 、 そ れ ぞ れ 室 温 で 1 時 間 浸 透 し て 二 次 抗 体 反 応 を 行 い 、 そ の 後 、T-PBS で 10 分 間 3 回 洗 浄 を 行 っ た 。 こ の ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 を 、 化 学 発 光 キ ッ ト Immobilon-Western Chemiluminescent HRP reagent に 1 分 間 浸 透 し 、ImageQuant 400（GE Healthcare） に よ り バ ン ド を 検 出 し た 。
2-8) ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 に よ る EGFR 発 現 解 析
PC-6 細 胞 の EGFR 発 現 の 検 討 を 行 っ た 。 ポ ジ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル と し て PC-9 細 胞 を 用 い た 。SDS-PAGE 展 開 後 、 ゲ ル 中 の 蛋 白 質 を ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 に 転 写 し た 。 転 写 後 の ゲ ル は ク マ シ ー ブ リ リ ア ン ト ブ ル ー で 染 色 し 転 写 状 況 を 確 認 し た 。 転 写 後 の ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 は T-PBS で 数 回 洗 浄 後 、 非 特 異 的 吸 着 を 最 小 限 に 抑 え る た め 、 ブ ロ ッ ク エ ー ス に 4℃ で 一 晩 浸 透 し ブ ロ ッ キ ン グ を 行 っ た 。 次 に T-PBSで 10 分 間 3 回 洗 浄 を 行 っ た 。 そ の 後 、 抗 ヒ ト EGFR 抗 体 sc-03（1,000 倍 希 釈 ） ま た は 抗 ヒ ト β-actin 抗 体 C4（5,000倍 希 釈 ） に 4℃ 、 一 晩 浸 透 し て 抗 原 抗 体 反 応 を 行 い 、T-PBS で 10 分 間 3 回 洗 浄 を 行 っ た 。 次 い で 、EGFR に 対 し て は 10,000倍 に 希 釈 し た HRP 標 識 anti-rabbit IgG 抗 体 に 、 β-actin に 対 し て は 10,000 倍 に 希 釈 し た HRP 標 識 anti-mouse IgG (H+L)抗 体 に 、 そ れ ぞ れ 室 温 で 1 時 間 浸 透 し て 二 次 抗 体 反 応 を 行 い 、 そ の 後 、T-PBSで 10 分 間 3 回 洗 浄 を 行 っ た こ の ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 を 、 化 学 発 光 キ ッ ト Immobilon-Western
Chemiluminescent HRP reagent に 1 分 間 浸 透 し 、ImageQuant 400（GE
