The practical methods for utilization of thin-layer chromatography to the analysis ofglycerolipids from animal tissues
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(2) 九 大 農 学 芸 誌(Sci.BulLFac.Agr.,KyushuUniv.) 第26巻. 第1‑4号505‑516(1972). 薄 層 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー を 中 心 と し た 動 物 組 織 グ リセ ロ脂 質 分 析 法 の 実 際 和. 田. 正. 太 ・菅. 野. 道. 廣. The practical methods for utilization of thin-layer chromatography to the analysis of glycerolipids from animal tissues Masafuto. 1.緒. Wada. and. 言. 脂質 に関す る諸 研 究 は,こ の成 分 の 水不 溶 性,不 安. Michihiro. Sugano. を投 与 した場 合 な ど には肝 臓 摘 出前 に 肝 静 脈 を 切 断 し,注 射器 を用 い て 門脈 か ら氷 冷 した生 理 食塩 水 を注 入 し,血 液 を十 分 に放 出 させ る こ とが 必 要 で あ る,血. 定 性,分 析 法 の特 殊 性 あ るい は純 粋 な 成分 と して の 単. 液 の放 出 に よつ て 肝臓 は黄 褐 色 とな る.ラ ッ トの場 合. 離 の困 難 さな ど のた め,他 の生 体 成 分 の研 究 に比 して. 通 常20〜30mlの. か な りの 遅 れが あつ た.し か し,近 年 ガ ス クロ マ トグ. 食塩 水 を用 い れ ば十 分 で あ る.. 肝 臓 を氷 冷 した 生理 食 塩 水中で 洗 い,濾 紙 を 用 い水. ラフ ィー,薄 層 クロマ トグ ラフィ ー な ど を主 体 とす る. 分 をふ き とつ た後 ハ サ ミで 小 片 とす る,こ の 場 合,肝. 分 析 法 が 開 発 され,さ. 臓 を直 ちに凍 結 させ,メ ス を用 い て薄 片(約1mm厚. らに それ らを応 用 した 純 粋 な 脂. 質成 分 の 調 製が 可能 とな り,飛 躍 的 な進 展 を見 るに 至. さ)に 切 る方 法 は 極 め て有 用 で あ る.生 の 場 合 に はハ. つ た.. サ ミ,秤量 紙(パ. 脂 質 成 分 の分 離 ・分 析 法 に 関 して は 多 くの成 書 が あ. ラ フ ィン紙)な ど に くつ つ い て不 便. な こ とが 多 い.な お,屠 殺 後 直 ちに脂 質 抽 出が で きな. り,1)〜8)それ ら を熟 読す れ ば 一 応 の 成績 は得 られ る も. い時 に は,凍 結 させ た状 態 でN2gasを. の の,な お 細 部 につ い て は十 分 とは 言い 切れ な い の が. 器 申 一20℃. 現 状 で あ る.他 の生 体 成分 と脂 質 との 関連 性 が 深 ま る につ れ 脂 質 を取 り扱 う研 究分 野 は増 大 の一 途 をた ど り. 肝 臓59を 容 量 約70mlの ガ ラス製 ホ モ ゲ ナ イ ザ ーに と り,20〜25mlの メ タ ノー ル を加 えホ モゲ ナ イ. つ つ あ り,詳 細 な 指 導 書 の 出版 は強 く望 まれ て い る と. ズ す る.最 終 的 に は ク ロロ ホル ム:メ タ ノ ー ル の 比. ころ で あ る.当 栄養 化学 講 座 で は 脂 質 の代 謝 ・栄 養 を. (v/v)が. 充 満 させ た 容. 以 下 に 保 存す る とよ い.. ほ ぼ2:1に. な るよ うに メ タ ノー ル を用 い. でが け て きて,実 験 実施 上の諸 問題 に つ いて か な りの. る.59の. 知 見 を得 て きた.本 編 で は こ の経 験 を基 に して,動 物. か ら ク ロ ロホル ム:メ タ ノ ール(2:1)を. 肝 臓 お よ び 血清(漿)の. ゲ ナ イズ す る こ とは比 較 的 困 難 で あ る(特. 脂 質 成 分 の取 り扱 い 法,分 析. 法 な どの 実 際 を,実 例 を 示 しつ つ,特 に薄 層 ク ロマ ト ゲ ラ フ ィー の実 際 を中心 に して 詳 細 に記 載 しよ う と思 う. 質 の 抽. 出 法. 臓 脂 質の 抽 出 法. 肝 臓 な ど の組 織 か らの 総 脂 質 の 抽 出法 と し て は Folchら. た一 定 容(組 織 の20倍. 容)の. 用 す る,最. 初. 用 い ホモ に筋肉な. ク ロ ロホル ム. メ タ ノール 中 で ホ モゲ ナ イズす る方 法 は 操作 中の 溶 媒 の 蒸発 損 失 が 大 き く定 量 的 な操 作 が 難 しい.ホ モゲ. II.脂 1.肝. ど).ま. 組 織 を 用 い た場 合33m1使. の方 法9)が 推 奨 され る、 動物 を屠 殺 後,直 ち. ナ イズが 終 つ た ら回転 子 部 分 を 液面 よ り上 に あげ 緩 や か に 回転 しつ つ メ タ ノール で 洗 い,つ い で100mlの メス フラ ス コヘ メ タ ノール を用 いて 洗 い 移す.こ の 際 メ タ ノー ルは 急 速 に蒸 発 し,容 器 に ホモ ゲ ナ イズ され た 肝 臓が 強 く付 着 して とれ 難 くな るの で,ホ モゲ ネ ー. に肝臓 を摘 出す る.通 常 の 実 験 で は肝 臓中に 残 存す る. トが 乾燥 す る前 に 速や か にメ タ ノール で 洗 い落 して や. 血液 は脂 質 分 析 上問題 とな らな いが,放 射 性 同 位元 素. る.必 要量 の メ タ ノー ルで ホ モゲ ナ イザ ー か ら完 全 に.
(3) 内容 物 を洗 い 移す こ とは困難 で あ るか ら必 ず し も全 部. を用 い て 内容 液 をFig.1に. を移 す 必 要 はな い.つ. へ 移 す.有 機 溶 媒 を用 いて の この よ うな 洗 い移 し操 作. い で クロ ロ ホル ム 約10mlを. 示す よ うな 減圧 濃 縮 装 置. ホ モゲ ナ イザ ー に加 え再 び ホ モゲ ナ イズ し内容 をメ ス. 時 には容 器 の 口部 へ溶 媒 がcreapingす. フラ ス コへ 移す.こ の ク ロ ロホル ムで の ホ モゲ ナ ィズ. られ な い ので,こ の部 分 も十分 に洗 うこ とが 必 要 で あ. る こ とは さ け. 操 作 を少 な く と も3回 く り返 せ ば 定量 的 に メ ス フ ラス. る.. コへ 移 る. クロ ロホ ル ム を メ ス フ ラス コの 首 部 の立 ち上 り部 分 のす ぐ下 まで 加 え,内 容が 首 部 へ 余 り上 らな い よ う注 意 して 混 和す る.さ らに クロ ロ ホル ム を首 部 の 立 ち上 が り部 分 まで 追 加 す る.つ いで37〜40℃ 温す る.室 温 まで 冷 却 した後,ク. で30分. 加. ロ ロホル ム を標線 ま. で加 え る.十 分 に 混 和 し,東 洋 濾 紙No.2を. 用 い. 100m1容 の有 栓 シ リンダ ーへ 濾 液 を集 め る.濾 過 速 度 は極 めて 速 いが,夏 期 に は溶 媒 の 蒸 発 を可 及 的 に避 け るこ とが 必要 で あ る(濾 液 は通 常86〜88m1).濾 に20%容. 液. の水 を加 え 水で 濡 らした栓 を して しば ら く. 置 く.つ いで 栓 を強 く抑 えて3回 ゆつ く りと 「てん と う」 させ て 混和 す る.水 を加 えた 後,直 ち に混 和す る と発 熱 して しば しば 内容 物 が 吹 き出す こ とが あ る.急 ぐ時 には 急冷 させ るか,あ るい は水 を加 え た後 栓 を し ない でswirlingし. て混 和 させ て か ら 「て ん と う」 し. 振 と うす る とよい.低 温 室 に一 夜 放置 す れ ば二 層 に分 れ る(上 層 と下層 の 割合 は ほぼ4:6で. あ る).な お,. 抽 出 濾 液 の一 定 容 を共 栓 の遠 沈 管 に と り,そ の20% 容 の 水 を加 え同様 の操 作 後,3000r,p.m.,10分 分 離 して やれ ば ご 層 に分 離 す るので,急. 遠心. ぐ場 合 に は こ. の 方 法が よ い.し か し,遠 心 分離 後 放 置 して お くと比 較 的 短 時 間で 下 層 が 濁つ て く る こ とが あ るので 早 急 に 以 下 の操 作 に付 す こ とが 必 要 で あ る. 5〜10ml容. の 駒込 ピペ ッ トを用 い上 層 の大 部 分 を. Fig. 1. An example of glass joint evaporator used in our laboratory. The rubber tubing-joint part may be replaced by the glass-joint. 35〜40℃. の温 浴 中 でN2gasを. 通 じなが らアス ピ. に細 く し た 駒 込. レー ター を用 い減 圧 で溶 媒 を蒸 発 させ る.ク ロ ロホル. ピペ ッ トを用 い 上 層 をで き るだ け取 り除 く.容 器 の 大. ムが 蒸 発す る と少 量 の 水が 残 るが,こ れ は少 量 の メ タ. き さ,「 てん と う」 混 和 の 程 度 な ど に よつ て二 層 間 に. ノ ール を加 え て さ らに濃 縮 を続 け れ ば 完 全 に 乾 固 す. 白いfluffが 生 ず る こ とが あ る.こ の場 合 に はfluffは. る.こ の メ タ ノール 添 加 は1〜2回. 下 層 と共 に残 す.な お,下 層 の ガ ラ ス壁 部分 に水 滴 が. お,メ. 付 着 して 残 る こ とが あ るが,こ れ は上 層 を 取 り除 く前. が か か るので この 操 作 を勧 め る.完 全 に乾 固 した ら駒. にゆ るや か にSwirlingし. 込 ピペ ッ トを用 い,石 油エーテル を ア ス ピ レー ター接. 除 き,つ いで 先 端 を 内径 約1mm位. 層 を取 り除 いた 後,さ phasesolvent(ク 48:47)を. て や る と浮 上 して くる.上 らにFolchら. のpureupper. ロ ロホル ム:メタノール:水,3:. 用 い て下 層 に乱 れが 生 じな い よ う注 意 して. 必要 で あ る.な. タ ノール を加 え な いで も水 は蒸 発 す るが,時間. 続 部 か ら吹 き込 み,同 時 に摺 り合 わせ 部 分 と毛 細管 部 分 も十 分 に洗 つ て 付着 す る脂 質 を 濃縮 フ ラス コへ 洗 い 落 す.乾 固が 完 全 で あれ ば 石 油エーテル 不 溶 の 蛋 白質. 栓 お よび 容 器 壁 を洗 い落 し,上 述 の方 法 で取 り除 く操. は沈 で ん し(あ るい は器 壁 に付着 した ま ま),黄. 作 を2回. 明 の 液が 得 られ るが,し ば しば 蛋 白質 が 微 細 に な り浮. く り返す こ とが 望 ま しいが,通 常 の分 析 実 験. で は こ の操 作 は省 略 して も影 響 はな い.. 色透. 遊 す るこ と もあ る.こ の場 合,水 分 の除 去 が完 全 で な. 上層 を取 り除 いた 後,栓 お よび 器 壁 を 少量 の メ タ ノ. い と石 油エーテル で 脂質 を定 量 的 に溶 解 す るこ とはで. ルで 洗 い,Swirlingし. きな い.. て 混和 した 後,メ. タノー ル ー.
(4) つ い でG4ガ. ラス フ ィル ター を用 いて25m1の. メ. 注 意 して保 存 して も1週 間後 には 脂肪 酸 組 成 に か な り. ス フ ラ ス コに濾 液 を集 め る.こ の 際,メ タ ノー ルで の. の変 化が 認 め られ る.N2gasを. 洗 い移 しの場 合 よ りさ らに石 油エーテル. 中で の保 存 法 もあ るが,い ず れ にせ よ早 急 に分 析す る. のcreaping. に注 意 し十分 に洗 つ て や るこ とが 必要 で あ る.ま た駒 込 ピペ ッ トを用 いて 移す こ と も勧 め られ る.濾 過が 終 れ ぱ 石 油エーテル を標 線 まで 加 え る.こ の液1m1は 肝 臓agに. こ とが 望 ま しい. III.薄. 層 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー に よ る 脂 質 成 分 の 分 別 法. 相 当す る.. 薄 層 ク ロマ トグ ラ フ ィーの 開 発 は脂 質 の 分 別 法 に画. ・(9)‑5Xb/100×1/25‑316. b:ク. 充 満 させ た ア ン プル. 期的 な 進 歩 を もた ら した と言 え る.カ ラ ム ク ロマ トグ. ロ ロホ ル ムー・メタ ノー ル抽 出 液 のml数. ラフ ィー と比 較 して,多 量 の 脂 質 を分 別 す る際 の不 利 次 項 に 紀す よ うに,石 油エーテル 中で は脂 質 は余 り 安 定 で な い ので,溶 液が 得 られ た ら直 ち に分 析 に供 す. を除 けば,分 別 法 と して殆 ん どす べ て の点 で 明 らか に 優れ た 方法 で あ る.現 在 で は,生 体脂 質 成 分 の分 別,. べ きで あ る,石 油エーテル を用 い る理 由の 一 つ は こ の. 単離 は この薄 層 ク ロマ トグ ラ フ ィー に よつ てす べ てが. 溶媒 が 極 め て容 易 に蒸 発す るた め,サ ンプ リング後 の. 可 能 で あ る といつ て も過 言 で はな い.. 諸 操 作 に 有 利で あ るた めで あ る.反面,こ ら一 定量 を取 つ. の抽 出 液か. 分 析 に供 す る場 合 に は,標 線 まで 加. 1.プ. レー トの調 製 法. 通 常 用 い られ るガ ラス板 は厚 さ3mmの20×20cm. えた ら直 ち にサ ンプ リン グ しな けれ ば な ら な い.な. の もの で あ るが,こ の他5×20cmの. お,こ の 溶 液 を‑20℃. る.20×20cmの. 位 で 保存し て お くと しば しば. 不 溶 物 が 生 じ る こ とが あ る.. (Merck製. 肝 臓 以外 の組 識 か ら も同様 の手法 で 脂質 を抽 出す る. もの も有 用で あ. プ レー トを用 い る場 合 の シ リカゲ ル. シ リカゲルGお. 量 はTable10)と. よびH)お. よび 水 の 必 要. お りで あ る.. こ とが で き る.特 に,試 料 が 少 展 しか得 られ な い場 合 に は,遠 心分 離 の方 法(前 出)に 従 う とよい.濾 過 に. Table. 1.. 際 して 濾紙 上 の残 渣 お よ び メス フ ラ ス コ内容 を ク ロ ロ ホル ムー メ タノ ール(2:1)で十分. に洗 つ て やれ ば. Relationship between the amount of silica gel and water suitable for preparation of thin-layer plates (20x20 cm).. 脂 質 の 全 はを定 量的 に抽 出す る こ と も可能 で あ る. 2.血. 清(血 漿)脂 質 の 抽 出 法. Sperry,Brand法10)が. 推 奨 され る.100mlの. フ ラ ス コ中 に メ タ ノー ル33m1を 血 清5mlを. 入れ,振. メス. りな が ら. 滴下 す る と 血清 は微 細 な 粒 子 を 形成 す. る。急 速 に 血 清 を加 え る とフ ラ ス コ底部 で 蛋 白質が 付 着 す る こ とが あ る.ク ロ ロホル ムを 加 え,以 下 肝臓 脂 の 抽 出 法 に従 い操 作す る. 3.脂. 質. 質 抽 出液 の保 存 法. スプ レ ッダ ー はDesagatypeの. 500ml容)に. 上述 の 石 油エーテル を脂 質 の溶 解 溶 媒 として 用 い る. もの を用 い るのが. 番 容 易 で あ る.必 要 量 のゲ ル を三 角 フ ラス コ(300〜 一 と り,必 要 量 の水 を加 え,栓(ゴ. ム栓 に. パ ラフ ィル ムあ るい は アル ミホ イル をかぶ せ た もの). の は,そ の 沸点 が 低 く蒸 発 し易 いた め,一 定 容 を とつ. を し,激 し く振 る(約20〜30秒).ゲ. て分 析 す る際 に時 間 の 節 約が で きるた めで あ るが,十. は種 々の 方 法が あ るが,こ の方 法 が 最 も簡 単 で,確 実. 分 に精 製 した石 油エーテル を用 いて も,‑20℃. に均 一 な ゲ ル サ ス ペ ン ジ ョン を得 る こ とが で き る.直. で1. ル と水 の 混 和 に. 週 間以 上 保 存す ると脂 質 抽 出液 の 色調 の 変 化 が 著 し. ちに スプ レ ッダ ー に移 し,一 定 速 度 で ス ライ ドして 薄. く,ま た 脂 質 の酸 化 も大 きい.脂 質 の 溶解 性 を考 え る. 層 を調 製 す る.プ. と き,最 も推 奨 で きる溶媒 は クロ ロホ ル ム(特 級 品 に. 後,所 定 の 温度 で 加 熱 活 性化 す る.急 ぐ時 には 扇 風機. N2gasをbubblingし. で弱 い風 を送つ て や る とよ い.水 分 の 残 りが 多 い と,. た もの)で あ る.こ の場 合,. 遮光 して 空 気 との接 触 を さけ,‑20℃. レー ト乾 燥 用 棚 に 入れ,一. 夜放 置. 以下 で 保 存す. 加 熱乾 燥 中に 生 じた水 滴 が棚 の上 段 の プ レー トの 裏 面. るこ とが 必 要 で あ る。 種 々 の脂 質 成 分 が 同時 に存 在す. につ き,下 段 の プ レー トの膜 面 に落 ちて くる こ とが あ. る場 合 は,脂 質 は比 較 的 安定 で あ るが,単 離 す る と極. る.特. めて 不 安 定 とな る,た とえ ば,肝 臓 セ フ ァ リンは十 分. で,そ の よ うな時 に は棚 に少 々傾 斜 をつ けて 加 熱 乾 燥. に,1mm厚. さのプ レー トの 場合 に起 こ るの.
(5) す れ ば よい.加 熱 乾 燥 が す んだ ら直 ちに乾 燥 容 器 に入. の ス ポ ッ トが 得 られ るよ うな 毛細 管(外 径 約0.8mm). れ る,市 販 の 乾 燥 容器 は比 較 的熱 に弱 く,気 密 性 に乏. を選 ぶ.石 油エーテル の場 合 に比 ベ ク ロ ロホル ムを 用. しい ので,大 型 デ シ ケ ー ター を用 い る と便 利 で あ る.. い る場 合 に は や や大 き 目の毛 細 管 が 上記 の ス ポ ッ トを. 乾燥 剤 は特 別 な場 合 を除 き,シ リカゲ ル(乾 燥 用)を. 打 つ の に よ い よ うで あ る,1mm厚. さの プ レ ー トの場. 用 い る.. 合 には,ス ポ ッ トの径 が5mm位. まで 大 き くす る の. 硝 酸 銀 含 有 プ レー トを調 製す る際 も,ゲ ル量 と水量 (硝酸 銀 溶 液)は 前 記 と同 様で あ るが,下 記 の点 に注. が よ く,多量 に スポ ッ トす る と きに は0.5mlの. ホー. ル ピペ ッ トを用 い る とよ い(厚 い プ レー トほ ど分 離 能. 意 を要 す る.硝 酸 銀 溶 液 を 用 い る と,通 常 の ク ロ ムメ. は劣 るよ うで あ るが,1mmの. ッキ した ス プ レ ッダー は 比 較 的短 期 問 の使 用 で メ ッキ. スポ ッ トを大 きく打 た な い と調 製 用 と しての この プ レ. が はげ,エッ. ー トの 意 味が な い.事 実,2mm径. ジ部 分 が 侵 され る.ス プ レ ッダ ーの 痛 み. プ レー トの 場 合 に は,. 位 の ス ポ ッ トを打. が ひ ど くな る と金 属 が 薄 層 上 に浮 遊 して くる.こ の た. てば,脂 質 は極 めて 少量 しか負 荷 で きな い).な. お,. め特 殊 の ス プ レ ッダー が 必要 とな る.外 国で 市販 され. スポ ッ トす る脂 質 の 濃 度 は薄 い ほ どよ いが,余. り低 濃. て い る プ ラス ヂ ッ ク製 の ス プ レ ッダ ー は重量 が 軽 い. 度 過 ぎ る とス ポ ッ ト回数 が 多 く時 間 を要 す る,. た め均 一 な 薄 層 をつ くるの にか な りの 技術 を 要す る.. 線 と して ス ポ ッ トす る場 合 に は,隣 り合 うス ポ ッ ト. 銀 メ ッキ した スプ レ ッダ ー の使 用 も推 奨 され るが,次. の 外 縁 が ほぼ 接 す るか,少 々重 な る位 の 間隔 で 連 続 ス. の よ うな 方 法で 十 分,長 期 間使 用 で き る.即 ち,ス プ. ポ ッ トし,2回. レ ッダー の ゲ ル充 て ん 部 分 に 固体 パ ラ フ ィン を溶 融 し. の 間 に打 ち,3〜4回. て均 一 に薄 く コー トす る.こ の際,エ. 濃 厚 な 溶 液 を用 いた 場 合 あ る いは 打 ち過 ぎの 場 合 に は. ッジ 部分 には パ. 目に は 第1回 日の ス ポ ッ トと スポ ッ ト く り返 し スポ ッ トす る とよ い.. ラフ ィンが 付 か な いよ うに注 意 す る.硝 酸 銀 プ レー ト. 2回 目以後 の スポ ッ ト時 に溶 媒 の拡 が りに ム ラを 生ず. を 調製 した ら直 ち に十 分 水 洗す る こ とが 必要 で あ る.. る.定 量 的 に スポ ッ トす る場 合 に は 少量 の溶 媒 に 溶か. Solventfrontで. は成分 が横 に広 が る傾 向が あ るの. で,ス ポ ッ トは18cm展. 開す る場 合 に は プ レー トの. 両横 端 か ら少 な くと も1.5cmは. な して打 つ こ とが 必. 要 で あ る.ま た各 スポ ッ トの間 も少 な く と も1.5cm は あ けな い と隣 同志 のoverlapが 2.中. 起 こ る,. 性 脂 質 の 分離11). 110〜115℃. した 脂 質 を全 量 スポ ッ トした の ち少 量 の溶 媒 で 残 存す る脂 質 を溶 か し再 スポ ッ トす る.こ の操 作 を少 な く と も3回 く り返 せ ば 定 量的 に スポ ッ トす るこ と が で き る. スポ ッ トが 終 り,外 見 的 に溶 媒 が 蒸発 した ら展 開 を な う(溶 媒 は必 ず し も完 全 に とばす 必 要 はな く,む行. で1時間 加 熱活 性 化 した シ リカゲ ルG. しろ 脂質 の酸 化 を抑 え る上 か ら も完 全 に溶 媒 を追 い 出. の プ レー トを 用 い る.温 度,時 間 は厳 密 で な くて もよ. す こ とは望 ま し くな い).石. い,厚 さ1mmの. 酢 酸(82:18:1)で. プ レー トを用 い る 時 に は1.5〜2. 時 間加 熱 す る.十 分 に加 熱 す るこ とが 肝 要で あ る.加. 15:1位. 生 ず る.一 旦活 性 化 した プ レー トは デ シ ケ ー ター 中 に. せ ばRf値. 保 存 す れ ば 長期 使 用 に耐 え る,0.5mm厚. で.ス. さの プ レー. ー テル:. 展開 を行 な う.夏 期25℃. の場 合 に は石 油エーテル:エ. 熱が 不 十 分 で あ ると,デ シ ケ ー ター に 入れ た 際 水 滴が. 油エーテル:エ. にす る と分 離 が よい.エー が 低 くな る.展. 以上. ー テ ル:酢 酸 の 比 を85: テル の 割 合 を減 ら. 開(上 端 よ り1cm下. ポ ッ トす る 位 置 は下 端 か ら1cm上. ま. で あ るの. トを用 い る場 合 に は,プ レー トを机上 水平 に お き1. で,約18cm展. cm幅. レー トに風 を送 つ て溶 媒 を とばす(完 全 に とば さな く. あた り脂質 量1〜1.5mgを. 連 続 ス ポ ッ トす る.. 開 した こ とに な る)が 終 了 した らプ. 点で スポ ッ トす る よ り,線 として ス ポ ッ トす る方が 分. て もよ い).ス. 離 は一 般 に優 れ る.ス ポ ッ ト量 はプ レー トの 厚 さに応. と きに はN2gas下. じて 調 節 す る.ス ポ ッ トに は手 製 の ガ ラ ス製 毛 細 管が. ッ トな ど通 常 の 実 験 動物 の 組 織 脂質 で は迅 速 に 処理 す. 最 も便 利 で 肉薄 の ガ ラス管 を用 い て作 ると よい.毛 細. れ ば それ 程 の 注 意 は い らな い よ うで あ る.酢 酸 は風 を. 管 を切 るに は折 りまげ た紙 ヤ ス リで軽 くこす つ てや れ. 送 つ て も十 分 には とば ない が,そ. ば容 易 に切 れ る,金 属 性 の ヤ ス リで 切 るこ とは 難 し. い,溶 媒 除去 後,直 ち に2',7'‑dichlorofluorescein. い.切. 溶 液(0.2%2',7'‑dichlorofiuorescein95%エ. り口は軸 に対 して直 角 にす る こ と.. 毛 細 管 の大 きさ はプ レー トの 厚 さの みな らず,脂 質. ポ ッ トを打 つ 時 お よび 溶 媒 を追 い 出す で行 な うこ とが 望 ま しいが,ラ. れで も差支 えは な. タ. ノー ル溶 液.最 初 に必 要 量 の 水 に溶 解 し所 定 の濃 度 に. を溶 解 した 溶媒 の種 類 に よつ て 選 ぶべ きで あ る.た と. す る こ と,種 々の 発 色剤(検 出 液)の. えば,0.5mm厚. も使 い易 い)を スプ レイす る.風 を送 つ て発 色 剤 の溶. さのプ レー トの場 合,直 径2mm位. うちで これ が最.
(6) Fig. 2.. Thin-layer. chromatograms-(1). Solvents and lipids applied were : a ; Petroleum ether-diethyl ether-acetic acid (82 : 18 : 1). Liver total lipids. b ; Petroleum ether-diethyl ether-acetic acid (30 : 70 : 1). Hydrolysis pruducts by steapsin of liver triglyceride. c ; Chloroform-acetone (96 : 4). Samples similar to b. d ; Cyclohexane-benzene (5 : 1). Plasma total lipids. e ; Cyclohexane-benzene (4 : 1). Plasma total lipids. f ; Chloroform-methanol-water (65 : 25 : 4). Liver total lipids. g ; Chloroform-methanol-acetic acid-water (25 : 15 : 4 : 2). Liver total lipids. Abbreviations used were : EC ; esterified cholesterol, TG ; triglyceride, FFA ; free fatty acid, DG ; diglyceride, FC ; free cholesterol, PL ; phospholipid, MG ; monoglyceride, PA ; phosphatidic acid, PE ; phosphatidylethanolamine, PC ; phosphatidylcholine, SPH ; sphingomyelin, LPC ; lysophosphatidyl choline, PS ; phosphatidylserine PI ; phosphatidylinositol, NL ; neutral lipids, Pg ; pigments. S, M, D, Tra, P and H represent saturated, monounsaturated, diunsaturated, saturated, pentaunsaturated and hexaunsaturated fatty acids, respectively.. tetraun-. 媒 を大 部 分 とば せ ば 肉 眼で も分 離 され た脂 質 の バ ン ド. よ い.し. が 見 え る.U.V.(紫. 外 線)下 で はよ りはつ き りと見. 脂 質 な ど 不 飽 和 度 の 高 い 脂 質 か らI2を. え る.下 部 約1/3(遊. 離 脂肪 酸 画 分 の下)ま で 酢酸 が. 乾 後40〜50℃. して わ り,こ の 部 分 は フル オ レ ッセ イ ンで の 発上昇 色 は極 めて低 いが,U.V.下. れ ば プ レー トを光 にす か し てみ るだ けで も確 認 で き る し,ま た 発 色 させ な くて もU.V.下. で 十 分 に検 出 で. きる,な お,分 離 の 状 態 はFig.2‑aに. 示 す 通 りで あ. る.こ の 方 法で の分 離 効率 は コ レス テ ロール エ ステ ル (こ の 両 分 と色 素 類 との分 離 は よ くな い)を 除 いて 各 脂質 につ い て98%以. 上 で あ る,. され た 脂 質 中 α)放射 能 活 性 をゲ ル の 存 在 下で 計 測 す る 場 合 な ど)に は,プ レー トをI2を. 含 むchamberに. 人れ れ ば 明 瞭 な着 色 が 見 られ る.こ の 場 合,酢 酸 の 残 存 は着 色 に 影響 しな い.但. し,余. り強 くI2を. な か な か とび 難 い ので,各. 吸収 さ. 脂質成分の存. 在 位置 が 可 能 な程 度 の で き るだ け弱 い着 色 を行 な う と. とぶ が リン とば す に は 風. に 加 温 し て や る と よ い.. リグ リセ リ ド,ジ. グ リ セ リ ド,モ. ノグ リセ リ. ドお よ び 遊 離 脂 肪 酸 の 分 離12)13) こ の 方 法 は ト リ グ リセ リ ド を リパ ー ゼ で 加 水 分 解 し た 際 の 生 成 物 の 分 離 に 適 用 で き る.プ ポ ッ トの 方 法 はIII‑2と テ ル：ニエ ー テ ル:酢 1)を. 酸(80:30:1あ. 用 い る.Fig.2‑bに. る.80:30:1の. レ ー トお よ び ス. 同 じ で あ る.溶 媒 は 石 油 工ー る い は30:70:. 示 す よ う な 分 離 が 得 られ. 場 合,酢. 酸 は1・3‑ジグ. 1・2‑ジグ リ セ リ ドの 間 ま で 上 昇 す る.フ. 色 素 をス プ レイす るこ とが 望 ま し くな い場 合(分 離. せ る とI2が. 3.ト. で は独 特 の螢 光 を発 し容 易. に確 認 で き る.な お ト リグ リセ リ ドの位 置 は量 が 多 け. ば ら く風 乾 す れ ば 殆 ん ど のI2は. リセ リ ド と ル オ レ ッセ イ. ン で 検 出 す る. な お,シ. リ カ ゲ ルGを2%の硼酸. ッ ド し,110℃,2時 ロ ロ ホ ル ム:ア 2‑cに. を含 む水 で ス プ レ. 間活 性 化 した プ レー トを 用 い ク セ ト ン(96:4)で. 示 す よ う に,1一. 離 能 が 優 れ て い る.14). お よ び2‑モノ. 展 開 す る と,Fig. グ リセ リドの分.
(7) 4.コ. レ ステ ロー ルエ ステ ル の 分離. a)総. 5,リ. ー トお よ び ス ポ ッ トの 方 法 はIII‑2と プレ あ る.溶. 媒 に は シ ク ロ ヘ キ サ ン:ベ. 用 い,約10cm展. 同 じで. 離 が 得 ら れ る.この ま で 上 昇 す る.な. よ うな分. 方 法 で は 色 素 類 はsolventfront お,冬. い 分 離 が 得 られ る,逆. が. 度 展 開す れ ば よ. に 溶 媒 の 割 合 を4:1と. して も. b)各. コ レ ス テv一. 方 法 と 岡 じ もの で よ い が,0.5. 上 厚 い も の で は 分 離 が よ く な い.厚. mmの. プ レ ー トが よ い.ス. く 打 つ こ とが 必 要 で あ る(径1.5mm以. る.展. 下).シ. セ イ ン で 検 出 さ れ る.分. サ ン:ベ. ン ゼ ン(4二1)の. る 比 率 で あ つ て,夏 3.5:1位. 開 す. の み な らず 分 離 の. 程 度 は 著 し く 変 動 す る の で 注 意 を 要 す る.シ. ク ロヘ キ. 割 合 は15〜17℃. 期 に は5:1位. テ トラ エ ン エ ス テ ル のRf値. お,各. 展 開 後,プ. 温17℃. 行 な う と よ い.分. 用 い る.展. 離 はFig.2‑eに. 媒 蒸 気 で 飽 和 し て お く.ク. 同 じで あ る.展 酸 二水(25:. ロ ロ ホ ル ム:メ. タ ノ ー ル:. 紙 を 貼 ら な い と プ レ ー ト中 央 部 で. は か な り低 く な る の で,こ. 中 央 部 約3cm幅. の よ うな場 合 に は. は ス ポ ッ ト し な い 方 が よ い.フ. ル オ. 分 離 の 状 態 を示. の 方 法 に よ る ラ ッ ト肝 臓 ミ ク ロ ゾ ー ム で の 結 果. をTable2に. Table. 示 す.. 2.. Concentration components somes.. 媒 臭が. of. of rat. phospholipid liver micro-. の 対. 目の 展 開 を. 示 す と う りで あ. コ レス テ ロール エ ス テル. の 濃 度 が 比 較 的 低 い 組 織 の 場 合 に は,分. 度活 性 化. 開 槽 は予 じ め濾 紙 を貼 つ て 溶. す.こ. 展 開 す る.こ. 追 加 混 和 し て 第2回. る.な お,肝 臓 な ど の 脂 質中で. 15:4:2)を. 上 で あ る.. に も う1回. 熱 活性 化 は. タ ノ ー ル:酢. コ レ ステ ロ. 以 下 の 場 合 に は 展 開 溶 媒120m1に. しベ ン ゼ ン 約4m1を. に 耐 え る.ス ポ ッ ト0)打 ち 方 はIII‑2と 開 溶 媒 は ク ロ ロ ホ ル ム:メ. な る よ うに. 離効. の 場 合,加. し た プ レ ー トは デ シ ケ ー タ ー 中 に 保 存 す れ ば 長 期 使 用. レ ッ セ イ ン で 検 出 す る.Fig.2‑gに. レ ー ト を 展 開 槽 か ら 取 り出 し,溶. な くな る ま で 風 乾 し,更. レ ー トに よ る方 法20). 用 い る.こ. のRf値. 均 一 な プ レ ー トを 使 う よ う留 意 が 必 要 で あ る.分. 示す と う り. を 厳 守 し な け れ ば な ら な い.一. 期には. ー ル エ ス テ ル の 分 別 に は 出 来 る だ け ム ラや ス ジ の な い. 率 は 各 エ ス テ ル に つ い て95%以. よ し、.フ ル オ レ ソ. 離 はFig.2‑fに. 液 で ス プ レ ッ ドし た プ レー ト. 水 系 で の 展 閉 時,濾. ず れ に し て も,. が 約O.35に. す れ ば 分 離 は 極 め て 良 好 で あ る.な. リ カ ゲ ルHプ. で用い. ま で,冬. ま で 変 え る 必 要 が あ る.い. ロロ. し め ら し,. で あ る る.. 110℃,60分. クロ. 用 い18cm展. 閉 溶 媒 の 極 性 に よ つ てRf値. 同 じ.展. じ め 展 開 溶 媒(ク. 開 溶 媒 は 夏 期 に は100:35:5.5が. (シ リカ ゲ ルH)を. さ0.25. ポ ッ ト はで きるだ け 小 さ. ヘ キ サ ン ニベ ン ゼ ン(4:1)を. トの 方 法 はIII‑2と. タ ノ ール:水,65:25:4)で. 2mM‑Na2CO3溶. ル エ ス テ ル の 分 離16)17). mm以. 際,室. ホ ル ム:メ. b)シ. よ い.. プ レ ー トはIII‑2の. レ ー トに よ る方 法19>. 槽 内 を 溶 媒 蒸 気 で 飽 和 し て お く こ とが 必 要 で あ る.展. 期 特 に 低 温 の 場 合 にRf値. 低 過 ぎ る と き に は そ の ま ま 風 乾 し,再. リ カ ゲ ルGプ. プ レ ー トお よ びスポッ. 開 槽 の 両 面 に 濾 紙 を 貼 つ て,予. ン ゼ ン(5:1)を. 開 させ る と,Fig.2‑dの. ン脂 質 の 分 離. a)シ. コ レ ス テ ロー ル エ ス テ ル の 分 離15). 別 に先 だつ て. Phosphatidylethanolamine Phosphatidylinositol+ Phosphatidylserine Phosphatidylcholine Sphingomyelin Lysophosphatidylcholine. 予 じ め シ リカ ゲ ル の カ ラ ム ク ロ マ トグ ラ フ ィー あ る い はIII‑4‑aの. 方 法 で 総 エ ス テ ル を 集 め る 必 要 が あ る.. 血 清 の 場 合,0.5mmプ 0.5m1に. レ ー トで は,ラ. 相 当 す る 脂 質 を,ヒ. す る 脂 質 を3cm幅. に ス ポ ッ トす れ ば よ い.12に. 検 出 で は こ の 量 で 十 分 で あ る が,フ 用 い る 場 合 に は,飽. ッ トの 場合. トで は0.3m1に. 相当 よる. ル オ レ ッセ イ ン を. 和 お よ び モ ノ不 飽 和 エ ス テ ル の 分. 離 が 明 瞭 に 検 出 し 難 い の で,こ. れ よ り多 目 に ス ポ ッ ト. す る 必 要 が あ る. な お,硝. c)レ 5‑a)と. べ て の エ ス テル を. 1回 の 展 開 で 分 別 す る こ と は 難 し い.. シ チ ン お よ び リゾ レ シ チ ン の 分 離21) 同 じ方 法 で,ク. 水(60:40:5)で は 高 く,ま. 酸 銀 含 有 プ レ ー トで 各 エ ス テ ル を 分 別 す る. 方 法18)は 分 離 能 は 優 れ て い るが,す. Male Wistar rats weighing 260-280 g and fed on a commercial pellet (Oriental Rat Chow NMF) were used. Phospholipids were separated into their components by the method of Skipski et a!.20>. タ ノ ー ル:. 展 開 す れ ば リゾ レ シ チ ン のRf値 た レ シ チ ン と の 分 離 状 態 も よ い.レ. を ホ ス ホ リバ ー ゼAで 用 す る.. ロ ロ ホ ル ム1メ. シチ ン. 分 解 した 際 の生 成 物 の 分 離 に適.
(8) 6.脂. 肪 酸 メチ ル エ ス テ ル の不 飽 和 度 に よ る分 離22). シ リカゲ ルG40gを10gのAgNO3を m1の. 含 む85. 水 で サ ス ペ ン ドして プ レー トを 調 製 す る(厚 さ. 0.5mm以. 下).110℃. で2時 間 活 性化 す る.AgNO3. ト し な い こ と.試. 料 の ト リグ リセ リ ド は ク ロ ロ ホ ル ム. 溶 液 と し て で き る だ け 小 さ く ス ポ ッ ト す る.分 Fig.3‑b,cに. 示 す.こ. レ オ イ ル 型(SD2型)の. ト リグ リセ リ ドま で は 明 瞭 に. は シ リカゲ ル と共 存 す る と きに は光 に対 して の 安 定性. 分 別 さ れ る.SD2型. が 増 す よ うで あ るが,で. ま で は こ の 条 件 で か な り よ く分画 で き る(S;飽. で あ る.特. に,加. き る限 り遮 光す る こ とが 必要. 熱 活 性 化 時 に注 意 を要 す る 。Ag+. 肪 酸,M:モ. 離 は. の 条 件 で パ ル ミ トイ ル ジ リ ノ. ト リ グ リセ リ ドの 他MD2,SMTri. ノ 不 飽 和,Dニ. 和脂. ジ 不 飽 和,Tri:ト. リ不. を 含 むプ レー トを用 い る場 合 に は,ス ポ ッ トを打 つ と. 飽 和).こ れ よ り総 不 飽 和 数 の 多 い ト リ グ リセ リ ドの 分. きに も可 及 的 に光 に当 た らぬ よ うにす る.ベ ニ ヤ板 製. 別 に は3〜10%メ. の カバ ー な ど を用 い る と便 利 で あ る.展 開 槽 は 黒 布で. い る と よ い が,ア. 包 み遮 光す る.以 下,Ag+プ. 和 酸 を 含 む ト リグ リ セ リ ドを 各 分 子 種 に 分 離 す る こ と. レー トの 場 合,こ. の点. に十 分 注 意す るこ と。. (80:20)を. 開溶 媒 は石 油エーテル1エ. 規 い るが,温 度 によ りRf値. ー テル お よび 分 離. の 程 度が 変 るの で,エ ー テル の 割 合 を増 減 す る必 要 が あ る.分 離 はFig.3‑aに 7.ト. 示 す.. 状態 で 風 乾 後120℃. と え ばpentadecanoicacid,. Cl5:0)を. リグ リ セ リ ド10〜15mgか. 一 定 量(ト. 別 され た 各 分 子 種 に 対 し 約250μg)加. 下),遮 光 した. で2時 間 加 熱 活 性化 す る.0.8%. 8.ジ. 記 す.. グ リ セ リ ド分 子 種 の 分 離26). シ リ カ ゲ ルGを6%(w/v)のAgNO3を で ス プ レ ッ ド し たプレー 下),130℃. ロ ロ ホ ル ム ニエ タ ノー ル(94:6).温. で2時. 含 む水. トを 用 い る(厚. を展 開溶 媒 と して 用 い る.プ レー ト中央部 に は ス ポ ッ. Thin-layer. え てや れ ば 分. ッ ト肝 臓 ト リ グ リセ リ ド. メ タ ノール(特 級 品)を 含 む ク ロ ロホル ム(特 級 品). Fig. 3.. ら分. 離 の 程 度 は 完 全 で な くて も 各 分 子 種 の 濃 度 を 計 算 に よ. で の 分 析 値 の 一 例 をTable3に. 含 む水 とシ リカ ゲルG. で プ レー トを調 製 し(厚 さ0.5mm以. 際 し て 標 準 物 質(た. り求 め る こ と が で き る.23)ラ. リグ リセ リ ド分 子 種 の 分 離23). 16%(w/v)のAgNO3を. ルムを 用. は 極 め て 困 難 で あ る.24)25)こ の 方 法 で は 分 別 後 抽 出 に. 試 料 は クロ ロホ ル ム溶 液 と して 出来 るだ け 小 さ くス ポ ッ トす る.展. タ ノ ー ル を 含 む ク ロvホ. ラキ ドン酸 あ るい は それ 以上 の不 飽. さ0、5mm以. 間 加 熱 活 性 化 す る.展. 開溶媒 は ク. 度 の高 低 に よ り. chromatograms-(2).. Solvents and lipids applied were : a ; Petroleum ether-diethyl ether (80 : 20). Fatty acid methyl esters from liver triglyceride. b and c ; 0. 8 % and 3. 0 % methanol in chloroform, respectively. Liver triglyceride. d ; Chloroform-ethanol (94 : 6). Diglyceride prepared from liver lecithin by means of phospholipase C. e ; Chloroform-methanol-water (60 : 30 : 5). Liver lecithin. f ; Chloroform-methanol-water (55 : 35 : 7). Liver cephalin. For abbreviations see Fig. 2. Lecithin and cephalin (e and f) were separated according to the degree of unsaturation of the fatty acids combined at the 2-position on the molecules..
(9) Table. 3.. Fatty. acid. composition. of triglyceride. species. of rat. liver.*. Male Wistar rats weighing 250-260 g and fed on a commercial pellet (Oriental Rat Chow NMF) were used. Hepatic triglyceride was separated into the molecular species by using a 0.8 % methanol in chloroform mixture as developing solvent. * Abbreviations used were : S ; saturated fatty acids , M ; monounsaturated, D ; diunsaturated, Tri ; triunsaturated. tr ; trace. unk ; unknown. Figures in parentheses represent number of unsaturation. t Relative concentraiton of each species was determined using pentadecanoic acid as a calibration standard and applying the equation described by Privett et al.22> Table. 4.. Fatty. acid. prepared. composition from. hepatic. of molecular lecithin. of. species male. of diglyceride. rat.*. Wistar rats weighing 250-260 g and fed on the commercial pellet were used. Diglyceride was obtained after treatment of lecithin with phospholipase C (Cl. welchii). Developing solvent ; CHC13 : C2H5OH=94 : 6, v/v. Abbreviations used were : Tra ; tetraunsaturated fatty acid, P ; pentaunsaturated, H ; hexaunsaturated. For other abbreviations see footnote of Table 3. t See Table 3. エ タ ノ ー ル の 割 合 を 増 減 す る.ス 同 様 に 打 つ.分. 法 は レ シ チ ン を ホ ス ホ リパ ー ゼCで 1,2‑ジグ. 示 す,この. 190〜195℃ 方. 分解 して得 られ た. リセ リ ド の 分 子 種 へ の 分 別 に 適 用 す る.ラ. ッ ト肝 臓 レ シ チ ン で の 結 果 の1例 9,リ. ポ ッ トはIII‑6,7と. 離 の 状 態 はFig.3‑dに. ン 脂 質(レ. をTable4に. シ チ ン お よ び セ フ ァ リ ン)の. 示 す. 分子. 種 の 分 離27) 15gのAgNO3を ゲ ルH(45g)を. で2.5〜4時. 間 行 な い,P205を. デ シ ケー タ ー 中 で90〜120分 守 しな け れ ば な ら な い.放 が,そ. の ま ま 使 用 す る.リ. を12〜15cm幅 央 部 はRf値. 放 冷 す る.放. ン 脂 質 と し て 最 大10mg. に ス ポ ッ トす る.但. 用 い プ レ ー ト を 調 製 す る.活. 性化は. し,プ. が 極 端 に 低 く な る の で,で. 端 か ら2.5〜4cm(特 要 が あ る).この. は厳. 冷 後 プ レ ー トは な お 温 か い. 部 を さ け て 小 さ く ス ポ ッ トす る.ス 含 む 水 で サ ス ペ ン ド した シ リ カ. 含 む褐 色 冷時間. レ ー ト中. き るだ け 中 央. ポ ッ トの 位1露1は下. に セ フ ァ リ ン の 場 合 高 くす る必. 方 法 は 温 度,湿. 度 の影 響 を受 け る こ と.
(10) 'fable. 5. .. Fatty acid composition thin and cephalin from. Lecithin Monoenoic Dienoic Tetraenoic Hexaenoic Unfractionated. lecithin. Cephalin Monoenoic Dienoic Tetraenoic Hexaenoic Unfractionated. cephalin. of molecular rats fasted. species of liver for 35 hours.*. leci-. Female Wistar rats weighing 190-230g and fed on the commercial pellet ration were used. *The percentage concentration of each molecular species which was separated according to the degree of unsaturation of fatty acids at the 2-position was determined by the internal standard (pentadecanoic acid) method (see Table 3). が 極 めて 大 きい ので,展. 開 は20〜25℃. で 行 な い,. 脱 脂 した 綿 をつ めた 小 型 カ ラ ムへ移 す.こ れ に下 記 の. ス ポ ッ トはで き る限 り手 早 く行 な う.展 開溶 媒 は レ シ. 溶 媒 を 加 え,ゲ ル か ら脂 質 を抽 出す る.し ば しば ゲ ル. チ ン の 場 合,ク. が か た ま るこ とが あ るので よ く混和 して 均 一 の サ スペ. 30:5)セ. ロ ロホ ル ム:メ タ ノール:水(60:. フ ァ リンの 場 合,55:35:7を. 用 い る.溶. ン ジ ョ ンにな る よ う注 意 す る.ゲ ル の 面 積10〜20cm2. 媒 の上 昇 速 度 は比 較 的 遅 く,展 開が 進 む とプ レー トの. 当 り(0.5〜1.0mmプレ. 濡 れ に独 特 の様 相 が 見 られ る.Solventfrontよ. 溶 媒 を用 いれ ば 抽 出 は定 量 的 で あ る.な お抽 出時,濾. な り遅 れ て,恐. りか. ら くは水 分 に よ るプ レー トの変 化 と思. われ る部 分が 生 ず る.つ. ま り,プ. レー トの 濡 れ 方 が. 過 器 の洗 浄,特. ー トの 場 合)15〜20mlの. に足部 へ の ク リー ピ ング に 注意 を要 す. る.. front部 分 と全 く異 な り白つ ぽ く見 え るの が わ か る.. a)中. 特 に セ フ ァ リンの 場 合 に 著 しい.ス ポ ッ トの 位 置が 高. Ag+を. 性 脂 質 の抽 出法28) 含 まな い プ レー トで 分 別 した トリグ リセ リ. い の は この 部分 の 上 昇 の影 響 を避 け るた めで あつ て,. ド,ジ お よび モ ノグ リセ リド,遊 離 脂 肪酸,コ. この 部 分 が ス ポ ッ ト位置 のす ぐ下 ま で きた ら展 開 を終. ロー ル(遊 離 お よび エ ステ ル型)な. らせ る.レ シチ ンの 場 合,展 開 は通 常solventfront が プ レー トの約70%の. 高 さ まで 上 昇 した と きに終 了. :メ タノ ール(2:1)抽. レス テ. どは クロ ロホ ル ム. 出が 簡 単 で よ い.小 型 共栓. 試 験 管 に集 め た抽 出液 をそ の20%容. の水 とゆ るや か. す る.風 乾 後 フル オ レ ッセ イ ン をス プ レイす る と レシ. に 混和 し(IIの 抽 出 法 参照),遠. チ ン(セ フ ァ リン)の2位. 室 に放 置 す れ ば二 層 に分 かれ る.上 層 の水 一 メ タノ ー. て,Fig.3‑e,fの. の脂 肪 酸 の不 飽 和 度 に よつ. よ うな分 離 が え られ る.プ. レー ト. 心 分 離 あ る いは 低 温. ル層 を駒 込 ピ ペ ッ トで で き るだ け 完 全 に取 り除 いた. の活 性 化が 不 十 分 な 場 合や 放 冷 時 間が 長 過 ぎ る場 合 に. 後,少 量 の メ タノ ール で 栓 お よび 器 壁 を洗 い,35〜. は,モ ノエ ン型 と ジエ ン型 の分 離 が 悪 い.な お,放 冷. 40℃. 後 プ レー トを取 り出 しス ポ ッ トを打 ち,直 ちに次 のプ. せ る.し ば しば 水 滴 が残 る こ とが あ るが,少 量 の メ タ. レ ー トを取 り出 しス ポ ッ トして も,2回. ノ ール を加 え てや れ ば 容易 に完 全 に乾 固す る.フ ル オ. 目の プ レー ト. に加 温 しつ つN2gasを. 吹 き込 ん で 蒸 発乾 固 さ. で の 分 離 は1回 目の それ よ りか な り劣 るの で 必要 量 以. レ ッセ イ ンで プ レー ト上 の 各 脂 質 を検 出 した場 合,少. 上 の プ レー トは作 らな い こ と.ラ ッ ト肝 臓 で の結 果 の. 量 の 色 素が 脂 質 と共 存す るが,石 油エーテル に溶 か し. 1例 をTable5に. て や れ ば色 素 は不溶 で ほ とん どが 除か れ る.回 収 率 は. 10.薄. 示す.. 層 プ レ ー トか らの 脂 質抽 出法. 発 色 させ た 各 脂 質成 分 は注 射針 で マー ク し,厚 手 の カ ミソ リ(片 刃)で は ぎ と り,ガ ラ ス フ ィル ター(G 3ま た はG4),あ. るい は市 販 の脱 脂 綿 をエ ー テル で 再. 定 量 的(97%以 上)で あ る.な お トリグ リセ リ ドはエ ーテ ルで も抽 出 で きる . 中 性脂 質 か ら色 素 を完 全 に 除去 す る必 要が あ る場 合 にはt29)乾 固 させ た 脂質 をエー テル:ヘ キサ ン(1:.
(11) 1)に. 溶 解 し,等 容 の 水 ニメ タ ノー ル:ト. ミン混 液(5:5:1)を. リエ チ ル ア. IV.溶. 媒 の 精 製 法. 加 え よ く振 り静 置す る.色. 素 は下 層 に移 行 す るので,上 層 の エ ー テル ー ヘ キサ ン 層 を集 め再 び ト リエ チル ア ミン混 液 を加 え 同様 に して 上 層 を回収 す る.こ の操 作 を3回. く り返せ ば色 素 は完. 1.石. 油エーテル(沸. 点30〜60℃). 総 ガ ラス 製蒸 留 装 置 を用 い,試 薬 一級 品 を蒸 留 し, 所 定 の沸点 の留 液 を集 め る.特 級 品 を用 い る場 合 に も. 全 に除 き うる.な お,遊 離 脂肪 酸 は この方 法 で は少 量. 再 蒸 留 す るが よ い.な お,蒸 留 前 に1/2〜1/3容0)濃. の 損失 を ともな うよ うで あ る.な お,ト. 硫 酸 と振 つ て硫 酸 層 の着 色の 有無 を確 めて お く こ と.. グ リセ リ ドの抽 出 は次 項b)の Ag+が. リ,ジ,モ. ノ. 方 法 に 準 じて もよ い.. 存 在 しな い 場 合 に は食 塩 水 を加 え る必 要 はな. 通 常 は 殆ん ど認 め られ な いが,着 色が あれ ば 洗 液が 中 性 に な る まで 水 洗 し無 水 芒 硝 で脱 水 して 蒸 留す る. 2.リ. い. b)ト. に比 べ 沸 点が 高 い こ と,ク リー ピ ングす る程 度 が 少 な 含 むプ レー トか らの これ ら 脂 質 成分 の 抽 出. に は,10%の. メ タ ノー ル を含 む エ ー テル を 用 い る と. よ い.極 め て少量 のAg+が. 抽 出液 に入 つ て く る.Ag+. の 存 在が 以後 の 分 析 に支 障 を きたす 場 合 には抽 出 に先 立 つ てゲ ル を1%の. 食 塩 を含 む90%メ. タノ ール 溶 液. で しめ らし,よ く混和 後 上 記 の溶 媒 で 抽 出す る.食 塩 を含 む メ タ ノー ル を加 え る と,ゲ ル の 色が 黄 〜 褐 色 に. い こ とな ど か ら利 用 度 は 高 い. 3,メ. タ ノー ル. 試 薬一 級 品 を再 蒸 留 して用 い る.混 在 す る アル デ ヒ ド類 を除 くた め,過 マ ンガ ン酸 カ リ存在 下 で 還 流す る こ とが 望 ま しいが,通 常 は再 留 だ け で十 分 で あ る.な お,特 級 品 は その ま まで 十 分 使 用 に 耐 え る. 4.エ. タ ノー ル. メ タ ノール と同 様処 理 して 用 い る 。. 変 るので この 液 の必 要 量 が わ か る. C)リ. と同様 処 石油エーテル 理 して 用 い る.石 油エーテル. リゲ リセ リ ド,ジ グ リセ リド分 子 種 の 抽 出. 法3ω A9+を. グ ロイ ン(沸 点90〜120℃). 5.ク. ン脂質 の抽 出 法31). レシチ ン,セ フ ァ リン,リ ゾ レ シチ ン な どの 抽 出 に. ロ ロホ ル ム. 脂 質 の抽 出,薄 層 クロ マ トグ ラフ ィー な ど に は,試. は クロ ロホ ル ム:メ. タ ノ ー ル:酢 酸:水(50:39:. 薬 一級 品 を その ま ま用 いて よ い.脂 質 の 保 存溶 媒 と し. 1:10)が. 出後 この 溶 液 の1/3容. て は特 級 品 が よい.ま. よ い.抽. の4M‑. た,Ag+シ. リカゲ ル プ レー ト. 液 を加 え よ く振 る.遠 心 分 離 あ るい は 静. を用 い る ト リグ リセ リ ド,ジ グ リセ リド,リ ン脂 質 な. 置す れ ば色 素 は上 層 へ移 行 す るの で駒 込 ピペ ッ トで こ. ど の分 子種 の分 別 に は特 級 品 を用 い るが よ い,ク ロ ロ. れ を除 く.栓 お よび器 壁 を ア ンモ ニ ア と同 容 の1:1一. ホル ム には 安定 剤 と して 数パ ーセ ン ト以下 のエ タノ ー. メ タ ノール:水 で 下層 の クロ ロホ ル ム層 に乱 れ が 生 じ. ルが 添 加 されて い るが,こ れ は問題 に な らな い.. NH40H溶. な い よ うに洗 う,こ の洗 液 を 除去 後,同 容 の水 一 メ タ. 6.ジ. ノー ル 混液 を加 え よ く振 り遠 心分 離 し上 層 をす て る.. 試 薬 一級 品か ら予 じめ過 酸 化 物 を 除 く必 要 が あ る.. エ チル エ ー テ ル. この操 作 を合 計3回. く り返 す と色 素 は 完 全 に除 か れ. 特 級 品 につ いて も同 様で あ る,試 薬 の標 示 には過 酸化. る.回 収 率 は97%以. 上 で あ る.な お,い ず れ の 操作. 物 は マイ ナ ス とな つ て い るが,必 ず この 操 作 に付 す こ. の場 合 に も,洗滌 液 を加 えて 直 ち に振 る と内容 が ふ き 出す ので,し ば ら く放 置す る か冷 却 してや る と よい. 夏 期 に は特 に こ の点 注 意 を要 す る. この方 法 はAg+を 用 で き るが,Ag+を 後,0.5%の 1)で1回. 含 む プ レー トか らの抽 出 に も適 完 全 に 除去 す る に は ア ンモ ニ ア. 食 塩 を 含 む水 一 メ タノ ール 混 液(1: 洗滌. 洗 い,つ いで 上 述 と同様 の操 作 に 付せ ば 目. と.特 に夏 期 に は必 要 で あ る. エ ー テル を大 型 の分 液 漏 斗 に と り,そ の1/3容 の5 %FeSO4溶 液 と激 し く振 り下 層 は捨 て る.上 層 の エ ー テ ル を少 な く と も合 計4回 同様 にFeSO4溶 液で洗 つ た後,3〜4回. 水 洗 し,CaC12を. 晩脱 水 す る.な お,市 販 のFeSO4は. 用い 低温室内 で しば しば 酸一 化. されて い る こ とが あ るの で 注 意 を要 す る.CaCl2で. 脱. 的 にか な う.な お,食 塩 含 有 の水 一 メ タ ノー ル混 液 で. 水後,蒸 留 して用 い る.精 製 した エ ー テ ル は褐 色 ビ ン. 洗 つ て もAgClが. に入 れ,冷 蔵 庫 中で 保 存す れ ば 比 較 的 長期(数. 沈 澱 して くる こ とは殆 ん ど 起 こ ら. な い ので,特 別 の場 合 を除 きこ の操 作 は省 略 して も さ しっ か えな い.. カ月). は安 定 で あ る.保 存 す る際 に は,容 器一 杯 につ め,で きるだ け空 問部 を少 な くす る こ とが 安定 性 お よ び保 存 庫 内 の温 度変 化 に対す る危 険 性 を少 な くす る面か ら必 要 で あ る..
(12) 7.そ. 7). の 他 の溶 媒. ヘ キサ ン,ベ ンゼ ン,ア セ トン,シ ク ロヘキ サ ンな 8)舟. ど は特 級 品 を使 えば 問 題 は な い.通 常 の薄 層 ク ロマ ト グ ラ フ ィー に は一 級 品 で 十分 で あ る. 論. 10). 本 論 文 は動 物休 組 織 の 脂 質 分析 法 に関 し,特 に薄 層. 11). ク ロマ トグ ラ フ ィー の応 用 の 実例 を中 心 に記 載 した も. 12). の で あ る. 脂 質 の栄 養 な い し は生 理 的 役割 は,究 極 的 に は生 体 内 に お け る脂 質 の存 在 状 態 に関 連 す る.膜 分,酵 素 のCo‑factorと. の 構成 々. して な どで あ り,蛋 白質 ・. 13) 14). 糖 質 との結 合 様 式 のみ な らず,脂 質 その もの の構 造 ・ 分 子組 成 な どが 密接 な関 係 を もつ こ と にな る.こ の よ うな趨 勢 の中 で,脂 質 以 外 の生 体 成 分 を専攻 す る研 究 に とつ て も脂 質分 析 はか な りの比 重 を 占め るよ うにな. 15) 16)菅. つ て きて い るが,脂 質 の 水 不 溶性,不 安 定 性,純 粋 物 を得 るこ との 困 難性 な どの た め取 り扱 い に か な りの 難 点 が あつ た.近 年 ガ ス ク ロマ トグ ラ フ ィー お よび 薄 層. 17) 18) 19) 20). 分 析 法 に 関す る多 くの成 書 が 刊行 され て きたが,い ず れ も実施 上 の 諸 問題 点 を具 体 的 に示 され て お らず,他. 21). 分 野 な い しは 初 心者 に とつ て は なお 十 分 な もの とは 言 い 切 れ な い現 状 に あ る.本 編 で は,極 めて 具体 的 に こ. 22). れ らの要 望 を満 すべ く書 か れ た.ま た 実 例 として,ラ ッ ト肝 臓 お よ び血 清(漿)で. の分 析 結 果 を 併 記 し,一. 23). 層 の 普 及 性 を高 めて い る. 本 研 究 の結 果 は 長 年 に亘 る栄 養 化 学 講座 で の結 晶 の 一 部で あ り,実 際 に経 験 を 重ね た 多 くの教 室 員,大 学. 24). 院 生,卒 論 学生 の諸 氏 に 深 甚 の謝 意 を 表 す る.. 25). 文 1) 2)丹. 26). M. G. Horning : Lipid Pharmacology (ed. R. Paoletti), p.2, Academic Press (1964). 羽 正 治,北 学 分 析III,東. 3)生. 献. 村 元 仕,斉. 藤 正 行(編):臨. 27). 床化. 京 化 学 同 人(1966).. 物 化 学 実 験 法VII,脂. 28). 質 実 験 法,共. 立 出版. (1967). 4)生. 物 化 学 実 験 法VIII,脂. 質 代 謝 実 験 法,共. 立. 29). 出 版(1967). 5)安. 藤 鋭 郎,寺. 山 宏,西. 沢 一 俊,山. 生 化 学 研 究 法1.朝 倉 書 店(1967). 6)G.V.Marilletti(ed.):LipidChromato‑ graphicAnalysis,Vol,1,MercelDekker (1967).. 川 民 夫(編):. 一 郎,山. 川 民 夫(編):脂. 質1.共. J. Folch, M. Lees and G. H. SloaneStanley : J. Biol. Chem. 226, 497 (1957). W. M. Sperry and F. C. Brand : J. Biol. Chem. 187, 97 (1950). G. Schlierf and P. Wood : J. Lipid Res. 6, 317 (1965). M. Noda and R. Ikegami : Agr. Biol. Chem. 30, 330 (1966). V. M. Sardesai and J. A. Manning : Clin. Chem. 14, 156 (1968). A. E. Thomas, III, J. E. Scharoun and H. Ralston : J. Am. Oil Chemists' Soc. 42, 789 (1965). O. W. Portman and M. Sugano : Arch. Biochem. Biophys. 105, 532 (1964). 野 道 廣,0.W.Portman:九. 大 農 学 芸 誌,. 22,157,173(1966).. ク ロマ トグ ラ フ ィー の開 発 によ り上 述 の 諸 問題 は分 子 レベ ルで 取 り扱 い得 る よ う になつ た.こ れ に伴 い脂 質. 橋 三 郎,原 立 出 版(1970).. 9). V.結. J. M. Lowenstein (ed.) : Methods in Enzymology, Vol. 14, Academic Press (1969).. 30) 31). M. Sugano : Biochem. J. 122, 469 (1971). L. J. Morris : J. Lipid Res. 4, 357 (1963). H. K. Mangold : J. Am. Oil Chemists' Soc. 38, 708 (1961), 41, 762 (1964). V. P. Skipski, R. F. Peterson and M. Barclay : Biochem. J. 90, 374 (1964). M. Sugano, S. Cho, K. Imaizumi and M. Wada : Biochem. Pharmacol. 19, 2325 (1970). O. S. Privett, M. L. Blank, D. W. Codding and E. C. Nickell: J. Am. Oil Chemists' Soc. 42, 381 (1965). M. L. Blank, B. Verdino and O. S. Privett : J. Am. Oil. Chemists' Soc. 42, 87 (1965). J. N. Roehm and O. S. Privett : Lipids 5, 353 (1970). M. Sugano, K. Imaizumi, S. Cho and M. Wada: Lipids 6, 141 (1971). L. M. G. van Golde, W. A. Pieterson and L. L. M. van Deenen : Biochim. Biophys. Acta 152, 84 (1968). G. A. E. Arvidson : J. Lipid Res. 6, 574 (1965). M. Sugano, K. Imaizumi, S. Cho, K. Hori and M. Wada : Biochem. Pharmacol. 18, 1961 (1969). H. Brockerhof : Can. J. Biochem. 44, 1519 (1966). S. P. M. Slakey and W. E. M. Lands : Lipids 3, 30 (1968). G. A. E. Arvidson : Eur. J. Biochem. 4, 478 (1968)..
(13) Summary This. paper. lipid. components. tion. of the. tained venience.. was. described. of. thin-layer. in our. laboratory. animal. as. plainly. sources.. chromatographic with. the. as. The. possible. procedure rat. liver. the. particular and. practical. interests for. plasma. the were. methods. were lipid also. paid. analysis. presented. for. analyzing. to the. introduc-. The. data. for. the. obcon-.
(14)
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