植物病原性及び過敏感反応の両方を司る 遺伝子領域（hrp）の発現機構
課題番号 04660045
平成5年度科学研究費補助金（一般研究C）
研究成果報告書
ご111伽酬
030850243
6年3月
3
大字附 書館
研究代表者 露 無 慎 二
（静岡大学農学部）
植物病原性及び過敏感反応の両方を司る 遺伝子領域（hrp）の発現機構
課題番号 04660045
平成5年度科学研究費補助金（一般研究C）
研究成果報告書
平成6年3月
研究代表者露無慎二
（静岡大学農学部）
はしがき
トランスポゾンタッギングの利用により∵接の表現型が不明であっても、植 物の病原性発現に必要な遺伝子がとらえられるようになってきた。こうしてと らえられた代表的な遺伝子であるhrp遺伝子群は、宿主植物には病原性を、
非宿主植物には過敏感反応を誘導する。従って、hrp遺伝子群は病原菌の植 物との相互反応においてごく初期において中心的な役割を果たすものと考えら れる。hrp遺伝子群の機能を知ることが出来れば、植物病原性のメカニズム 解明に向けて重要な知見が得られるばかりでなく、特異的（安全性の高い）防 除法、正確な診断法、抵抗性育種法等について新しい発展が期待出来る。これ
までの研究から、これらの遺伝子は、（1）25kb程の領域にクラスターを形成 している、（21同じグループに属する病原細菌の間で相同性を示す、｛3）植物体 の細胞間隙内では増殖出来ずに死滅するtStどの情報は得られているが、これら の遺伝子の直接の機能にっいてはほとんど解明されていない。
著者らは、カンキツかいよう病菌（Xanth攣onas campestris pv citri）より Tn旦を用いたトランスポゾンタッギングによって、 hrp変異株を含む10 株の病原性欠損変異株を分離していた。本研究では、特に本細菌のhrp遺伝 子を中心にこれらの機能を調べた。その結果、カンキツかいよう病菌のコスミ
ドライブラリーを構築し、hrp遺伝子領域を含むコスミドクローンを得て、
本遺伝子群を解析することにより、発病及び過敏感反応誘導に携わる分子につ いて新知見を得ることが出来た。さらに、hrp遺伝子群をプロr ブとして用 いたRFLP解析を行い、病原性遺伝子の進化が他の遺伝子群の進化とは独立 して行われることを示唆することが出来た。また、この方法を用いた簡易同定 法確立することが出来、応用の分野においても研究を発展させることが出来た。
本報告は、後に紹介するように一部研究発表を行ったが、ここでは未発表の ものも含めてとりまとめて報告する。
一1一
平成5年度科学研究費補助金（一般研究C）
研究成果報告書
1。課題番号
04660045
2・研究課題 植物病原性及び過敏感反応の両方を司る遺伝子領域（hrp）
の発現機構 t
〆
3。研究組織
研究代表者： 露無慎二 （静岡大学農学部助教授）
4。・研究経費
平成4年度、
平成5年度
、、計
研究発表
（1）学会誌等
一 1．
（
2．
3．
1500千円
700千円
2200千円
Gold， S．， S． Nishio， S． Tsuyumu and N．T． Keen （1992）
Analy・i・・f th・p・1E・P・・組・ter i・E・竺i旦ia chrysa・th・簡i・
Mole． Plant−Microbe lnteraqt．5：1ラ0−178．
Kumagai， K．， M． Kato， S． Nabeshima and S．』Tsuyumu （19
⑫T1801A．B．C．。。dD．。e。qui。。。ea。dhyd。。q輌。。e antibiotics produced by a strain of Ps．eudomonas．
Biosci． Biotech． biochem． 56：1439−1442．
Tsuy剛パ∴M． W・t・・ab・． K・Ab・． S． W・t・b・， S． A・ai，
M．Goto and Y． Takikawa（1992）Si姐Ple and sensitive 阻ethod for the detection of Escherichia coli in natu−
ral environments using ice nucleation active gene．
Biosci． Biotech． Biochem． 56：1867 −1868．
｛2）ロ頭発表
4．
5．
6．
．7．
8．
9
1．
Tamura， K．， Y。 Takikawa． S． Tsuyumu， M． Goto and M．
Watanabe ｛1992｝ Corona† production by Xantho田onas ca姉estris pv． phorザ）ola． Ann． Phytopath． Soc． Jap加 58：276−281、
Tsuyumu， S．， K． Tanaka． N． Furutani， Y． Takikawa and C． Boucher ｛1994） Geft es involved in pathogenicity of Xantho蹴onas campestris pv． cit．ri． Proc． In七ernat．
Conf． Plant Pathogenic Bacteria 8： ｛in press）
T。kik。。a， Y．． N． Ni。hiya。a， K． Ohba． S． T。。yu。u a。d
Goto． M．（1994）Synony田y of Pseudomonas syringae pv．
翻aculicola and Pseudo面onas syringae pv． to磁ato． Proc．
Internat． 、Cenf． Plant Pathogenic Bacteria 8： ｛in
press） ． ＞
Goto， M．． M． Takagaki． A． Kodera． Y． Takikawa and S． Tsuyu由u ｛1994） 1…ffect of Benomyl on seedling rot
・frice｛Pseud・m・nas glumae）、an．d micr・bial interac−
t三〇ns on ger田inating．・・Ann． Phytopath． Soc． Japan 60
（1）：74−81．
jhoncon， J．， M． Miura and S． Tsuyumu （1994） Cloning of a region encodes 孤ultiple polygalacturonases of Erwinia carotovora subsp． carotovora EC1． Ann．
Phyt。P。th． S。c．」。p。。60（2｝，（i， o。es。）
」h・・c・n・」−F・S・k・i・・dS・Ts・yu胴｛1994）ρ・ter姐i nation of nuCleotide sequence of a region producing multiple polygalac・しuronase from Erwinia carotovora subsp． carotovora． Ann． Phytopath． Soc． Japan 60｛2）：
（in press）
中井朋則・西 一露無慎二・酒井富美・N・T・Kee・（199
一3一
2）ペクチン酸リアーゼ（pe1E）遺伝子のオペレーターに結合 するタンパク質。 日本植物病理学会報 58：236 2． 田中敬子・古谷暢之・金井直美・露無慎二・瀧川雄一・後藤 正夫｛1992） カンキツかいよう病Ca Xanthomonas campestr 担 pv． citriの2種のhrp領域のクローニング。日本 植物病理学会報 58：238
3． 中島雅己・後藤正夫・露無慎二・瀧川雄・・…一（1993） キウイ フルーツかいよう病菌Pseudemonas syringae pv． actinid ≧銅耐性遺伝子について。日本植物病理学会報 59：i62 4． 金森裕之・田中敬子・露無慎二・瀧川雄一・後藤正夫（199 3）大腸菌ポーリン遺伝子とカンキツかいよう病菌の病原性 遺伝子との相同性。1日本植物病理学会報59：163
5． 」． jhoncon． S． Tsuyumu and F． Sakai ｛1993） Petermina−
tion of the nucleotide sequence of the gene for pely ga1 actur on ase ef Erwinia carotovora subsp． carotovor
a．日本植物病理学会報59：164
6． 中井朋則・露無慎二（1993｝ペクチン酸リアーゼ遺伝子（pe1 郵制御部に結合する複数のタンパク質の解析。日本植物 病理学会報59：60
石ヲ干究成果
日次
第1章 カンキツかいよう病菌のhrpクラスター ・・・・・… 1 1）病原性欠損変異株 ・・・・・… 1 2）hrp領域のクローニング ・・・・・… 2 3）hrp領域の制限地図 ・・・・・… 3
4）hrp変異株の相補テスト ・・tS・… 3
第2章 hrpクラスターを用いたRFLP解析 ・・… 一一・4 1）Xanthomonas属細菌のRFLP ・・・・・… 4
2）RFLP解析結果に基づく系統図 ・・・・・… 4 第3章 カンキツかいよう病菌のその他の病原性遺伝子・・・・… 6 1）グルカン ・・・・・… 6 2）ボー一リン ・・・・・… 6 3）エリシター ・・・・・… 7 第4章 hrp遺伝子群の制御機構 ・・・・・… 8 1）遺伝子融合体の作成 ・・・・・… 8 2）大腸菌におけるhrp遺伝子群の発現 ・・・・・… 9 3）他の植物病原細菌における発現 ・・・・・… 9 第5章 その他の病原性因子の制御機構 ・・… ◆・・91）ペクチン酸リアーゼ ° ° 9
2）ペクチンリアーゼ ・・・・… 10 3）ポリガラクツロナーゼ ・・・・… 11参考文献 図表
・ ・ ・ ・ … 12
・・・・…
@ 14
第1章カンキツかいよう病菌のhrpクラフター・一・一一
1）病原性欠損変異株の分離
Boucherらは、ナス科植物青枯病菌（Pseudomonas solanacearum）から、宿主 植物には病原性を、非宿主植物には過敏感反応を司り、植物病原菌と植物細胞
との相互作用において根幹的な役割を担うhrp遺伝子群（約25kbからな
るクラスダー）の存在を報告した（1）。この青枯病菌のhrpクラスターは 世界中で分離された青枯病菌のどの菌株とも相同性を示すばかりでなく、Xant homonas属細菌とも相同性を示すことが判明した。 L従って、 h r pクラスターは 同じグループの植物病原細菌閤で共通して保存されいる特徴的なクラスターで あると考えられる。先に、我々はカンキツかいよう病菌（Xanthomonas campestris pv． citri）
の病原性遺伝子を解析することにより、発病機構を明らかにするため、ランダ ムトランスポジションによる病原性欠損変異株の分離実験を行った（2）。ま ず、いくつかのカンキツかいよう病菌分離株と自殺用プラスミドとの組み合わ せの中から、接合効率がよく、自殺率が1，00％近くになるものを探し、かい
よう病菌L9株と自殺ベクターpSUP1021との組み合わせが上記条件を
満たすことがわかった。この組み合わせを用いて、栄養要求変異株を分離し、
これらの要求栄養素を決定したところ、異なる栄養要求株が得られていること が確認され、Tn旦挿入がほぼランダムに行われていると判断された。さらに、
ランダムに選んだ接合体のDNAのEcoR1断片についてTn5を含む小プ
ラスミドpRZ102をブロー一一．．ブとしたサザンハイブリダイゼーション解析を 行い、単一のランダムな挿入が得られていることを確認した。なお、栄養要求 性変異株は約3％の割合で得られており、有効な変異誘発が行われていると判 断された。栄養要求株の中には病原性を失うものがあったが、通例に従いこれ らを病原性特異的欠損変異株とは扱わないこととした。次に、他の植物病原細 菌の例から病原性に関与すると考えられたべクチナーゼ、プロテアー・一一ゼ、アミ ラーゼ等の酵素の分泌能を失った変異株を得たが、これらの病原性は注射器に よる葉肉内接種では野生型のそれと変わらなかった。したがって、これらの酵 素の分泌は・葉肉内における発病に絶対的に必要なものではないと考えれた。
また、Xanthomonas属細菌に特有の黄色色素（カロテノイド）非生産変異株も得 られたが、顕著な病原性の低下は見られなかった。しかし、この変異株は強い 可視光線に対する抵抗性が弱まっており（図1）、黄色色素が太陽光線の照る 自然環境下における生存を有利にしているものと考えられた。これらの予備実 験の後、いよいよ未知の病原性遺伝子をとらえるべく、接合体一つづつをナツ
ダイダイの葉にゴムプレス法で接種していった。こうして接種した1，600個の接 合体から10株の病原性を喪失した変異株を得た。マスタープレートから、単 集落分離した後、いずれもprototrophicであることを確認した。これらの病原 性欠損変異株のうち4株は、YP液体培地での増殖速度が野生型のそれに比べ 約40％程遅くなっていた（表1）。ここでは、一応この程度の増殖速度の低 下は病原性の喪失の原因とは考えにくいと判断し、これら10菌株を病原性特 異的欠損変異株として取り扱うこととした。
2） カンキツかいよう病菌の一shu：＿9領域のクローニング
上記のごとく青枯病菌のhrp領域はXanthomonas属細菌と相同性を示す ことが報告されているので、青枯病菌のhrp領域のほぼ全領域を含むクロー
ン（pVir2） （3）をブローブとすることにより、上記Fi−FIO一のカ
ンキツかいよう病菌の病原性欠損変異株の中にこの領域に変異が導入されたものがあるかについて調べてみた。そこで、pVir2のEcoR1断片をサブ
クローニングし、二種の断片をプローブとしたコロニーハイブリダイゼt・・…ショ
ンにより、カンキツかいよう病菌のコスミドベクターpLAFR5を用いたゲ
ノミックライブラリーを調ぺ、これらのDNA断片と相同性を示す領域を含む クロ 一一ンを得た。pVir2の大部分のhrpクラスター領域をプローブとした場合、pXCF13−38． pXCF13−44の2クローン（グループ1）
が、pVir2のhrpクラスターの一部とdsp領域を含む断片をプローブ とした場合、pXCF6−30，pXCF9−39の2クローン（グループ2）
が得られた。また、Tn5挿入による病原性欠損変異株の内・F8は典型的な
hrpマイナスの変異株であったので、F8株におけるTn旦挿入EcoR1 断片をプロー一 i ブとして、PXCF15−52・pXCF16−33・pXCF
一2一
5−173、pXCF 10−88の4クローン（グループ3）を得た。
3）制限地図
グループ3のコスミドクローンについて、各種制限酵素を用いて遺伝地図 を作成し、F8変異株におけるTn旦挿入位置を決定した（図2）。この遺伝 地図を元に下の相補テストを行った。
4）hrp変異株の相補テスト．
a）相補テスト用プラスミドの検討
コスミドベクターとして用いたpLAFR5は、広範な細菌中で複製可
能であることが報告されているが、カンキツかいよう病菌の中では複製出来な いことが判った。そこで、選択圧の非存在下でも安定に保たれるプラスミドを検討した。その結果、pSF6とpSUP205がともに高い効率で大腸菌よ
りトライビアレンタル・メーティングによりカンキツかいよう病菌に移行され ることが判った（表2）。さらに、これらの接合体について、選択圧のない状
態で植えつぎをおこなったところ、psup205はキュアリングがみられな かったが、PSF6は容易にキュアリングされた。このこどから、pSUP2
05がカンキツかいよう病菌における相補性テストに適していると判断した。b）F8の相補性テスト
病原性欠損変異株F8における宿主植物における病原性及び非宿主植物に おける過敏感反応誘導能を回復させる領域をサブクローニングを試みた。ベク
ターpSUP205にpXCFII10−3のEcoR1断片をいったん大腸
菌にサブクローニングした。次に、これをエレクトロポレーションによりF8 株に導入した。得られた形質転換体pX8を組換え実験室内でナッダイダイの 葉及びタバコの葉の細胞間隙に注入して反応を見た。ナツダイダイでは、F8 では全く反応が見られなかったが、pX8の場合は接種後1週間頃から黄変が 始まった。しかし、完全なかいよう症状を呈するには至らなかった。また、タ バコでは、F8は接種後3日を経ても全く反応が見られなかったが、接合体で は、接種後48時間後に黄変が見られた。しかし、典型的な過敏感反応（褐変）
には至らなかった。このように部分的な相補しか観察できなかった原因として、
プラスミド状態で導入した場合、hrp遺伝子間の発現バランスが乱れたため
と考えられた。
第2章 hrpクラスターを用いたRFLP解析
1）Xanthomonas属細菌のRFLP．
一般に、hrpクラスターは同じグループの植物病原細菌間でDNA塩基配
列において相同性が高いことが報告されている。それだけ、病原性の中心的役 割を担うものであるということであろう。また、病原性遺伝子が他の遺伝子に 遅れて進化したものであることを示唆していると考えた。とすると、hrpクラスタ〜がXanth。m。、fi、as属細菌の種、 path・var等の下級の分類群で、各々相伺性 を示すと考えられる。そうだとするならば、Xanthomonas属細菌一般の同定ばか
りでなく、各speciesや各pathovarの伺定にも、 R F L Pが威力を、発揮出来るは ずである。そこで、X．c． ctt triの様々な分離株にっいて今回得られたhrp領
域のコスミドクローン（PXCFl3 一一 38．pXCF13−44）をプロー
ブとしてRFLP解析を行った。泳動距離が同じ位置にくるバンドの数を％で 表示すると、類似度が高いことが確認された。一一方、他のpathovarに属する垣 nthomonas属細菌のRFLPパターンはpv．citriのそれとは異なったが、同一種 やpathovar内ではやはり類似度が高かった（表3）。従って、 h r p領域とい う病原性遺伝子のクラスターを用いることにより、Xanthomonas属細菌の各種、pathovarを判定できることが判り、今後Xanthomonas属細菌の各種及び各pa七ho varの同定に有用であることが明かとなった。
興味あることに、同じXanthomonas属細菌であっても病原性を持たない 非病 原性細菌 として分離されたものが、カンキツかいよう病菌のhrp領域と相 伺性を示すものがあったということである（表4）。この事実は植物に随伴す
る非病原性細菌の病原性の進化に情報を与えるものとして注目され、今後検討 されるべき課題である。
2）RFLP解析結果に基づく系統図
一4一
上記RFLPの結果からXanthomonas属細菌の各pathovarを分類出来ることが 判明した・そこで、従来より用いられてきた微生物学的性状に基づく分類結果
と比較すれば・病原細菌の代謝等の基本fi @命活動に用いられる遺伝子と病原 性遺伝子の進化を比較出来るのでは・よいかと考えた。この比較を行うためRF
LPに基づく分類結果を系統図で表し、微生物学的性状に基づいた分類結果に よる系統図を比較してみた（図3）。その結果、両方法による分類結果で大き く異なる結果になるものが出てきた。このことは、植物病原性遺伝子は他の生 命活動に本来必要な遺伝子群とは異なる進化の過程をたどるものであることを 示唆するものである。
第3章 カンキツかいよう病菌のその他の病原性遺伝子
1）グルカン ノ
Pseudomonas syringae pv． syringaeでは、 h r pクラスターとは別個に存在
するもう一つのhrp遺伝子（⊇）の存在を発表している（4）。Bohinらは
（5）、このhrpM領域が大腸菌の膜局在性多糖質（田embrane derived oligosa ccharide，mdo）の合成を司るmdoG，H遺伝子と相同性を示すばかりでなく、ま た、大腸菌のmdo遺伝子マイナス変異株が上記hrpMによって相補されること を報告している。そこで、これらの越及び些A遺伝子との相同領域が上記カ
ンキツかいよう病菌のTn5挿入病原性欠損変異株の挿入部位、上記コスミド クローンに存在するか否かについて調べた。まず、それぞれの遺伝子のクU一 ンをプロー一一一ブとしてサザンプロットハイブリダイゼーション解析を行うと、F 5及びF7変異株においてTn旦の挿入位置と同じ所でバンドが見られた。し かし、hrpM及びmdoAの構造遺伝子を切り出した断片をプローブとすると、これ
らのバンドは検出されなくなった。このことから、F5及びF7株はTn5挿
入に用いた自殺用複合プラスミドベクタ・・一一 pSUP1021全体が挿入されていると考 えられた。最近、共同研究者であるフランスのリーユ大学のBohin教授は、カン キツかいよう病菌野生型L9は環状（β一1，2）グルカンを合成することを見い だした。しかし、大腸菌のグルカンはβ一1、2及びβ一1，6からなる鎖状グルカン であることが報告されており、 グルカン合成の遺伝子の構造も1！11d｝SLtxo A或いは≧旦
との相同性は低いのではないかと思われる。環状グルカンは、Agrobacterium tumefaciensやRhizobium属細菌で植物細胞への吸着に不可欠なものであること が報告されている。カンキツかいよう病菌においても、この環状グルカンが植 物細胞への吸着に関与することにより発病や過敏感反応に導いている可能性が 示唆された。
2）ポーリン
上記カンキツかいよう病菌の病原性欠損変異株の中でF5とF7はテト ラサイクリンとクロラムフェニコールに対して耐性を示した（表5、6）。大 腸菌では、ポーリンタンパク質欠損変異株が同様な表現型を示すごとが報告さ
一6一
れている。ポーリンタンパク質はグラム陰性細菌の外膜に存在し、親水性低分 子物質の外膜通過を司る。大腸菌においては、水島らによって（6、7）ポー リン生産遺伝子（ompC， ompG）がクローニングされ、これらの塩基配列が決定 されている。そこで、これらのポーリン♪
@子をプローブとしてF5とF7に
ついてサザンプロットハイブリダイギーション法によって解析したところ、野 生型にくらべF5とF7株ではバンドがシフトした。このことから、 F5とF
7株では、Tn旦がポーリン遺伝子に挿入したことにより病原性を喪失したの ではないかと考えられた。 一 3）エリシター
一般に・植物病原細菌を非宿主植物の細胞間隙に注入すると、24時間以内 に過敏感反応を誘導し24時間以内に褐変が見られる。ところが、Xanthomena 旦属細菌の場合には、同様な接種を行っても全く反応が見られなかったり、24 時間以上経過して始めて弱い過敏感反応が見られたりする。この原因として、
カンキツかいよう病菌は、過敏感反応誘導因子の他にこの作用を阻害する物質
（サプレッサー）の双方を生産しているのではないかと考え以下の実験を行っ
た9
（a）過敏感反応極初期における化学発光
病原菌が非親和性植物の細胞と接触すると、フリーラジカルが生成されるが、
この時化学発光量が上昇することが報告されている（8）。そこで、カンキツ かいよう病菌の非宿主であるタバコの培養細胞に病原細菌を加え、経時的に化 学発光測定器（東北電子社製）を用いて化学発光量を測定した。図4に示した ように、一時間以内に化学発光量の増加が見られ、その後、高いレベルで一定 に保たれることが確認された・なお、糸状菌のエリシターとして報告されてい るキトサンをポジティブコントロ ・一ルとして用いたが、この添加による化学発 光の上昇と同じようなバターンをカンキツかいよう病菌接種の場合も示してい
る。このことから、カンキツかいよう病菌においてもエリシター様物質が生産 されているのではないかと考えられた（図4）。
（b）エリシター・サプレッサー分画
タバコ細胞とカンキツかいよう病菌の混合培養液を遠心し、その上澄み液を
透析膜を用いて高分子分画と低分子分画に分け、それぞれについて凍結乾燥に より濃縮し、これをタバコ培養細胞に加えた結果が図5に示してある。高分子 分画を加えることにより、キトサン、病原菌を加えた場合と同様な化学発光量 の上昇が見られた。さらに、興味あることに、低分子分画をキトサンと同時に タバコ培養細胞に加えると、キトサン添加で見られた化学発光の上昇が見られ なくなった（図5）。このことから、低分子分画にはサプレッサー様物質が存 在すると考えられた。なお、カンキツかいよう病菌の単独培養の場合も高分子 分画にエリシター活性がみられtg。この場合、細菌数あたりに換算すると化学 発光上昇力では、混合培養した場合の方が細菌単独培養の場合よりも高かった。
従って、元来カンキッかいよう病菌がbasal leve1でこのエリシタ
ーを生産しているが、非宿主植物との遭遇によって生産誘導されるものと考え
られる。
（c）エリシターの生化学的性状
上記のごとく得たエリシター分画の熱安定性と各種高分子物質分解酵素処理 による失活の有無を検討した。まず、5分間の煮沸処理をした場合、エリシタ ー活性の低下は見られなかった。従って、このエリシターは熱安定性であると
いえる。高分子物質分解酵素処理の場合は、DNase及びRNase処理で はエリシター活性は全く影響を受けなかったが、Protease処理を行う と、エリシター活性は完全に失活した（図6）。なお、Protease処理
の場合、処理液をそのままタバコ培養細胞に加えると、レセプターが失活され る可能性が考えられたので、処理後、熱処理をしてからタバコ培養細胞に加え て試験した。いずれの場合も、化学発光の上昇が見られたことから（図7）、
本エリシターは耐熱性のペプチドであると考えられる。
弟4章hrp遺伝子群の制御機構
1）遺伝子融合体の作成
アルカリフォスファターゼ遺伝子をレポーター遺伝子とした遺伝子融合体作
成用トランスポゾン（TnphoA）を用いて、グループ3の四つのコスミド
クローン上にランダムに挿入させ、約iOO種の融合体を得た・これより13
一8一
種類の融合体を撰び、それらの制限地図上での挿入位置を決定した（図8）。
2）大腸菌内におけるhrp遺伝子群の発現
大腸菌内で作成したTnphoAとLr旦遺伝子群との融合体をYP培地及
び最少培地でアルカリフォスファタ・一一 ＋v@m活性を測定した。Pseudomonas sy ringaeグループの・h r p遺伝子群は、最小培地や植物汁液培地で発現が誘導さ れることが報告されているが（9）、いずれの条件においても顕著な誘導はみ られなかった（表7）。これは、カンキツかいよう病菌のプロモーターが大腸 菌内では機能しにくいためであろうと判断された。 ・
3）他の植物病原細菌におけるhrp遺伝子群の発現
別種の植物病原細菌Pseudomona忌syringae pv． actinidaeにこれら 融合プ ラスミドをエレクトロポレーションにより導入し、同様な試験を行ったが、ア ルカリフォスファターゼの比活性の上昇はみられなかった（表8）。カンキツ かいよう病菌内における発現については、本ベクターが同菌内で安定に他も垂 れらにため、実験が行えなかった。今後、上記実験で有用性が明らかになった
pSUP205にサブクローニングして調査しなければならない。
，弟5章その他の植物病原性遺伝子の制御機構
1）ペクチン酸リアーゼ
ペクチン酸リアーゼ（PL）は、、軟腐性Erwinia において主要な発病遺 伝子であることが遺伝学的、生理学的実験から示されている（10）。しかし、
多くの植物病原細菌ばかりでなく、非病原性細菌も本酵素を生産することが報 告されている。また、軟腐性Erwinia属細菌において、4−5のPLアイソザイ
ムが生産されることが報告されている。従って、本細菌において特定のPLア イソザイムが大量に生産・分泌されるメカニズムを解明する必要があると考え、
以下の実験を行った。
a）pe1E遺伝子のプロモーター
PLeはErwinia chrysan七hemiでは感染の場においても最も活発に生産さ れる。pe1EはPLeをコー・一・一ドする遺伝子であるが、本構造遺伝子の5号末端側 上流領域の塩基配列は図9のようになっているeまず、転写開始点をプライマ ーエクステンション法によって調べたところ、通常の培養条件下で3箇所（0、
＋18、＋40）の転写開始点が存在することが判明した（図10）。さらに、
転写開始点Oの上流にあるプロモーターに部位指定変異作成法によって変異を
導入すると、−63、＋47、＋61に新たな転写開始点が現れることが判っ
た。しかし；誘導条件下、非誘導条件下、カタボライト抑制解除条件下で異な る増殖期の培養細菌からmRNA分離し、プライマーエクステンションを行った結果、いずれも0、＋18、＋40の3箇所の転写開始点であることに変わ
りがなかった。従って、これらの培養条件によるプn，E・・一ターの使い分けはな いと判断された。なお・0と一63の転写開始点の前には大腸菌のσ70型コン センサス配列がみられたが、他の転写開始点の上流にはその他の既知プUモー一一一 ターコンセンサス配列は見られなかった。何故、このように多数の転写開始点 が存在するかについて、現在のところ答はないが、全く新しい制御機構の存在 が立証され、今後詳細な解析を行っていきたい。
b）制御タンパク質の検討
上記pe1Eの野生型及び変異型上流領域をPCRで増幅し、放射性同位元素で 標識した後、ゲルリターデーション法により結合タンパク質について解析を行
った。その結果、プロモーター、CAP（cAMP結合タンパク質）結合領域
の他、すくなくとも3っの制御領域があり、既知負の制御タンパク質であるKdgRの他2個の正の制御タンパク質が結合することが判った。尚・Op2に
はKdgRと生の制御タンパク質も結合することが判り・、両制御タンパク質が 同じ部位に結合を競うことにより制御が行われている可能性が示唆された。上 記複数のプロモーターの解析とこれらの制御タンパク質の解析とをドッギング させることにより、pe1Eの制御機構が明らかになるであろう。2）ペクチンリアーゼ
本酵素の生産はDNA損傷物質の添加によって誘導される・最近・燐酸欠乏
一10一
や低温培養によってSOS反応が誘導されることが報告された（11）。この ような条件は普通栽培条件下で充分考えられる条件であることから、このよう な条件下における本酵素構造遺伝子（pnlA）及び本酵素の制御遺伝子（旦
igA）の誘導の有無についてβ一ガラクトシダーゼ遺伝子との融合体を用いて 調べた。その結果、コントロールとして ・たSOS遺伝子の一つであるum
ucでは、誘導が確認されたが、pnlAとdigAのいずれの遺伝子も転写
誘導をうけなかった。したがって、既に当研究室から発表した植物体内のDN A損傷物質の存在が重要な意味を持っものと思われる。また、pnlAの制御 タンパク質についてもゲルシフトアッセイ法を用いて検討を行ったところ、こ こでもDigA以外の複数の制御タンパク質の存在が明らかに．され、単純なぞ S反応に一つとしての制御ではなく、複雑な制御下にあることが示唆された。3）ボリガラクツロナー一一ゼ
ボリガラクツロナーゼ（Peh）は植物病原菌を始めとした微生物ばかりで
なく、植物体が持つ酵素である。軟腐病性Erwinia属細菌においては、
古くからペクチナーゼが発病因子として重要であることが言われてきている。
しかし、Pehの重要性にっいては報告がない。Pehは最適pHが酸性側に
あり、酸性条件下にある植物体内では植物組織崩壊に威力を発揮することが充 N分考えられる。さらに、そ菜軟腐病菌Erwinia carotovora subsp． car・9tovora EC1株は複数のPehアイソザイムを生産分泌することが判った。そこで、
これらのアイソザイムがどのような制御を受けているかをしらべるため、それ ぞれのアイソザイムを生産する領域のクローニングを試みた。その結果、1．8
kbのDNA断片が4つのアイソザイムを生産することが判った（12）。こ
れまで報告されているPehの分子量は約4万程であり、どのようにそれぞれ のアイソザイム生産遺伝子が配列されているのかに興味が持たれた。そこで、この断片のDNA塩基配列を決定した（図11） （13）。両方向についてオ ープンリーディングフレー一一ムを検討したが、このサイズのタンパク質をコード
する領域は一つしか（ORF1）見あたらなかった。ORF1は既報の他の軟
腐病菌のpeh遺伝子と高い相同性を示したばかりでなく、類似アミノ酸を考 慮にいれた相同性は植物のそれとも相同性を示した。このことから、ORF1はPehの構造遺伝子であると考えられる。従って、4個のアイソザイムはO RF1に別なペプチドが結合して形成されたものであると考えざるを得ない。
これは、全く新しいアイソザイム生産機構であり注目される。尚、Pelhの大 腸菌クローンは弱いながらも植物組織崩壊能力があり、Pehも発病因子であ
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図1
0
（・＝≧）蘭o一
一 1
一，2
0 10 20 30 4．O 1 50
60
・・Time「《min）．、 ＿ ・
Sp・v｛如e・…se c衙・5減゜ce輌 T igme Fed mutant t。 Vlslble radia ti。IT ・
し一9：vlld type F・13：ll。n・pl8罵ented叫・・ ll t ・
図2
↓Tn5Eeent 崩玲d田 訂蓼1
■ぎ1亘
トー・XCF II 5 173 一一一一一一一一一一・P
巳
2KbF−一一：一一一一一一一一一一一一一一一一一一 1−一一・ 一一一一一一in−一一
pXCF H 10−88
pXCF15−52 一一一E一一一一一一一一一一一一一一P
ト・XCF16 33−一一一一一一］
t・CUS
−一一堰@14 一
mの制限酵素地図
図3
図4
0 10 20 30 40 50 60 70 80
1300：
1200 1100
宕
31000a
噌 姦9・・
ど 800 700 600 0 ？O
90 100（％》
X．c．pv． citri itr退8〔〕2
TMR20、
X．c．P》。el fal fae・−
MAFF⑭1αめ
．X．．c．pv． vesicatria
．RFLP解析法における類似性に基づいて得られた樹形図
40 60 80
−●−C㎝trol 今NA・ 1
100 120 140 160 180 時間（分）
綱訓後≒襯光、
9
TOMXV9901
200 220 240
図5
1500 1400 1300 Ei 1200
合
）1100．
頃 笥ミ1000 剤・900．
800
e
700．
600
＼＼＿／／＼＿／
＼
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 時蘭｛分）
220240
一●レー controI
÷NA 1
−■一キトサン
＋高分子分画
一喝一低分子分画
一一一 一 uｪ子分画＋キトサン
＋低分子分画＋キトサン
q
図6
1300 1200 1100言 合1000
） 唱 900 紫 800 e 700 600
・500
゜2ql4・・6°・ 8σ g晶；4°16°！8°2°g22°24°1
不活化処理したエリシター分直添加後の￠学発光
十工リシター分画 一9−DNase処理区
十RNase処理区 十熱及びProteinase処理区
・ VL−Proteinase処理区
図7
11SO 1100 1050
＾1000ε
）合950
唱 900一 駅 850 塾8・・
750 700i
650
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 時間《分）
不活化処理したXリシター分i添加後の化学発光
一●一熱処理区 今工リシター分■
一16一
図8
E創膚1 κSn〆面
万v1
σ ∫田
⑦ ④ ⑯
ト，XCFH5−173−一一1
H
2Kbト＿一一一一px「
F−一一一一一・一一一一一一一lOCUS皿におけ
1．，，1！il8二二＝二＝1
pXCF16−33−一一
るTnρhoA挿入位置
図9
＊ k， ＊ ：を ‡ ＊
CAA」〜AATTCC｛こGATCATATGACTGAATTTAAAA｛；AAAATTCAATTCAACATCCATTAGCA
CRP−b《｝x
100＊ ・1 …80＊ 業 ・60＊ ＊ AAA｛；TTACCGGTCTCGATCACAGTTTA｛；ATAAAATTAACAACA｛；CCATAA込亙元ミ［K〜三i亘ii云 35 −10 一皐 ｛｝P−］
E＿87 （；GC E−72 α；C
40 ＊ よ ・20 ＊ ＊ 0 ＊
＋ エ f − −t−−− ニヨ
TTTTGATCGCAAAACATCTCCCCCGAAATGCTTAAAAATCCACCTTGCCGAGG｛】ACAAAA
− ・＿，r＿ト ＿＿，＿ ． ．一 一 一一・ 一馳一 ＿←＿ ← ｝7． −P − ． 一＿ 7｛ 膓
35 t：RP−bex −1｛｝ i｛ OI、−2
Ei）−13 ｛；C−AAA
，20 ＊ ＊ ↓40 ＊ ＊ L50 ＊ ＊
［GGCATTTCA卵TT（IACAAACGGCTTTηGAATTCTTAACAATGCATTT｛；（；ATTAGCG
， − ， ＿ コ L＿ ， − ＿ ド − −＿ − ＿．− ， − ロ r
川 ｛．）P−・3 1i
・80 ＊ ＊ 」100 ＊ ＊ ↓−120 ＊ ＊
CCTACAGC ；AAG（；AAACGGTCTATGAAAAACACGCGTGTACGTTCTATCGCAACTAAAAG
Mt〕tLysASIIThrAr9
・140 ＊ ＊ ，160 ＊ ＊ ・18｛⊃ ＊
TTTACTGGCTGCCGTTGTA．〜CA｛｝CAC；CACT（；へTGGCTACCTCTGCTTATGC（こGCAG 〜AATGACC｛；ACGGC：〜ACATTGTC｛； ． ． PLKeCri27ラ・〈マー・
図10
へ，アチン酸リアーゼ遺伝子（pS lE）の5 @末端制御1領域
声◎。
図1．1∵「一 ．．∴ ㌫：1溺鷲
、 ら ㌧∵∵．1 ・∴1．∴二二∴㌶ξ
・蕊≡一一一．m蕊驚罫i∵ll
、、G。，，CC、Cぽ， CG，，ご、，、C＿＿。∴，＿。G1・よ運丁／
1ひ6TTA ACC・A TG CGnA三GTT GAA TGC卿「（℃G AAT AAブ白ぼ預撃GぷTO三
・．・…Tm鵬・頷鵬d・C・．・ T・ T・・．T・・…CT・C・ A．r・趣・眠斑「∴・・．・
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、，，8、GC亘、。。。G G。＿，質G。C。。G、。、。。， C、。，C、 GG，。、。 6GA
・ S．D． Met Glu Tyr Gln Ser Gly Lys』Arg 3『1GTT TTA TCA TTA TCA CTG GGG CTT ATC GGT TTG冊丁 GT GCA TCG Va1 Leu Ser L剖Ser Leu Gly Leu lle Gly Leu Phe Ser Ala Se主 376 GCA 「惚T GC「P TC「V GAT TCC CGA ACG．GTG AGT GAA CCG AAA GCA CCG Ala Phe Ala Ser Asp Ser A工9 「rhr Val Ser Glu P．ro Lys Ala Pζ0 421 「DC「r TCC 「PGT ACG GTG C「eT AAA GCG GAC AGT AGT λCG GCC ACG AG「r Ser Ser Cys Thr Val Leu Lys Ala Asp Ser、 Ser rrhエ Ala Thr Ser 466 ACA ATT CAA AAA GCG・C「rG AAT AAT TGC GGG CAA GGA AλA GCG GtfA Thr lle Gln Lys A．1a．Leu Asn Asn Cys Gly Gln Gly Lys Ala Va1 5il AAG CTG AGC GCA GGG AG「r TCA 「rCC G「rT TTIr C「rG AGC GG「r CCG CTT l Lys Leu Ser Ala Gly Ser §er Se工 Val Phe Leu Se丈 Gly P工o． Leu 556TCT CTA CCT TCT GGC GTG AGC rTA冊A ATC GAC ̀AA GGG GTA ACC S・・Leu P・。 S。。 Gly V。1 S。。 L。。 Leu・1。 A。亘Ly。 Gly V・1 Th・・
601C？A CGT GC？GTG AAT AAT GCC AAG TCT TTT GAA脚6CG CCC TCA
、
Leu Arg Ala Val Asn Asn Ala Lys Ser Phe Glu Asn Ala P工o Se工
EcoT22エ 1
646 TCC TGT GGC GTG GTG GAT ACA AAc GGT AAA GGC TGC GAT GCA TTT Se「 Cys Gly Va Va Asp Th「 Asn『y Lys Gly Cys Asp Ala Phe
ChCr AΨ
Te Tl A−
ChCeG主Ar ATTS
TPTn GAA、AASAS
G」rTP TSGACeAs
CPAl ASTa GAGV Te A工
Cr ATCh
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9GtTP rTeAS AA・MGA
CrCn GeAS A6AA
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GCC ACA AGC ACG ACG AAT AGC GGA ArrC TA「r A1。 lih。 S。。・h，，h． A。。、。． Gly、、。。yr
IlindllI
、、，GG＿GGG、CC GTG、L、6，。 CA、 G、T
A．・P 61y Gl。 Gly AII。 v。1 Ly。 L。。 G・。 A。P
MGG GAT CTG GCT GCC GAT・GCC AAA fTG AAA T・pA・pLeuA1・A・。．A。pA・。Ly。V。1 Ly。
ACC CCC CGG CTG AIr7．CAG ATTムAT AAG AGC
・h・P・。・・9・eu・・el・・。、・・。 Asn・，、 S。．
TAT AAC GTC TCT CTとA質・AAT TCT CCG AAC Tyr Asn Val Seエ Leu、，．11e Asn Seエ Pエo Asn AGC GAT GGT GAC GGr．．TTC ACC GCG TGG AAA Se丈 Asp Gly Asp Gly Phe Thr Ala 「Drp Lys CCA ？C「r ACC GCC AGA AAC ACC GAC GGT λTC P「o Se「 Th主 Ala A工9 Asn 「？hエ Asp Gly Ile
t
λAG AAC ATC ACC ATT GCC CAC AGT．AAT A聖丁 町日A．nヱ1。 Th． 、1。 Ala馳H1。；。。 A、n、、e みAT GTG GCG A「rC AAA GCC「「rAT AAG GGG CGT Asn Val Ala Ile LyS Ala lTyr Lys． Gly Arg
・喪・CC・歴…9・・ ̀A・「1 fA・T・・GG・ACG
・1・S…1・・…i・…G・・Ph・Gly・h・
ATC GGT AGC GAA ACG ATG GGA G「r「P 「rA「r AAC
・i ・G・yS・・G・・，T・・…G・y・・・・・・…
C「：G G「rT ATG ACT GGC ACC ACG AA「r GGC T「rA
L『∵a…Thi。：ly h Gly Leu
・1・。CG GCA GC，IGGC G。，・G。＿GG， G質
L￥sS壱「AlaAlaGlyVa1 Va1 AsnGlyV・1
GTC ATG AAG AAC GTG GCG AAA CCG．ATC GTG Va1 Met bys Asn Va1 Ala Lys Pro lle Vaユ
GGG CCG GGC Gly Pro Gly
AAA AAG GTG Lys Lys Va』1 AAG TTA AAA Lys Leu Lys
AAG AAT TTC
Lys Asn Phe TTC CAT GTG Phe His Val ACC ACG ATC
Th、工： Th工 11e
GAT CCG ATG Asp Pro Met TCG．ACG GGC Ser Thr、Gly．
TCT DGAG ACA Ser Glu Thr GGA CA「r GGC Gly His fly GTG ACG GTC Val Thr Val CGT ATT AAA A丈9 11e Lys
CfG聖AT AGC Arg Ty工 Ser AT「T GAC ACG Ile． ASP Thr
図11
表1
・32・GT・
E・……A。AAG、GGG、、GT、、，G・TCC・G・C・GG AGCG・・
Va1 Ty・G玉u Ly・Ly・G1・Gly． Se・A・n V・1 Pr。 A・p T・p S・・A・p 1366 ATT ACG 「rrrT『AAG GAT ATT ACG TCT CAA ACC AAA GGT GTG GTA GTG Ile Thr Phe I」ys Asp Ile Thr Ser Gln Thτ Lys Gly Val Val Val BsmI
l
1411CTG AAC GGC GAG AAT GCG AAA AAG CCG ATA GAA GTG ACGハTG AAG Leu Asn Gly Glu Asn ハ 吊 s Lys Pro lle Glu噛Va1 「Phr Meセ Lys ＼
1456 AAC GTC AAA CTG ACC ｝ GAC AGC ACA TGG CAA ATC A瓦G AAC GTC ．…V…y・L・・r・，・ S・rA・・S…h・T・pGln元・・・…snV・・
1501 AAC GT「P AAG ハAA TAA CGC AGT TAC AAA ATC GTT CTA ITTA ACT GAT
A』・V・1Ly。 Ly』…一一一一・…∴・ 一一
1546CGT@ACC CCG TGG rlr、．TGC TGT TGT TTGITGC ACT CGT GT TAC GTT
．．Apa『i．
・5・・GCG・G−…。r・・、 GC・とGC AG亡ーる・丁丁・』・G・CC−TC・GC 1636GTT TAA TCλGAA TAG・・至eC ATC ACG CTT TTT TGA CCG G質TTT ATG−
1681TCC ACG CTG GCG ．CC ATG CCC GGC ACG ATG GGG AAT TTT TCC CCG 1：726−GCT⑰G惚GTg AGT・TCC寧興GT、GTG IρTG．⇔GC ACA ITAG ATC CGA 17・・．・TA i｝・・，…r⑰G八T r口CC、・・み…、cr・C・・；・
prth°rCI⇒°f Tn訓duced l1・㊥f°8卵c mu｝；ntr∵
t
Strain
Pathogenicity、
1 イ
G，，e，諭。，
sime（h）
Tn−5d
‖yperp｜asia Ye日。wi n X Viability
し・9
F−1 F・2 F−3
．F・4 F−5 F・6 F−7 F・8 F−9 F−10
十 ⇔＋＋±、糾±＋±
±±
Ioe＜
2×107 2．2×le7
L5×107
10b＜
6，9×103 6．5×107 6×104 2×104 1．6×107 4．4×105
0．68
0．82 0．6 0．93 0．6 0．88 0。66 0．9 0．56 0．88 0．93
a：＋，typica日Wperplasi。 sy情pt。剛一，n。 tiyperplasia syrap｛・簡 ・ b： 十十，mUCh StrOn8 reSpOnSe 十，StrOng reSpOllSe
±，Weak reSpOnSe ・，110 reSPOnSe
。：B、ct，，i、hu，b，， i，、leaf di，k（0．7。，）、as c。lmt，d b 凵@pl、川g the 興i・ll・。ll，・・eeks af−・c吻ti・パtt∴ …
．d撃奄戟F、蕊∵：蒜1，：瓢：：㌔，91：1：DNA whicl……ly2ed by
表2
各ベクターのTriparental matingによるF・9への接合効率ブラスミドベクター 受容薗数
（F・・9）
接合体数 接合効率
pSUP205
pSF6
6．6×107
6．0×ioe
5×103
9．2×107
7．5×10−s
l．5×10−t
接合休数
・＊接合効率＝
受容薗数
表3
各X．C．p的㎞磁におけるhrp 域を有するコスミドクローンに対する相同性学名 ｛ltcaeetsi
P ×C F 13−es 体積値 相同性く％）
pXCFI｝44
休積値 相同性《％）
X◆c．PV． citri
X．c．PV．omaae
X．c．pv．（；atpestris
Lg
citrtS802
0M Nl L3
T7174 T7147 T7133 H75373 XC8901 XCC4
X．c． pv． vesicatria TOMXV8991
499167 427560 307893 386639 351400 193213 114660 207084 101496
85．65 61．68 77．46 70．39
38．71 22．97 41．48 20．33
290713 53．67 101123 18．67
88681 16．37
502997 455818 417476 433054 425545 274217 235801 249447 206492
90．62 83．00 86．09 84．60
54．52 46．88 49．59 41．05
404734 79．93 144963 28．63
123735 24．44
計算方法は以下の式に従う 〉．trtln
F＝ v ×100
VL．．9 （％》
v・一・洛継における1硫 Vpr。bc；L−9における休積値
一20r一
表4
RFLP検定による非病原性XarTthcnDrns属細菌における類似性
Car6 1 etUK）e79−t2 1ettL oer79「4 クズ3 b y ダイズX8103 X（淋MG
Car1
踊
1ettぼ7Sト2
1ettu）e79ト4
クズ3by
ダイズX8103 100 100
3434 6060
020200 2
2
43434642
29
29
25
0
20
25
上段；pXCF13−38，下段；pXCF13−44，単位；％
断片バターンにおける類似性の算出方法
オートラジオグラフ1・一 の後、X線フィルム上には様タな位置に様々な濃さのバンドが存在するが、ここで は位置（断片パターン）に関するデーター処理を行う．
誤差±2mmで他のレーンにみられるバンドと一致するバンドおよび比較に用いたバンドの数の合計を記録 して、次の計算式に従って処理された．
・2つのレーンx．yにおいて F＝100（nエ，十nアx）／（nx十ny）
＝200nxr／（nx十nr）
n・uiレーンyでのバンドにr致したレーンxでのバンドの数 nyz；レーンxでのバンドにPt致したレーンyでのバンドの数 n．；レーンxでのパンドの数
n，；レーンyでのバンドの数 F ；類似性《％）
表5
菌株
．；1 ．c．PV．e〃ri野性株及び病原性欠損変異株の テトラサイク．リンに対する最少生育抑制濃度
最 少生育抑制濃度｛MIC）剥
L−9 F−1 F−2
F−−3
F−4
F・・5
F−6 F−7
F・−6
F・・一 9
F・一 10
10μ9／掘1 10μ9！頂1 10μ9ん1 10μ9ん1
10μ9／品1 35μ9／爾1 10μ9／旭1
35μ9ん1
10μ9／回1 10μg／■1 10μg／鳳1
｛＊1）LB培地で一晩培養後、10．102，104celis／mlとなる ように調整し、テトラサイクリンの各濃度に調整したブ レート上にioμ1ずっ滴下する。30℃で2〜7日間培養した 後、生育の有無を観察した。
表6
菌株
X．c．pv．c〃ri野性株及び病原性欠損変異株のク ロラムフェニコ＋ルに対する最少生育抑制濃度
最少生育抑制濃度（MIC）（＊1）
L−9 F−l F−2 F−3 F−4 F−5 F−6 F−7 F−8 F−9 F−10
12μg／稲1 12μg／m1 12μ9／価1 12μ9／ml 12μ9／m1 36μ9／m1 12μ9／祖1 36μ9／ml 12μ9／箇1 12μ9／而1 12μ9／m1
