癌 の遺伝 子治療 田 中 紀 章

癌 の遺伝 子治療

田 中 紀 章

岡山大学医学部第‑外科 特別 講演要 旨

要 旨

癌抑制遺伝子p53の突然変異や欠損 による機能的 異常は､多 くのヒ ト痛で普遍的かつ高頻度 に認め ら れている｡p53タンパ ク質の機能の一つ としては､

細胞増殖 に関す るいろいろな遺伝子の発現制御 を介 した細胞周期の調節が考えられているが､その他 に 最近アポ トーシスの誘導分子 として も注 目を浴 びて きている｡ 正常型p53遺伝子 を有する胃癌 ､大腸癌 では､術前化学療法や放射線療法で癌細胞 のアポ ト ーシスが誘導 されたが､変異型p53を発現す る腫癌 ではアポ トーシスに陥った細胞 はほとんど認め られ なか った｡ヌー ドマ ウスの皮下 に移植 したp53遺伝 子に異常 を持つ ヒ ト肺癌腫癌 にリコンビナ ン ト ･ア デノウイルスベ クターを用いて正常型p53遺伝子 を 導入す る と､抗癌剤 に対す る感受性 が劇 的に増強 し､シスプラチ ンの腹腔内投与 により腺癌 内にアポ トーシスに よる広範囲な組織破壊が認め られた｡ こ の正常型p53発現 アデノウイルスベ クターとI)NA障害 性抗癌剤 を併用 した遺伝子治療 は､臨床的にヒ ト悪 性腫癌 に応用可能 と考 えられる｡

は じめに

最近 の分子生物 学 的解析 技術 の著 しい進歩 に よ り､痛 の発生お よび進展 において遺伝子 レベルでの 変化 が重要 な役割 を果た している ことが明 らか に なって きた｡遺伝性腫蕩疾患 の解析 によりい くつか の癌関連遺伝子が単離 されたが､多 くの自然発生の 痛で も複数の遺伝子 に異常が検出されてお り､多段 階遺伝子異常 と悪性化 は相関す ると考 え られ1)､ こ の癌化 の過程 には､癌遺伝子 と痛抑制遺伝子の二つ の遺伝子 ファミリーが関与 している2) ｡

痛抑制遺伝子 はその正常機能が脱落 した時に細胞 を癌化 させ る ものであ り､遺伝子転写､細胞分裂､

お よびI)NAの修復 な どに働 いてい る｡ 多 くの痛 で は､片方のアレルの痛抑制遺伝子が部分 あるいは完 全欠失 し同時 に対立遺伝子 に点突然変異 などの微少 変異が生 じることで､その痛抑制機能が不活化 され ている｡ 痛抑制遺伝子の場合､機能消失のためには 染色体両腕 に何 らかの異常が必要であ り､劣性 に作 用 している｡

痛抑制遺伝子 の変異や欠失 により引 き起 こされた 癌化の現象 は､単一コピーの正常癌抑制遺伝子 を移

入す る ことに よ り修復 可能 で あ る と考 え られる3) 4)｡ 我々は､多 くの痛でその異常が高頻度 に認め ら れる癌抑制遺伝子p53に着 目し､ リコンビナン ト アデノウイルスベ クターを用いて生体内の癌組織 に 直接invivoで正常型p53遺伝子 を導入する遺伝子治 療 を考 えてい る｡ 本稿 では､p53の生理的機能 につ いて概観 し､p53遺伝子発現 アデノウイルスの機能 と効果 を紹介 し臨床応 用 の可 能性 につ いて言及す る｡

p53遺伝子 の構 造

p53遺伝子は第17番染色体 の短腕上 に存在 し､ll 個のエ クソンを持 って393個 のア ミノ酸 をコー ドし ている｡p53タンパ ク質の生物活性 としては種 々の DNAやタンパ ク質 との結合 に よる転写制御が知 られ ている｡その発見の契機 となったSV40largeT‑an‑

tigenとの複合体 の形成､アデノウイルスEl領域や ヒ トパ ピローマウイルスE6･E7などのウイルスタン パ ク質 との結合 などの他 にE2Fl､MI)M2､nSP70など の細胞 内蛋 白質 との結合が報告 されている5)0p53 は大 きく3つの部位か らなる｡1.p53の転写活性化 を 担 うN末端領域(1‑94番 目のア ミノ酸)､2.DNA結合 ドメインとしてのコア領域(102‑292番 アミノ酸)､

3.C末端領域(319‑360番 ア ミノ懐 まで)の3領域であ る｡ 第2のコア領域 で野生型p53は後述 の特異的DNA 配列 と結合 して転写活性化 を示す｡第3のC末端領域

は核‑ の局在 ､四量体 の形成､非特異的I)NA損傷 の 認識などの多様 の役割 を有す る｡紫外線､放射線に よってI)NAに損傷が生 じると､そのI)NAが転写､複製 される前にnucleotideexcisionrepair反応 によっ て修復 されるが､この機能にp53が関与 している｡

p53遺伝子 の異常 は､多 くの遺伝性お よび自然発 生型 の ヒ ト癌 で認 め られてお り､そ の種類 は大腸 癌 ･肺癌 ･乳癌 ･白血病 など多岐に渡 っている｡ し か し､ほとんどの変異 はコア領域 の第130か ら第290 ア ミノ酸配列領域で検 出されてお り､四つの高度保 存領域Ⅱ〜V(117‑142､171181､234‑258､270‑

286)に限局 している｡ 正常型p53は変異型p53より優 性であ り､対立遺伝子 の両 アレルが同時に点突然変 異 などで不活化 されるか､片方が欠失す ると同時に 他方 に変異が 出現 す る こ とに よ り細胞 は痛化 され る｡変異型p53は正常型p53に比べ て極めて長い代謝

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安定性 を持 ってお り､癌細胞 においてp53タンパ ク 質の発現 レベルは著 しく増強 している｡

正常型p53タンパ ク質の生理機能の一 つと して､

細胞 周期 のチ ェ ック ･ポイ ン トと しての作用が あ る^｡ 最近､p53遺伝子失損 マ ウスの胸腺細胞 を用い た実験系で､p53遺伝子が放射線やDNA障害性抗癌剤 により誘導 されるアポ トーシスにおいて重要 な因子 となっていることが明 らか になって きた6)7)｡

転写 因子 と してのp53

p53は転写 因子 として多 くの遺伝子発現 を制御 し てお り､その結合塩基配列 は5'‑RRRC(A/T)(T/A) GYYY‑3'(Rはプリン､Yは ピリミジ ン)と同定 されて いる｡このp53特異的結合配列(p53responsiveele一 皿ent:p53RE)には2分子のp53が結合 し､4量体 を形成 す る｡p53は0‑10bp離れてタンデムに並 んだp53RE にそれぞれ作用する とされている8)o正常 なp53は､

p21vafl/cipl､gadd45､baxな どのp53REを持つ プロモ ーターに対 して転写 を活性化 し､それぞれの遺伝子 発現 を促 進す る9)10)｡また ､p53REを持 た ないC‑

jun､C‑fos､C‑myc､interleukin‑6､Rb (retino‑

blastoma)､bcl‑2などい くつかの遺伝子 は､p53に より転写が抑制 されることが知 られている11)12)｡

細胞周期 の調節 はp53の最初 に明 らかになった機 能であ り､下流 に存在する関連遺伝子の相互関係が 解 明 されつつある｡放射線 や薬剤 に よりDNAの損傷 が生 じる と細 胞 内 のp53の過剰 発現 が 見 られ ､ cyc)in‑dependentkimase(Cdk)阻害蛋白質である p21yafl/ciplが活性化 される13)｡通常 の細胞周期過程 では､Rbの リン酸化 によりRbと転写 因子E2Fの結合 が離 れ､連離 したE2Fの働 きでS期へ と移行 してい る｡ しか し､p21vafl/ciplレベ ルの上昇 は､cdkファ ミリーの活性 を阻害LRbの リン酸化 を防 ぐことで細 胞周期のG1期か らS期‑の進行 を停止 させる14)0

p53により転写 が抑制 される遺伝子 の うち細胞 周 期調節 に関与す る遺伝子 と して最 も重要 な もの は pcNAである｡p53により転写が活性化 されるMDM2は p53に直接結合することによりp53の配列特異的転写 活性化 を阻害 してネガティブ ･フィー ドバ ックの役 割 りを果た している｡

癌細胞 に外来性 に正常 なp53遺伝子 を導入 しp53の 過剰発現 を来す ことで､この細胞周期停止 の現象 を 人工 的 に引 き起 こす こ とが で きる¹⁵⁾｡ しか し､ 肉 眼的な固形腫癌 の治療 を考 えた場合 ､増殖抑制 のみ では腫蕩縮小 は期待 で きず､何 らかの細胞障害活性 が必要である｡

p53遺伝 子 導入 に よ るアポ トー シス誘 導

アポ トーシス (プログラム細胞死)はネクローシス (壊死)とは異 なる細胞死 の形態で､特異的 なDNAの 断片化 を特徴 とす る生体内 における生理的細胞 除去

の過程である｡DNA損傷 によ り細胞周期が停止 した 時点で通常I)NA損傷 の修復が試み られるo 前述 の と お りp53はこのI)NA修復 に関与するが､それが不可能 な場合､その細胞 はアポ トーシスに陥 り生体内か ら 除去 される^｡ このアポ トーシスの過程 に も正常 な p53機能が関与 してお り､DNA損傷以外 にもC一皿yCの 過剰発現や血清､成長 因子の除去 などのス トレスに より誘発 されるアポ トーシスはp53依存性 であると されている｡実際 に､正常 なp53遺伝子 を外来的に 導入することで､多 くの癌細胞 でアポ トーシス細胞 死が観察 される16)17)｡最近著者 らは､p21,a一l/cipl遺 伝子導入でG1期 に停止 した ヒ ト培養癌細胞 にさらに p53遺伝子 を導入す ると直後 より顕著なアポ トーシ スが認め られ､ この系 においてはp53によるアポ ト ーシスがp21によるG1期停止 より優位 に作用す るこ とを報告 した18)｡ さらに､p53に よりG1期 に停止す る大腸癌細胞 とアポ トーシスを生 じる大腸癌細胞 を 融合 させ る と､p53遺伝子発現 によ りアポ トーシス が認め られ､p53依存性 アポ トーシスは細胞周期停 止 よ り優 位であ った とい う報告 もある19)｡す なわ ち､ある種 の癌細胞 においてはp53遺伝子 は強力 な アポ トーシス ･イ ンデューサーとして機能する｡

しか し､ どの ようにアポ トーシスを誘導 している か という細胞内でのメカニズムについてはいまだ不 明な点が多い｡p53はアポ トーシスを誘導するbax遺 伝 子 を活性 化 し10)､逆 にアポ トー シス を抑 える bcl‑2遺伝子 の転写 を抑制する12)｡ これ らの遺伝子 産物 は相互 に結合 し､BaxとBcト2がヘテロダイマー を形成す るとアポ トーシスは抑制 され､Baxが ホモ ダイマーを作 るとアポ トーシスを誘導するように作 用す る｡ また､p53はアポ トーシスのシグナル伝達 に重要 なFas/Ap0‑1分子の発現 を増強する20)｡ しか し､多 くの ヒ ト培養癌細胞 を用いたp53遺伝子導入 実験 において､アポ トーシスの発生 とこれ らの分子 の発現 レベル とは必ず しも相 関 してお らず､p53を 介 したアポ トーシスの誘導機構 は単一の ものではな い と考 え られる^｡

p53遺 伝 子 変 異 に よ る化 学 療 法 お よ び放 射 線 療 法 に対 す る抵抗性

p53遺伝子 も前述 の如 くアポ トーシスの経路 に影 響 を与 えてお り､その異常はアポ トーシス耐性 の機 構 の一つ と考 え られてい る｡最近､p53遺伝子欠損 マ ウスか ら得 た線維芽細胞 をアデ ノウイルスElと ras癌遺伝子で癌化 させ ヌー ドマウスに移植 した腺 癌 は抗癌剤 や放射線 に感受性 を示 さないが､p53遺 伝子 を持つ正常マ ウスの線維芽細胞 か ら誘導 された 腫癌では顕著 な治療効果が認め らるとい う報告がな された21)22)｡また､我 々 もp53遺伝子のアポ トーシ ス感受性‑ の関与 を検討するために､術前化学療法 あるいは放射線療法 を施 した 胃痛お よび大腸癌 の手

術標本 をinsituで アポ トーシスを確認で きるtern)irLal deoxy‑IluCleotysiltransferase‑mediatednickend labeling (TUNEL)23)にて検索 した｡ 正常型p53遺伝 子を持つ腫癌ではアポ トーシスを里 した癌細胞が多 く認め られたが､変異型p53を発現す る腫痔ではア ポ トーシス に陥った細胞 はほ とん ど見 られなか っ た｡ したが って､臨床 の痛 において もp53遺伝子 の 異常 は抗癌剤耐性 に重要な役割 を果た してお り､正 常型p53遺伝子 を導入することで抗癌剤の感受性 ､ すなわちアポ トーシス感受性 を誘導することがで き ると期待 される｡

p53遺伝 子 導入 の た めのアデノウイルスベ クター 遺伝子を､ターゲ ッ トとなる細胞 に効率良 く導入 するベ クターとして最 もよく用い られているのは､

マウス由来の レ トロウイルス ･ベ クターである｡ 米 国で行 われているほ とんどの遺伝子治療の臨床 プロ トコールはこのシステムを使用 しているが､このベ クターの短所 としては高力価 のウイルスを得ること が困難 なこと､活発 に増殖 している細胞 に しか感染 で きないことなどがあげられる｡そ こで近年､高力 価の ものが得 られ､非増殖性細胞 にも感染可能なア デノウイルスベ クターが脚光 を浴 びるようになって きた｡我 々は､生体内で増殖で きない ように修飾 さ れたアデノウイルスベ クターを用いて､正常型p53 遺伝子発現 アデノウイルス を作成 した24)25)｡ サ イ

トメガロウイルス .プロモーターお よびp53cDNAを シャ トル ･ベ クターであるpXCJL1のXbal/ClaI制限 酵素切断部位 に挿入 し､アデノウイルス5型 のゲノ ムを持つpJM17とともにAdEIA移入 ヒ ト胎児腎臓細胞 293に トランスフェク 下したocytopathiceりect

(CPE)を示す293細胞 の培養上清 を集め､293細胞 内 での リコンビネーシ ョンに よりp53遺伝子が アデノ ウイルスベクター内に組み込まれたことをpolymerase chainreactions(PCR)にて確認 し､その上清 をウイ ルス液 として実験 に用いた｡

p53遺伝子 導入 による抗 癌 剤 感 受性 の誘 導 正常型p53遺伝子 を持つH226細胞 はシスプラチ ン やエ トポシ ドなどの抗癌剤 に感受性があ り､24時間 処理後 はほ とんどの細胞がアポ トーシスに陥ってい る｡ しか し､p53遺伝子 を欠失 しているH358細胞 は シスプラチ ン抵抗性 で､24時間処理 して も細胞 は増 殖 を続 けた｡ また､正常型p53遺伝子 を導入す るこ とである種 の細胞ではアポ トーシスが誘導 されるこ とが報告 されているが26)27)､H358細胞ではp53遺伝 子の発現 のみではアポ トーシス は認め られなか っ た｡

単層培養n358細胞 に正常型p53遺伝子発現 アデノ ウイルスを感染 させ､その後 シスプラチ ンで24時間 処理 した ところ､直後か ら細胞数の著 しい減少が見

られ､ゲノムDNAのアガロース電気泳動でアポ トー シスに特異的なDNAの断片化が認め られた｡

さらに､p53遺伝子導入 に よるシスプラチ ン感受 性 の誘導がinvivoで も可能か どうかヌー ドマウス を用いた実験 を行 った｡H358細胞 を4週齢雌のヌー ドマウスの皮下 に移植 し､腫蕩径が約5mmとなる30 日後 よ りp53アデノウイルス を腫蕩 内に局注 し､同 時にシスプラチ ンを腹腔内に投与 した｡ これを連続 3日間繰 り返 し､腫療径 の変化 を観察 した｡p53ア デノウイルス単独投与で も腺癌増殖 の軽度抑制が認 め られたが､シスプラチ ンの同時投与 により腺癌の 部分的退縮が見 られ､腫蕩径 は他の どの治療群 より 有意 に小 さ く保たれていた｡組織学的検討では､同 時投与群ではウイルスの局注部位 に広範な組織破壊 が見 られ､TUNEL染色 陽性 の細胞が周辺の痛組織 と の境界 に多数存在 した｡

バ イス タ ンダー効果

アデノウイルスベクターに先行 した正常型p53遺 伝子発現 レ トロウイルスベ クター (ITRp53A)の臨床 試験 の初 期9例 の解析 結果 はすで に報告 されている

28)｡ 臨床例 で認 め られ た局所 的 な腫 蕩縮小 効 果 は､ レ トロウイルスベクターのinvivoでの遺伝子 導入効率か ら予測 される以上の ものであ り､遺伝子 導入 された細胞がその近傍の遺伝子導入 されなかっ た細胞 に影響 を与 える､いわゆる''バ イスタンダー 効果"の関与が示唆 される｡ 単純 ヘルペス ･チ ミジ ンキナーゼ遺伝子 を用いた 自殺遺伝子治療では､バ イス タンダー効果が認 め られ る とい う報告が多 い が､その他のinvivo遺 伝子治療 ではまだほとんど その存在 が証明 されてい ない｡ 筆者 らは､現在 ､ p53の標的遺伝子の中で血管新生 に関す る遺伝子群

に注 目して基礎研究 を行 っている｡

固形腫癌が増殖するためには腫蕩組織‑の血液補 給のための新 しい毛細血管の形成が不可欠であ り､

血管新生能を獲得 した癌細胞が近傍の既存血管か ら 新生血管 を誘導す る ことで増殖 が開始 される｡最 近 ､線維芽細胞 においてはp53は血管新生抑制 因子 であるthrombospondin‑1(TSP‑1)の発現 を増強 し

29)､ また癌細胞ではvascularendothelialgrowth factor(VEGF)の プロモ ーター活性 を抑 えることで VEGFmRNAレベルを下 げることが確認 された30)｡ こ れ らの結果 は､正常 なp53遺伝子導入で血管新生関 連遺伝子の発現 を修飾 し､血管新生 を阻害すること で腫蕩増殖 を抑制で きる可能性 を示唆 している｡ 筆 者 らの実験で も､p53遺伝子 に変異 を持つ ヒ ト非小 細胞肺癌細胞‑ アデノウイルスベ クターにより正常 なp53遺伝子 を導入す ることで､VEGFの蛋 白質 レベ ルが著 しく減少 した｡invivo遺伝子導入 を考えた場 合､p53遺伝子が導入 された癌細胞 か らの血管新生 因子の分泌が減弱すれば､パ ラクリン機構で近傍の

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遺伝子導入 されなか った癌細胞 に も影響 を与 え､バ イス タンダー効果が期待 される｡ 今後､ このメカニ ズムを検討す ることで､腫癌 を構 成す る100%の癌細 胞へ の遺伝子導入 は困難であるとい う現在 のベ クタ ーの限界 を改 善す る方法 を開発 で きるか も しれ な

い ｡

p53遺 伝 子 の癌遺伝 子 治療 へ の応 用

以上の知見 や前述 の基礎実験結果 を もとに､我 々 は正常型p53遺伝子発現 アデ ノウイルスベ クターを 用いて抗癌剤耐性 を克服す る遺伝子治療 の臨床 プロ トコール を提案 している｡ 対象 はp53遺伝子 に異常 を持つ肺癌 であ り､内視鏡 的 にp53アデノウイルス を腫蕩 内に局注､ さらにシス プラチ ンの全 身投与 を 併用す る｡腫痕 の部分 的退縮が見 られ､切 除不 能の 癌が切 除可能 となれば術前補助療法 として有効 であ ると考 え られる｡

文 献

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