Analysis of Numerical Chromosome Aberration of Gastric Cancer: Application of Fluorescent in situ Hybridization using Chromosome Specific DNA Probes.

Acta Med. Nagasaki 37:163-170

Analysis of Numerical Chromosome Aberration of Gastric Cancer:

Application of Fluorescent in situ Hybridization using Chromosome Specific DNA Probes.

Hiroyuki Yamaguchi

First Department of Surgery, Nagasaki University School of Medicine

Abstract: An analysis in the numerical chromosome aberration of human gastric cancer was made by applying fluorescent in situ hy- bridization (FISH) with chromosome specific DNA probes. Thirteen primary tumors and four metastatic lymph nodes were surgically resected from thirteen gastric cancer patients and analyzed. FISH using a satellite DNA probes of chromosomes 1, 3, 7, 11, 17 and X was applied to interphase cells of each sample, then the signal spot number In each nucleus was counted. DNA ploidy from the flow cytometric analysis of nuclear DNA content was compared with chro- mosomal aberration from FISH analysis. Numerical chromosome aberration, especially a gain in chromosomes, occurred more fre- quently in DNA aneuploid cancers than in DNA diploid cancers.

Numerical gain of chrmosomes 7 and 17 were significantly more frequent in DNA aneuploid cancers. Since gastric cancer with a gain in chromosome 7 and/or 17 is often accompanied with a high level of metastasis in lymph nodes and/or distant metastasis, it is suggested that numerical gain of those chromosomes must be related to the ability of metastasis or growth in metastatic regions. Since the FISH study could detect numerical chromosome aberration in DNA diploid cancer, we will be able to further study the DNA diploidy of clinical materials by using this technique. Because FISH has made it possible to detect the chromosome number rapidly in the interphase cells, it is hopeful that human solid cancer chromosome analysis will rise as these materials for analysis increase and that we will take long strides in cytogenetic research of cancer in the near future.

Introduction

Although the close relationship between cancer and its chromosome aberrations has been well documented, we can not yet conclude that there is a cause/effect relationship in human solid cancer. One important reason is that it is very difficult to try and apply the conventional banding methods to solid cancer, as it is arduous to obtain meta- phase cells suitable for chromosome analysis. Recently it became possible to detect the targetted chromosomes of interphase cells by utilizing Fluorescent in situ hybrid- ization (FISH) using chromosome specific DNA probes, which were developed in molecular biology.'-') Application of this method has made it possible to analyze the chro- mosome number of human solid cancer cells as seen in the interphase.")

It has not been long since this technique was developed, so that FISH is not prevalent as a mature method because it still holds some problems. It is more advantageous to use the FISH method and therefore analyze chromosomes from interphase cells, than to use conventional analysis methods.

This is due to the fact that even though we can obtain good metaphase spreads, chromosomes may be affected by the proccess of modification and selection. FISH also has the merit of being able to compare DNA ploidy analyzed by flow cytometry and chromosomal ploidy of the same materials in the same condition. Therefore I tried to detect chromosome aberration of gastric cancer by applying this method to fresh surgical specimens, comparing the nuclear DNA content with the chromosome number and then eval- uating the utility of FISH.

Materials and Methods

Between December 1989 and September 1990 at the First Department of Surgery of Nagasaki University School of Medicine, thirteen primary tumors, four metastatic lymph nodes and three normal gastric mucosa were surgically resected from thirteen patients who had been diagnosed with gastric cancer. The identification of gastric cancer was in accordance with the stipulations listed in the General Rules for the Gastric Cancer Study in Surgery and Pathol-

ogy: the eleventh edition (Japanese Research Society for Gastric Cancer).'' Patients were eight males and five fe- males, 46-80 years of age (mean 60 ± 10.8). The histo- logical depths of cancer were one sm, two pm, one ss /3, two ss 7 and seven cases se or sei. The histological stages were two stagel, one stageII, seven stage DI and three cases stage N , most of them being advanced cases. The meta- static lymph nodes were resected from Cases 5, 7, 10 and

13 at the same time by gastrectomy, and were diagnosed as metastasis from a primary tumor using pathological proce- dures.

Sample Preparation

About 1 cm' of both primary tumor and normal gastric

1 64 

mucosal tissue and one half of the metastatic lymph nodes  were picked up from fresh tissue samples after surgical  resection. The opposite side of the samples (that is, the one  half remaining) were formalin fixed and pathologically  confirmed as either cancerous or normal tissue by Haema‑

toxyline‑Eosine stain. Fresh samples were rinsed twice in  PBS (phosphate‑buffered saline) and minced using a scal‑

pel. They were then incubated in 0.05% collagenase/RPMI 

‑  640 with lO% fetal calf serum for 30 min at room  temperature (RT) to obtain cell suspension. 

After filtration through 100 /Im and 50 /4m nylon mesh,  they were again rinsed twice in PBS. Hypotonic treatment  was incubation in 75mM KCI for 20 min at 37  ) . Cells  were fixed in ethanol/acetic acid (3: I ) three times for 5 min  each and stored at ‑ 20 qC . One part of the fresh cell  suspension from the cancerous tissue was treated in 0.1% 

Triton X‑100 and r suSpended in propidium iodide solution  (final concentration of 50 /1/ml in 100 /1 /ml RNase/PBS). 

Flow cytometric analysis of the nuclear DNA content was  finally performed using the FACS IV (Becton‑Dicki nson). 

DNA probe 

The a ‑satellite DNA probes specific for chromosomes I , 3,  7, Il, 17 and X (biotinylated DIZ5, D3Z1, D7Z1, Dl IZl,  Dl7Zl, DXZl) were obtained commercially (ONCOR  CO.) DNA probes were used in the hybridization mix')'  50% formamide, lO% dextran sulfate, 500 /lg/ml salmon  sperrn DNA, 0.5 /lg/ml DNAprobe, 2xSSC (0.3 M NaC1,  30 mM sodium citrate, pH = 7.0) 

Hybrid ization 

FISH with Dl7Zl and DXZI were first applied to the  samples from normal gastric mucosa, and then respectively  applied to all samples from cancerous tissue with probes. 

Cell suspension fixed in ethanol/acetic acid was dorpped  onto a poly‑L‑lysines) coated slide and air dried. After  rinsing twice in PBS, pretreatment') was performed in  0.01% pepsin (SIGMA CO.)/O.2N HCI at 37  C for 15 min  and then postfixed in 4% paraformaldehyde/0.1 M PBS at 4  'C for 10 min. After dehydration in a series of cold ethanol  treatment, the slides were incubated in 0.25( o acetic anhy‑

drate/0.1 M Tris‑HCI ph = 8.0, and then rinsed twice in  2xSSC. Nuclei on the slide were incubated in 70% forrna‑

mide/2xSSC at 70  C for 2 min to denature target DNA, and  then dehydrated in a series of cold ethanol treatment. 

Denaturation of the probes was done at 70 qC for 10 min,  and then 20 ml of the hybridization mix was added to the  slides, then sealed with rubber cement under a coverslip. 

Hybridization was performed overnight in a moist chamber 

at 37  C . 

H. Yamaguchi: Numerical chromosome abenation of gastric cancer 

Cytochemical Stndy 

After hybridization, the slides were washed in 60% forrna‑

mide/2xSSC (two times at 42  C for 10 min) followed by  washes in 2xSSC (two times at 37  C for 5 min) and in  0.05% Tween‑201PBS at 37  C for 5 min. Thereafter the  slides were incubated with 5% nonfat dry milk/0.05% 

Tween‑20 in 4xSSC5) (MSTbuffer) for 5 min at room  temperature. Detection of biotinylated probes was achieved  by incubation with 5 /tg/ml FITC conjugated avidin DCS  (Vector Labo. Inc.)/MST buffer for 20 min at 37  C . A11  washes were carried out in 0.05% Tween‑20/PBS. The  probe linked fluorescence was amplified by incubation with  5 /lg/ml biotinylated anti‑avidin antibody (Vector Labo. 

Inc.)/MST buffer for 20 min at 37  C and again incubation  for 20 min with 5 /1 g/ml FITC conjugated avidin DCS. All  preparations were counterstained with I /tg/ml propidium  iodide (SIGMA) and then visualized on a fluorescence  microscope (OLYMPUS BH‑2). Fluorescence signal spots  per nucleus were counted on about 400 nuclei. The Stu‑

dents' t test was applied in all statistical comparisons. 

Result 

Normal Gastric Mucosa 

The result of FISH applied to the normal gastric mucosa  from three male patients using chromosome 17 and X  specific probes (Dl7Z1, DXZ1) is displayed in Table 1. 

The average appearance rate of nuclei with no signal spot  in chromosome X was 1 1 .9%, and nuclei with one signal  spot was 8 1 .4% . The average appearance rate of nuclei  with two, three and four signal spots were 5.7%, 0.9% ans  0.1% respectively. With regard to chromosome 17, nuclei  with no and one signal spot were I . I % and 14.5% respec‑

tively. Nuclei with two signal spots were 82.7% and those  with three and four signal spots were 1.1%, and 0.5% 

respectively. Although normal male cells containing chro‑

mosome X should be monosomic and chromosome 17 

disomic, nuclei with one or two signal spots from the FISH  study were a little over 80%. Nuclei with less than two  spots in chromosome 17 and with less than one spot in  chromosome X were both over lO%, and nuclei with a spot  nurnber greater than that of normal chromosomes ranged  from under I % to 7%. At this time, in order to analyze the  FISH study applied to solid cancer consisting of hetero‑

geneous cell populations, evaluation of the results were  performed as follows for the sake of convenience. 

When nuclei with less than two signal spots in chro‑

mosome 1, 3, 7, I l, 17 or less than one signal spot in 

chromosome X were present over 20%, it should be ruled 

that a population (stem line) that loses a chromosome must 

exist and that this shall be designated "L". When nuclei 

with signal spots greater that two in chromdsome I , 3, 7, 

H. Yamaguchi: Numerical chromosome aberration of gastric cancer  Table 1. 

The result of FISH using chromosomes X and 17 (DXZI, Z17Z1)  applied to normal gastric mucosa. Signal spot number per nucleus  was counted using 400 nuclei, which were well morphologically  reserved and clear counterstained. The percentages of cells with  each respective number of signal spots is indicated. The upper  figure is a histogram of the results. 

% gO  80  70  60  50  40  30  20  10 

Spot no. O  O  1 2 3 4 

probe : DXZ1  O 1 2 3 4 

probe : D17Z1  probe: D17Z1 

1 65 

l 1, 17 or greater than one signal spot in chromosome X  were present over lO%, it should be ruled that a population  (stem line) that gains a chromosome must exist, and that  this shall be designated "G". For example, when nuclei  with three or four signal spots were present over lO% 

respectively using the chromosome 17 specific probe  (D17Zl), it was ruled that the population which had a gain  by one or two more of chromosome 17 must exist, and  furthermore be designated "GG2". 

case 

Spot no. O  _{1  2  3  4} 

l 

2  3 

l .5 

0.3 

1 .6 

12.7  13.8  17.0 

82.4  84.4  81.4 

1 .9  1 .5 

O 

1 .5 

O  O  mean 1.1 i 0.7 14.5 i 2.2 82.7d: 1.5 1.1 :!: 1.0 0.5 i 0.9 

probe: DXZ1 

case 

Spot no, O  _{1  2  3}  4 

2  3 

ll.8  14.5  9.3 

83.8  79.0  81.5 

4. 1 

6.1  7.0 

0.2  0.4  2.2 

0.2  o  O  mean 11.9 d: 2.6 81.4 :!: 2.4 5.7 i 1.5 0.9 d: 1.1 0.1 i 0.1 

Primary Tumor and Metastatic Lymph Node 

The nuclear DNA content of thirteen primary tumors and  four metastatic lymph nodes were analyzed with flow  cytometry, showing eight lesions to be DNA diploid and  nine lesions to be DNA aneuploid. The result of the FISH  study from all seventeen lesions (primary tumor and meta‑

static lymph nodes) was evaluated according to the criteria  prediscribed, and compared with patholgical studies and  DNA ploidy (Table 2). Because of sample shortages, FISH  with DIZ5, D3Zl and DXZI could not be applied to the  Case 4 primary tumor, and likewise with D3Zl to the Case  8 Iymph node. For example in Case 3, a flow cytometric  study revealed DNA aneuploid (DI =1.20) and the FISH  study indicated that the population lost one chromosome 3,  gained one more chromosome 7, and a gain in one and two  more chromosome I I were present (Fig. Ia, Ib, 2). 

In Case 13, flow cytometric measurement of nuclear  DNA content showed DNA aneuploid (DI = I .37, 1.87) in  the primary tumor and DNA diploid in the metastatic  lymph node. FISH analysis of the chromosome number 

Table 2. 

FISH study applied to thirteen primary tumors and four metastatic lymph nodes using DIZ5. D3Zl, D7Zl. DllZ1, D17Z1, and X was  evaluated, and the result of evaluation is displayed above. T: primary tumor, LN: metastatic lymph node, DD: DNA diploid, DA: DNA  aneuploid, *: absence of population with abnormal number of that chromosome, G: presence of population with one gain of that  chromosome, G2: presence of population with two gain of that chromosome, GG2: combination of both G and G2 L: presence of  population with one loss of that chromosome, NI: non informative because of unsatisfactory hybridization, /: not applied due to sample  shortage, nO: means n( ‑ ). 

Gastric cancer 13 cases 13 primary tumors 4 metastatic lymphonodes 

case tissue 

#1 

chromosome number 

# 3 # 7 # 11  ^# 17  # X content differ. depth LN meta. stage  ^DNA 

2  3  4  5  5  6  7  8  8  9  10  10  11  12  13  13 

T  T  T  T  LN  T 

T  T  LN  T 

T  T  LN  T 

T  T  LN 

NI  NI 

/ 

NI  NI  NI 

GG2  NI 

G2  G 

NI  NI  NI  NI 

L 

/ 

NI  G 

NI 

G  / 

NI  NI  NI  NI 

G 

GG2  G  G2  G2  L  L 

G  L  L  L  G 

GG2  G  GG2  G  G 

G 

G 

GG2  G  L  G 

G  G  G  G 

NI 

/ 

G  GG2  G 

G  G  G 

G  G 

DA  DD  DA  DD  DA  DA  DD  DD  DD  DD  DD  DA  DA  DA  DA  DA  DD 

mod 

por  tub2  por  por  por  por  por  tub2  por 

tub2  tub2  por 

ss 7  sm 

se  se  sei 

se  se  se 

ss P 

pm 

ss 7  pm 

se 

n2  nl  nl  nl  n3  n2  nl  nl  nO  n2  nO  n2  n2 

nl 

I 

lrr  lrr 

rv  IV 

M 

lrr 

I  nl 

I 

lrr 

rv 

1 66 

Fig. Ia. FISH using the chromosome 17 specific probe (D17Z1)  as applied to the primary gastric tumor from case 3. Most of the  nuclei contain two signal spots. 

H. Yamaguchi:  Numerical chromosome aberration of gastric cancer 

Fig. Ib. FISH using the chronosome 11 specific probe (D11Z1)  as applied to the primary gastric tumor from case 3. Two, three,  four or five signal spots are seen in each nucleus. 

90  e   TB  e   5O  dO  30  20  l9  G 

Nl  L 

pr i mary tumor 

G  G 

02  N 

spot  be* 

RO 

E 11 

12  ₃  4  5 

u* *3 *7 M*1 nl7 u* 

Fig. 2. The primary tumor from case 3. Analysis of nuclear DNA  content by FCM revealed DNA aneuploid (DI=1.20). Analysis of  the chromosome number by FISH revealed a loss of chromosome  3 and gain in chromosomes 7, 1 1 and a 2 signal spot gain in  chromosome 1 1 . 

indicated presence of the populations with a gain in chro‑

mosome 3, 7, I l, 17 and X in the primary tumor and the  population with a gain in chromosomes 17 and X in the  metastatic lymph node (Fig. 3). 

The abnorrnality rate in each chromosome was not  particularly high, although chromosomes 7, I I and X  showed a rate of over 50% (Table 3). 

Thirteen cases were divided into two groups according  to stages, and then the numerical aberration of each chro‑

mosome was evaluated. Abnormality rates of chromosome  l and 17 in the advanced group (stages Ill and IV ) were 

Dl=1 . 37  Dl=1 . 87 

.'. 

90  80  TO  60  50  40  3G  2   1    

pr i mary  tumor 

rtl 

n3 

^tt7 

ull  ul7 

^rtx 

spot number 

=EO  E ]l 

12  ₃  4  ₅ 

.'. 

90 

8el 

T   60 

5 ] 

4G  3   2   I    

metastat i c  l ymphnode 

l  3  7 

^rtl 1 

ul7  nx 

NI:non informative 

Fig. 3. The primary  tumor and metastatic  lymph node from case  13. Analysis of nu‑

clear DNA content by 

FCM revealed DNA 

aneuploid (DI = 1.37  and DI = I .87). Anal‑

ysis of chromosome  number by FISH re‑

vealed a gain in chro‑

mosones 3, 7, 11, 17 

and X. 

H. Yamaguchi:  Numerical chromosome aberration of gastric cancer  Table 3. The incidence rate of populations with an abnormal  number in each chromosome. 

probe  Gain  Loss  ^Total 

#1  #3 

# Il  #7 

# 17 

#X 

3 (50.0%)  3 (33.3%)  6 (35.3%)  7 (41 .2%)  7 (41 .2%)  8 (50.0%) 

O ( O%) 

1 (11'1%)  5 (29.4%)  4 (23.5%)  1 ( 5.9%)  2 (12.5%) 

3/ 6 (50.0%)  4/ 9 (44.4%)  1 1/17 (64.7%)  l l/17 (64.7%)  8/17 (47.1 %)  10/16 (62.5%)  34 (41.5%) 13 (15.9%)  47/82 (57.3%) 

1 67 

lower than in the relatively early group (stages I and II). 

However, the abnormality rates of the four chromosomes  were higher in the former than in the latter. This especially  true conceming chromosome X, where aberration did not  occur in any case in stage I or II, but did occur with 8 cases  out of 10 in stage Ill and IV . Of the 8 cases, 7 caese  showed a gain in chromosome X and one case showed a  10ss in chromosome X. The abnormality rates were there‑

fore significantly higher (p < 0.01) in stages ID: , IV than in  stages I, 11 (Table 4). 

Table 5. 

The incidence rate of populations with an abnormal chromosome  number as evaluated between DNA diploid and DNA aneuploid  groups (a). Further evaluation was bone in each chromosome (b). 

Numerical aberration (other than the O% gain of diploid chro‑

mosome 7) was significantly more frequent (p < 0.05 and p < 

0.01) in the DNA aneuploid group campared with the DNA  diploid group. The numerical gain in chromosome 17 was very  significant (p < 0.01) in the DNA aneuploid group when com‑

pared with the DNA diploid group. The incidence rate of numer‑

ical loss in each chromosome was not significantly different  between the two groups. 

DNA ploidy  Loss  Gain  Total 

diploid  (n = 8)  aneuploid 

(n = 9) 

6/39  (15.4%) 

7143  (16.3%) 

1 1/39 

(28.2%) *  23/43  (53.5%) * 

1 7139 

(43.6%)* 

30/43  (69.8%)* 

Table 4. 

The incidence rate of populations with an ahnormal number in  each chromosome was evaluated between pathological stages. 

Numerical aberration, especially a gain chromosome X showed  significant frequence (p < 0.01) in the advanced group (stages 111: 

and IV ) compared with the relatively early group (stages I and II). 

The incidence of numerical loss showed no significant differences  in each chromosome between the two groups. 

* p < 0.01 

All seventeen cancer lesions (primary and metastatic)  were then divided into DNA diploid and DNA aneuploid  groups and numerical chromosome aberration was evalu‑

ated. Populations with abnormal chromosome number were  also detected in DNA diploid cancer lesions. The abnor‑

* p < 0.01  * p < 0.05 

*   P < 0.01  **   P <0.05 

mality rates were 43.6% in the DNA diploid and 69.8% in  the DNA aneuploid groups. From Table 5a, we see that the  rates of chromosome gain were 28.2% in the DNA diploid  group and 53.5% in DNA aneuploid group, and therefore  were significantly higher (p < 0.05) in the latter versus the  forrner group. 

The abnormality rates in each chromosome in the DNA  diploid and DNA aneuploid group were evaluated as shown  in Table 5b. Those of chromosomes 7 and 17 were signifi‑

cantly higher (p < 0.05) in both the total % and gain % in  the DNA aneuploid group than in the DNA diploid group. 

Five cases (case 1, 3, 5, I I and 13) whose primary  lesions had populations with a gain in either chromosome 7  or 17 were reevaluated, and found to all be DNA aneuploid  lesions. Case I , 5 and 1 3 which had a gain in both chro‑

mosome 7 and 17, were all found to have a high level of  lymph nodes metastasis, although case I was "sm" with 

Table 6. Five cases whose primary 

metastasis, P:peritoneal dissemination.  tumor  had populations with  a gain of  chromosomes  ^7 and/or  17. F:female,  M:male,  H:1iver 

case  sex gained 

chromosome no. 

other numerical  chrom . change 

DNA ploidy 

(D. I.)  depth  lymphnode 

metastasis  H  ^{P  stage} 

3  11 

l 

5  13 

M  F  F 

M  F 

#7  # 17 

# 7, # 17 

# 7, # 17 

# 7, # 17 

# 3L, # 11G 

# 7L 

# 11G, # XL 

# 3G, # 11L, # XG 

# 3G, # 11G, # XG 

DA (1 .20)  DA (1 .23)  DA (1 .23)  DA (1 .24, 2.20)  DA (1.27, 1.87) 

se 

pm  sm 

sei  se 

nl  nO  n2  n3  n2 

o  o  o  O  3 

O  O  O  2  o 

M  I  rv  M 

N 

1 68 

respect to lesion depth. Two cases had liver metastasis or  peritoneal dissemination, although those metastases were  present in only three of the seventeen cases (Table 6). Two  cases (case 5 and I O) of four metastatic lymph nodes were  shown to be DNA aneuploid, all with population gains in  chromosome 7 and 17. 

Discussion 

Although chromosome aberration of human solid cancer  has been researched for many years, the reports are still  insufficient and the results show a great number of differ‑

ent directions. The same is true with most of the human  gastric cancer researches, which end with the consensus, as  I do that investigation in this area has been and is diffcult,  although my investigation has shed more light in this area. 

Genetic research of cancer has been improved by the  development of a new molecular biological technique 

called "in situ hybridization" which is able to be applied to  interphase cells. The word "interphase cytogenetics"*) has  been proposed. It is one of them to detect the targetted  chromosome number of a cell, as it is in interphase, using  DNA probes specific to the repetitive sequence on the  centromeric region of each chromosome. The study of  human solid cancer utilizing this method is already begin‑

ning to be reported. At this time I tried to analyze chro‑

mosome aberration of human gastric cancer using  Fluorsecent in situ hybridization (FISH) in which the  hybridized probes are cytochemically fluorescence‑labeled. 

Since this method has some problems which must be  improved for future use, it is itnportant that we recognize  the present shortcomings during research. An example is  demonstrated from the result of FISH applied to normal  gastric mucosa. Although they are norrnal cells which  should be disomic in each chromosome (and monosomic in  the male sex chromosome), the number of signal spots in  each cell is not always two (or one), but scattered. This  occurs from two causes. First, the probes are limited  because they can not access and hybridize to all targetted  sequences, therefore showing nuclei which have fewer  signal spots than the actual chromosome number. And  second, we overestimate the spot number which results in  an arnount that is greater than the actual chromosome  number, because we cannot distinguish the spot due to  cross‑hybridization from the true signal spot. 

There is therefore room for improvement with this tech‑

nique, such as improving the accessibility of the probe to  target DNA and making conditions more stringent conse‑

quently enhancing specificity of hybridization. There are  further problems that might be recognized as numerical  aberration, such as when a structural or functional abnor‑

mality involving the centromere takes place on the targetted  chromosome. Since the success rate is still low in some  probes, it can not yet be valued for all chromosomes. In 

H. Yamaguchi:  Numerical chromosome aberration of gastric cancer  this study the success rate was low: 37.5% for DIZ5 and  60% for D3Z1, and hence the analysis of chromosomes l  and 3 was insufficient. 

In the present situation, we can expect that if we apply  FISH to solid cancer consisting of a heterogeneous popula‑

tion and try to detect numerical chromosome aberration,  there would be a complication which would interfere with  the evaluation. I proposed criteria on how to evaluate the  results when FISH is applied to gastric cancer by referring  to the result of norrnal gastric mucosa. When nuclei with  more than two (one in chromosome X of male) signal spots  are present in over 10%, it should be ruled that the popula‑

tion (stemline) which has that number of chromosomes  must exist. When the nuclei with less than two (one in  chromosome X of male) signal spots are present in over  20%, it should be ruled that the population (stemline)  which has that number of the chromosomes must also exist. 

It is in this way that the problem of whether or not the  population (stemline) with an abnormal chromosome num‑

ber existing over some fixed amount was valued in this  study. This criteria is certainly reasonable for research in  both following situations: whether DNA diploidy from flow  cytometry analysis reveals chromosomal diploidy or not,  and what kind of chromosome aberration has occured in a  population detected as the DNA aneuploid peak by flow  cytometric analysis. 

The incidence of chromosome aberration in human  gastric cancer was beyond our expectations. This result  indicates the interesting fact that although the nuclear DNA  content of the cancer is still DNA diploid, tumor cells with  an abnormal chromosome number have already appeared  in it. Although it can not yet be referred to as chromosomal  ploidy yet, the incidence of numerical chromosome aber‑

ration is recognized in DNA diploid cancer. I consider the  intrinsic character of cancer that DNA diploid reveals, an  interesting problem even through it is generally known that  most of DNA diploid cancer has a better prognosis, com‑

pared to DNA aneuploid cancer. 

The result that the incidence of numerical chromosome  aberration in DNA aneuploid cancer was significantly  higher than in DNA diploid cancer indicates that an in‑

crease in nuclear DNA content may be one phenomena that  relates to numerical gain in chromosomes. 

When comparing the incidence of chromosome aber‑

ration according to stages, that of numerical gain in chro‑

mosome X was significantly higher in stages 111 and IV  than in stages I and II. According to the DNA ploidy in the  primary tumor, the incidence of numerical gain in chromo‑

somes 7 and 17 was significantly higher in DNA aneuploid 

that in DNA diploid. Comparing these results with those of 

the other few studies of human gastric cancer reports, Ferti 

et ai.') reported that the numerical gain and structural 

abnormality of chromosomes 8 and 9 had been frequent in 

the study of five cases by conventional methods. Ochi et 

al.') reported that deletion of chromosome Y and numerical 

H. Yamaguchi: Numerical chromosome abenation of gastric cancer  gain of chromosome 12 had been frequent in the study of  five cases, and Van Dekken et al.*o) reported a targetted  cytogenetic study in which 10 gastric adenocarcinoma had  been analyzed by FISH using chromosome specific DNA  probes and therefore used the same method which was  employed in this study. Although the methods used by Van  Dekken et al. to estimate their results were different from  the methods we used here, he described that hyperdiploid  cases in DNA flow cytometric histograms were chromo‑

somal hyperdiploid aneuploidy and that a significant clonal  absence of the Y chromosome was found in males. Since  we cannot find similar results between previous gastric  cancer papers and this paper, it is still too sifficult to  conclude that the gain in chromosomes 7 and 17 reported in  this paper is an essential phenomena associated with the  progression of gastric cancer, and not an accidental one. 

The meaning of this phenomena will be clear in the future  after similar studies have been accumulated. Teyssier,**'*2)  however, from the result of chromosomal analysis of so  many malignant and non‑malignant solid tumors, described  that since recurrent duplication of chromosome 7 is a  common feature, acquisition of an increased number of  copies of this chromosome may represent a selective genet‑

ic event which confers a proliferative advantage to cells. 

The Epidermal Growth Factor Receptor gene and c‑erbB‑2  gene are located on chromosome 7 and chromosome 17  respectively, and it was then confirmed in several reports  that human solid cancer associated with amplification or  overexpression of both these genes had a high level of  metastasis or poor prognosis.*3 **) This present result, that  gastric cancer associated with a gain in chromosomes 7 and  17 had high level of lymph node metastasis or distant  metastasis, suggests the possibility that chromosome aber‑

ration involving these genes may affect the ability of  metastasis and growih in human gastric cancer, too. 

Investigation of cancer is now being made more clearly  through genetic determination. However, Teyssier*') said it  must be considered a complicated process which gradually  affects the multiple structural and functional levels of the  genome, and is incompatible with the simple activation or  depression model of oncogenic genes. It must be true that  numerical and structural chromosome changes play an  important role in the process of tumor progression. A1‑

though many studies in chromosomal abnormalities of  cancer have been reported, most of them concern those of  the non‑epithelial tumor and few are those of human solid  cancer.*" 20) It is said that even if the studies had concerned  solid cancer, the subjects in these would mainly consist of  metastatic tumor cells, derived from ascites or pleural  effusion, and those from primary tumors are no more than  1% of the total.*',2*) The most important reason for this, is  that it is too difficult  to obtain suitable metaphase cells  from human solid cancer, although metaphase cells are  indispensable for conventional cytogenetic study. Even if  we could obtain suitable cells, they are not always repesen‑

1 69 

tative of the targetted tumor. This is due to the modification  and selection which occurs in the process when tumor cells  are cultured and induced to metaphase with medium and 

drug . 

In the present situation, this technique which is able to  detect the targetted gene or chromosome as it is in inter‑

phase, may be a break through in this fi ld. In this study, it  was possible to apply FISH to cells easily isolated from  fresh tissue samples of human gastric cancer without com‑

plicated processes involving cell culture, and to concur‑

rently analyze the nuclear DNA content of the same sample  by flow cytometry. The simple procedure and broad appli‑

cability of this method will be the driving force in cytoge‑

netics in which research will continue to expand and  discover new directions. I hope that the study in chromo‑

somal abnormality of cancer will continue and that the data  from these studies will accumulate, thereby demonstration  the relationship between oncogenesis or progression of  cancer, and chromosome aberration. 

Conclusion 

I tried to investigate numerical chromosome aberration of  human gastric cancer by application of Fluorescent in situ  hybridization. Chromosome specific DNA probes were  used with fresh tissue samples that were surgically resected  from gastric cancer patients. Their nuclear DNA content  was compared and these results yielded the following  conclusions: 

1 ) It was possible to detect numerical aberration in  chromosomes 1, 3, 7, 11, 17 and X of human gastric 

cancer, as seen in interphase. 

2) It was confirmed that the presence of numerical  chromosome aberration is present in DNA diploid cancer. 

3) The incidence of numerical chromosome aberration  was significantly higher in DNA aneuploid versus DNA  diploid cancer, and gain in chromosomes 7 and 17 was  significantly higher in comparison, according to chro‑

mosome number. 

4) It was suggested that the gain in chromosomes 7 and  l 7 may be associated with the ability of metastasis or  growih and progression in the metastatic region. 

My special thanks to Professor Masao Tomita for his  helpful and instructive deliberations, and to Dr. Yutaka  Tagawa for practical and editorial guidance and the other  doctors belonging to the First Department of Surgery of  NAGASAKI University School of Medicine for their kind  support. 

Ref erences 

l) Cremar T.,  Landegent J., Bruckner A.,  ^et al.,  (1986) Hum.  Genet. 

1 70  H. Yamaguchi  Numerical chromosome abenation of gastric cancer  74:346‑352 

Detection of chromosome abberation in the human interphase nucleus  by visualization of spoecfic targetDNAs with radioactive and non  radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trysomy 18  with probe Ll. 84 

2) Pinkel D., Straume T., Gray J. W. (1986) Proc. Natl. Sci. USA 83,  2934‑2938 

Cytogenetic analysis using quantitaive, high‑sensitivity, fluorescence  hybridization 

3) Devilee P., Thierry R. F., Kievits T., et al., (1988) CANCER RE‑

SEARCH 48, 5824‑5830 

Detection of Chromosome Aneuploidy in Interphase Nuclei from  Human Primary Breast Tumors Using Chromosome‑specific Repet‑

itive DNA Probcs 

4) Hopman A. H. N., Ramaekers F. C. S.. Raap A. K., et al., (1988)  Histoche mistry 89:307‑31 6 

In situ hybridization as a tool to study numerical chromosome abber‑

ation in bladder tumors 

5) Lichter P., Cremar T.. Borden J., et al., (1988) Hum. Genet. 

80:224‑234 

Delineation of indivisual human chromosomes in metaphase and  interphase cells by in situ supprcssion hybridization using recom‑

binant DNA Iibraries 

6) Cremar T., Lichter P., Borden J., et al., (1988) Hum. Genet. 

80:235‑246 

Detection of chromosome aberrations in metaphase and interphase  tumor cells by in situ hybridization using chromosome‑specific library  probes 

7) Japanese Research Society for Gastric Cancer, (1985) 

The General Rulcs for the Gastric Cancer Study in Surgery and  Pathology:the 1 Ith edition 

8) Ferti‑Passantonopoulou A. D., Panani A. D., Vlachos J. D., et al.,  (1 987) Cancer Genet Cytogenet 24:63‑73 

Common Cytogenetic Findings in Gastric Cancer 

9) Ochi H, Douglass H. O. Jr., Sandberg A. A., (1986) Cancer Genet  Cytogenet 22:295‑307 

Cytogenetic Studies in Primary Gastric Cancer 

lO) Dekken H. V., Pizzolo J. G., Kelsen D. P., et al., (1990) CANCER 

66:491‑497 

Targetted Cytogenetic Analysis of Gastric Tumors by In Situ Hybrid‑

ization With a Set of Chromosome‑specific DNA Probes  1 l) Teyssier J. R., (1987) JNCI 79 (6):1 189‑1199 

Nonrandom Chromosomal Changes in Human Solid Tumors: Appli‑

cation of an Improved Culture Method 

12) Teyssier J. R., Ferre D., (1989) Int. J. Cancer 44:828‑832 

Frequent Clonal Chromosomal Changes In Human Non‑Malignant  Tum ors 

13) Yasui W. Yoshida K.. Ito H., et al., (1991) Jpn J Cancer Chemother  18 (1):7‑13 

MOLECULAR DIAGNOSIS ON GASTRIC CANCER 

14) Lemoine N. R., Jain S., Silvestre F., et al., (1991) Br. J. Cancer  64:79‑83 

Amplification and overexprcssion of the EGF receptor and c‑erbB‑2  proto‑oncogenes in human stomach cancer 

15) Yamamoto T., (1989) Rinsho Kensa 33 (11):1302‑1309  erbB genes‑c‑erbB‑1/EGF receptor and c‑erbB‑2 

16) Park J. B., Rhim J. S.. Park S. C., et al., (1989) CANCER RE‑

SEARCH 49:6605‑6609 

Amplification, Overexpression, and Rearrangement of the erbB‑2  Protooncogene in Primary Human Stonach Carcinomas 

17) Teyssier J. R., (1989) Cancer Genet Cytogenet 37:103‑125  The Chromosomal Analysis of Human Solid Tumors 

18) Geleick D., Muller H., Matter A,, et al., (1990) Cancer Genet Cyio‑

genet 46:217‑229 

Cytogenetics of Breast Cancer 

19) Muleris M., Salmon R. J.. Dutrillaux B., (1990) Cancer Genet Cyto‑

genet 46: 1 43‑ 156 

Cytogenetics of Colorectal Adenocarcinomas 

20) Simon D., Munoz S. J.. Maddrey W. C., et al., (1990) Cancer Genet  Cytogenet 45 :255‑260 

Chromosomal Rearrangements in a Primary Hepatocellular Carci‑

noma 

21) Misawa S.. Horiike S., Taniwaki M., et al., (1990) Jpn. J. Cancer Res  81 : 148‑152 

Chromosome Abnormalities of Gastric Cancer Detected in Cancerous 

Eff usions