蛍光免疫染色の基礎
蛍光免疫染色の基礎
蛍光免疫染色の基礎
蛍光免疫染色の基礎
ライフテクノロジーズジャパン株式会社 テクニカルサポート 小林 英夫蛍光免疫染色の概要
•
タンパク質の発現の確認
•
タンパク質の局在性の確認
•
上記を細胞や組織の形態と
照らし合わせて観察
•
酵素抗体法（発色）と比較して
•
両方とも高感度
•
多重染色が容易
•
長期保存は不向き
固定 膜の浸透処理 ブロッキング １次抗体を加える ２次抗体を加える 封入する6穴プレートや3.5cmディッシュの底にカバーグラスを沈め、 その上で培養する。 スライドや大型のカバーガラス上にチャンバーがついて おり、そのまま細胞培養できるようになっている。 培養 後、上部のチャンバーやシリコンパッキンを剥がして、染 色・観察する。
例） Nunc Lab-Tek Chamber Slide
プレート内にスライドグラスやカバーグラスが敷き詰めら れており、そこでまとめて培養する。
例） CultureWell Cell Culture System
染色などの作業はカバーグラス上で行い 、顕微鏡観察前にひっくり返してスライド
固定
膜の浸透処理
ブロッキング
１次抗体を加える ２次抗体を加える 封入する固定
(fixation)
• 細胞内の構造物やタンパク質を不動化し、生体に近い状態を保持させる。 4%パラホルムアルデヒド(PFA) in PBS 室温、15分インキュベーション PBS-glycine で3回洗浄 各種固定剤 • パラホルムアルデヒド： アミノ基を架橋することによる固定 • グルタールアルデヒド： アミノ基を架橋。 パラホルムアルデヒドより強固だが、自家蛍光 が上がったり、抗体の反応性が変わったりすることがある。 • アセトン、アルコール： 脱水・脱脂による固定 --- 分子量の大きい物質に有効 • ホルマリン： ホルマリン = 約37％ ホルムアルデヒド + 10% メタノール (10% ホルマリン溶液 ⇒ 約3.7% ホルムアルデヒド + 1% メタノール)膜の透過処理
(permeabilization)
•
抗体等が細胞内へ浸透できるように細胞膜の透過性を亢進させる。
浸透処
理ともいう。
0.1% Triton-X 100 in PBS (推奨：0.05-0.5%) 室温、5分インキュベーション各種透過剤：
•
Triton-X 100:
一般的に使用されている
•
サポニンやジギトニン：
Triton X
よりマイルド
はじめてのお客様向けの製品
•
Image-iT Fixation/Permeabilization Kit (R37602)
- 4% formaldehyde in PBS, pH=7.3 (20mL)
- 0.5% Triton X-100 (20mL)
- 3% BSA (10
×
10mL)
ブロッキング
(blocking)
•
抗体の非特異的反応を防ぐ
• 5～10% 血清 (2次抗体の血清、Normal Goat Serum など)
• 1～3% BSA
• カゼイン
• BlockAid Blocking Solution
•
Image-iT
FX Signal Enhancer
（標的は
荷電領域）
• 通常のブロッキング剤の代わりに用いる。
• 通常のブロッキング剤と組み合わせる。
ブロッキングなし
血清を添加
Image-iT
FX Signal Enhancer
ブロッキング剤
Mouse brain cryosections
Image-iT FX 処理 Image-iT FX 未処理
固定 膜の浸透処理 ブロッキング
１次抗体を加える
２次抗体を加える 封入する一次抗体を加える
•
一次抗体を添加する。
•
ブロッキング剤を少量添加した
PBS
で希釈し、サンプルに添加する。
例： PBS with 1% Normal Goat Serum
•
室温で
1
時間インキュベーション、
4
℃で
overnight
など。
•
多重染色を行う場合には、各抗体の宿主を変える。
•
ネガティブコントロール
（一次抗体
添加しない）、ポジティブコントロール
(
必
ず染まる抗体・サンプル）も用意する。
•
はじめて使用する抗体は、予備実験として、濃度条件を検討しておく。
• 例： 1:100、1:200、1:500、、、 と濃度をふって染色し、ベストの条件を決めておく。 • ロットが変わった場合も、予備実験を行った方がよい。一次抗体の選択
•
論文などで実績がある抗体を確認する。
•
モノクローナル抗体：
クローン名
•
ポリクローナル抗体：
メーカー名、カタログ番号
•
抗体取扱メーカー各社で、該当する抗体があるかどうか探す。
•
ターゲットのタンパク質
•
アプリケーション（
ICC, IF, IHC
など
)
•
交差性
•
使用時の濃度
•
宿主の生物種
(mouse, rat, rabbit, goat
など
)
固定 膜の浸透処理 ブロッキング １次抗体を加える
２次抗体を加える
封入する二次抗体を加える
•
二次抗体
•
一次抗体
1
分子に対して、複数の二次抗体が結合する。
•
蛍光標識した一次抗体を使用するよりも、
高感度で検出できる。
•
二次抗体を添加する。
•
ブロッキング剤を少量添加した
PBS
で希釈し、サンプルに添加する。
例： PBS with 1% Normal Goat Serum
•
室温で
30
分～
1
時間インキュベーション
多重染色を行う場合の抗体の選択（失敗例）
抗-XX 抗体 (mouseIgG)
抗-YY 抗体 (mouse IgG)
Alexa 488 抗抗抗抗-mouse IgG二次抗体
Alexa 568 抗抗抗抗-mouse IgG 二次抗体 もし同じ生物種を用いたら もし同じ生物種を用いたらもし同じ生物種を用いたら もし同じ生物種を用いたら… 全部同じ色に染まってしまう。 全部同じ色に染まってしまう。 全部同じ色に染まってしまう。 全部同じ色に染まってしまう。 抗-XX 抗体 (mouse IgG)
抗-YY 抗体 (ratIgG)
Alexa 488 抗抗抗抗-mouse IgG二次抗体
Alexa 568 抗抗抗抗-rat IgG 二次抗体 生物種が違っていても交差してしまうことがある。
生物種が違っていても交差してしまうことがある。 生物種が違っていても交差してしまうことがある。 生物種が違っていても交差してしまうことがある。
二次抗体の製造過程（アフィニティ精製と交差吸着）
Mouse IgG Rat IgG
anti-mouse
抗体を含む血清
anti-mouse
抗体
(mouse IgG
カラムに結合したもの）
二次抗体
二次抗体
二次抗体
二次抗体
二次抗体
– highly cross adsorbed
Cat. No. 抗体抗体抗体抗体 宿主宿主宿主宿主 吸着操作（吸収操作）吸着操作（吸収操作）吸着操作（吸収操作）吸着操作（吸収操作） 蛍光標識蛍光標識蛍光標識蛍光標識
A11001 Anti-mouse IgG Goat Human IgG and serum Alexa 488
A11029 Anti-mouse IgG *highly cross adsorbed*
Goat Bovine, goat, rabbit, rat and human IgG and human serum
Alexa 488
A11059 Anti-mouse IgG Donkey Bovine, chicken, goat, guinea pig, hamster,
horse, human, rabbit, rat, and sheep serum
Alexa 488
A11059 Anti-mouse IgG Rabbit Human serum Alexa 488 A11059 Anti-mouse IgG Chicken Human serum and Rabbit
serum
蛍光色素とスペクトル
Alexa Fluor 594
励起スペクトル
蛍光シグナルの漏れ込み
(Crosstalk)
ローダミン
フィルター
Cy5
フィルター
Alexa Fluor 594
の蛍光シグナル
蛍光色素の選択
•
定番の組合せ（１）
•
青色
：
DAPI
•
緑色
：
Alexa Fluor 488
（
FITC
チャンネル）
•
赤色：
Alexa Fluor 594
（
XRITC/Texas Red
チャンネル）
•
定番の組合せ（２）
•
青色
：
DAPI
•
緑色
：
Alexa Fluor 488
（
FITC
チャンネル）
•
橙色
：
Alexa Fluor 555
（
TRITC/
ローダミン
チャンネル）
•
赤外：
Alexa Fluor 647
（
Cy5
チャンネル）
固定 膜の浸透処理 ブロッキング １次抗体を加える ２次抗体を加える
封入する
封入
(mounting)
核染色も含め、染色処理の終わったカバーグラスをスライドグラスに載せる。 （あるいは処理の終わったスライドグラスにカバーグラスを載せる） • スライドグラスに 封入剤を垂らす。 • マウント液： PBS、グリセロール、ポリ ビニルアルコール (PVA) • 褪色防止効果のある封入剤 • 核染色試薬 DAPIを含む場合もあり。 • カバーグラスを被せる。 • 泡が入らないように。 • カバーグラスが動かないよう、４隅だけ、褪色防止効果をもった封入剤
ProLong® 褪色防止用封入剤の光褪色防止効果 褪色防止用封入剤の光褪色防止効果 褪色防止用封入剤の光褪色防止効果 褪色防止用封入剤の光褪色防止効果固定したHeLa 細胞を fluorescein標識ファロイジンで染色し、ProLong® Diamond 試薬、
ProLong® Gold 試薬、または50% PBS/グリセロール中にマウントした。画像の取得は、12秒間隔 で、20倍の対物レンズを使用して、一般的な100ワット水銀アーク灯からの連続照射を 用いて行っ た。
