凋UT -Rd

・

Figure 13・1. CMVプロモーター ・ エンハンサーに結合する転写因子

第2項 BCI-8細胞へのPMAの効果

前

項

^の

結

^{果よ り CMVプロモ}

^ー

^タ

^ー

^は4つのNF

^-

^KB

結

^合

部

^{位を合 んでい}

る ことが示された。 Tリンパ球細胞へのrω導入がPKCを介してNF-KBの 活性を上昇させ るという知見(Baldari^ef a1.， 1992a & 1992b)があり、 そ こで m導入 ・ 増幅BHK細胞においても、 rasがNF-KB活性をよ幹加させているの ではないかと

考

^え

、

^{仰を導入してい ないBCI}

-

^{8にPMA処理を}

行

^{う ことで}

過性のPKC活性化を誘導した。 この項でのPMA処理はPMA-単独でPKC の活性化が生じる濃度で行った。 Figure 13-2に示したように、 BCI-8細胞 においてPMA処理は組換えhIL-6の生産を約3倍に増強していた。 しかし このよ慢強値はrωの導入および遺伝子増幅時における20--30倍程度の明 強(Yano ^{ef a1.，} 1995; Teruya ^{ef 01.，} 1995a)には及ばず、 PKC活性化の不十分、

あるいは他の要同の関与が示唆されたJ

overnight

culture 6 h. 1 h.

|司 --，-- --r

T-PMA(付与 AMD

^(+，ー)

19 h.

�

Sampling

畠尋llA-1-

A-1--Wash twice by PBS

Sample hIL・6 production (nglmり Relative Production PMA(ー) PMA(吋 [PMA(吋IPMA(ー)]

AMD (寸 AMD (+)

77.5 21.2

91.8 63.1

1.2 3.0 AMD， actinomycin 0; PMA， phorbol12・myristate13・acetate

Figure 13-2. BCト8細胞へのPMA処理の効果

第3項 PKC問書剤H7および:'pKA活性化剤DBu-cAMPの効果

PKC問書剤H7処理では対照としてH7のアナログでかつ阻害活性の弱 いHA1004を使用した。 PKCの阻害剤H7の処理ではBHK6-1細胞のヰミ応性 低下は10%程度であったのに対し、 BCI-8およびBCI-8 R8細胞では約、|三分 程度まで生産性が低下していた。 またBHK6-1、 BCI-8およびBCI-8 R8細 胞におい て、 細胞内のcAMPをk昇させPKAを活性化するDBu-cAMPの処 理を行うとBCI-8細胞は生産性の変化はなく、 BHK6-1細胞は生産性の低 ーが生じたが BCI-8 R8細胞においては生産性が約1.6桁L芥した(Figure 13-3)。

Sample

5 h. _{， hl} 24 h.

Sampling AMD

ELISA

Wash twice by PBS

Relative Production

Cell Line DBuぐAMP H7

BHK6-1 0.58 0.87

BC卜8 0.99 0.51

BCト8圃R8 1 .61 0.57

Figure 13・3. BHK6・1、 BC卜8および、BCI-8-R8細胞へのDBu-cAMP またはH7処理の効果

第4項 細胞内hIL-6および、Rasガ、ンタンパク質の検出

hIL-6高坐産性のms導入 ・ 増幅BCI-8細胞(BCI-8 ms c10ne 8)内において hIL-6およびRasタンパク質が高発現しているかどうかを調べるために 、

細胞内hIL-6とRasガンタンパク質を共焦点レーザ一生物顕微鏡を用いて 検出した。 msガン遺伝子は膜結合タンパク質p21をコードしている。 ras clone 8はFigure 13-4に示したようにhIL-6およびRasの検出において両ノiと も強い蛍光シグナルを示しており、 hIL-6およびRasの細胞内発現レベル が上昇していることが証明された。

第5項 rω増幅BHK細胞のrωDNAコヒー数の測定

サザンプロッテイングの後、 600Cでハイブリダイゼーシ ョンを行い、

600Cで0.1 %SDSを含む1X、 0.5X、 そして0.1X SSCを用いて各15分ずつ洗

A

BHK・21 BCト8 ^ras clone 8

B

BHK・21 BCト8 ^ras clone 8

Figure

13-4.共焦点レーザ一生物顕微鏡を用いた細胞内のh1L-6 (A)と

Rasタンパク質(8)の検出

いを行い、 脱へのブロ ッキング、 フロープDNAを際識したフjレオレセ インを認識するわL休(アルカリフォスファターゼ標識)処.Ftlを行った。

0.3% Tween 20を合む100 mM Tris・Cl/300 ^mM NaC1 (pH 7.5) で1 0分間ずつ3 111} iJt いを行った後、 空温で検出試薬処理を5分間行い、 光シグナルをISO

3，000のホラロイド フィルムで検出したヲ ヒトの細胞1個あたりのDNA出

基数は6X109塩基対であることが知られている。 そ こでBHK細胞l 例あ たりのDNA温基数を同 じ量と仮定し、 導 入したms遺伝 子のコヒー数を 算出した(Figure 13-5)。 その結果、 ras非導入の細胞の、 おそらくは細胞

人身のものと与えられるrωのコピー数が約5----7コピーで、 rasを導入 ・ 増幅した細胞のコヒー数は約40 ---- 60 コヒーであり、 約30 --- 50コヒ一

程度のrasが外来性のものとして考えられた。

第4節 考察

マイトジェン刺激を受けたTリンハ球はその刺激を核に伝達しイ ン ターロイキンー2(IL-2)を発現する。 その時にp21ms'ま刺激の伝達に関わっ ていることが知られている(Downw訂d et al.， 1990)。 またホルボーjレエス テル とカルシツムイオノフォアの共同作JUによりマイトジェン刺激 と

同等の反応が見られることからPKCがこの刺激伝達に関わっているこ

とが示された(Truneh ^etal.， 1985)0 一方でIL-2のプロモーター領域にNF-KB 結合部位が存在していることに注目し、 活性型聞をTリンハ細胞に導 入し、 NF-KB結合部位を持つレホータープラスミドの活性を調べた結 果、 活性型rω導入が NF-KB活性化を誘導していることがぶされた( Baldari

et al.， 1992b)。 一方でCMVフロモータ- l�流部のエンハンサーはNF-KBに

より活性化されることが示されている(Sam bucetti ^et al.， 1989)(" これらの知 見は本研究でぶされた聞を導入 ・ 増幅したBHK細胞での't:_定性噌強に

NF-KBが重要な位置を市めていることを示唆するものであったp

本章で検討-したようにPMAにBCI-8細胞のhIL-6生産性増強作用があり、

またPKCßfl 'l-:剤によりCMVプロモーターがSRo.フロモーターより強い1�1l 店を受けていたことから、 rωを導入 ・ 増幅したBHK細胞はrω発現上昇

Standard ras Copy Number Sample Copy Number

298.7 pgー争 72.3 BHK・21ー争 7.2

74.7悶ー争園田 _寸E・・ 18.1 BCI-8 _{____ 静} 5.4

18.7 pg--. 4.5 ^vec 2--. a-. 6.0

4.7 pg--. 1.1 ^{ras clone} 6 --.・L _』園 59.3

1.2 pg--. 0.3 ^rasclone 8 _--.Eb

圏

^41.5

Figure 13-5. サザンブロッティング・ハイブリダイゼー

ションによる各種細胞のras遺伝子のコピー数の算出

によるPKC治十1::化を介してNF-KBが活性化されており、 活性化された NF-KBがCMVプロモーターからの転写を活性化しh1L-6の生産性を増強し ていると与えられた。

またEIA点物にはcAMP依存性キナーゼ、(PKA)を活性化する作用が知ら れて おり(Sassone-Corsi， 1988)、 PKA活性化をDBu-cAMP処理で代替した時 にrωを導入していない細胞ではCMVフロモーターの活性化は生じなかっ た。 このことからmとE1Aの相乗効果はPKA活性化以外でのm依存的な

EIAの転写活性化作用が加わるためであると考えられた。 これらの結 果から推測されたαwプロモーター活性化機構をFigure 13-6に示した。

また、 細胞内タンパク質の検出および、問コピー数の測定両者の結果 より以下のことが示唆された。 (1 ) 細胞内Rasタンパク質の増加が細胞 内h1L-6生 産註の増強を促している。 (2 ) 染色体上の聞のコピー数が50 nMMTχ処理で元のレベルより数倍程度増幅され、 Ras の発現量が増大 し、 CMVフロモーターの活性化が可能に なった。

第5節 小折

本章で 検討し得られた結果を以下に示す。

1. CMVフ ロモーターはCREB/A1下結合部位および、NF-KB結令部位を共に 4カ所ずつ持っ ており、 AP-1、 AP-2、 Myb、 SP-l、 そしてSRE結合部位

ををそれぞれ1カ所ずつ持っていることが明らかとなったc

2. BCI-8細胞へのPMA処理は組換えhIL-6の牛a産を約3倍に増強していた これは生産性増強にPKCが関与していることを示唆している。

3. BHK6-1、 BC1-8およびBCI-8 R8細胞において、 DBu-cAMPの処理を行う とBCI-8細胞は生産性の変化 はなく、 BHK6-1細胞は生産性の低ドが 生じたが、 BC1-8R8細胞においては生産性が約1.6倍上昇したの また PKC阻害剤H7の処理においてはBHK6-1細胞の牛産性低下 は10%程度 であったのに対し、 BC1-8およびBCI-8 R8細胞ではF主産性が下分科皮 まで低下し ておりCMVフロモーターの発現へのPKCの関与を示唆し ていた。

Cytokine Growth Factor (PDGF， EGF)

BP

dEþ

^-TATA

-- --=:cコ 4

NF-KB

Binding Sites Binding Sites

CMV Promoter

Activated Transcriotion

Nuclear Membrane

Figure 13-6. RasとE1AによるCMVフロモー

ター活性化機構の推定図

4. 細胞内hIL-6とRasガンタンハク質を共焦点レーザ一生物顕微鏡を用 いて検山したところ、 rωclone 8はhIL-6およびRasの検出においてI両 方とも強い蛍光シグナjレを示しており、 hIL-6お よび、Rasの細胞内発 現レベルが土昇していることを示していた。

5. DNAコヒー数の測定を行ったところ、 ras非導入の細胞の、 おそら くは細胞自身のものと考えられるmのコピー数が約5----7コヒーで、

聞を導入 ・ 増幅した細胞のコヒー数は約40----60コヒーであった。

第14市 総t�

高等動物の多くの生理活性タンハク質は、 糖鎖の付加を合めた翻 訳 後修 飾を受け、 生体内での活性の維持なら びに安定性を保っている

(Morell ^et al.， 1971)ことは序論で述べた通りである。 それ故、 それらft�ⁿ

活性タンハク質を生産する時は、 翻訳後修飾の機能を持つ動物細胞を 用いることが最も望ま しいと考えられる。 一方、 動物細胞の組換えタ ンハク質生産性は細胞が本来有しているタンハク質生産能力と比較し でかなり低いレベルであることが知られている(Murakami，1990)。 現段階 における、 動物細胞を用いての物質生産はコスト面での問題を抱えて

おり、 そのため様々な方法で有用生理活性物質をより安価に供給する ために大きく分けて以ド3項目の研究が進め られている。

まず第1に、 大量に細胞を培養し、 量で生産性の低さをカバーする というものであり、 第2 に細胞を高密度で培養し、 産物の密度で低生 産性をカバーするというものである。 これらの方法がこれまでの主流 といえる研究方針であ り、 これら の方面に関してはかなり研究が進ん できているといえる。 しかしなが ら、 大量培養 および高密度培養は設 備を設置する空間に限度があることや、 大型化により、 培地などを含 めた培養細胞の環境の制御が非常に困難になるなどの問題点がある。

そこで第3の方法、 つまり細胞1個当りの組換えタンパク質生産効率を 口!とさせる方法が近年焦点となってきている。 この分野の研究では物 質生産性を向上させ る因子の検索(Sato ^et al.， 1989; Toyoda， ^et a1.， 1990;

Yamada ^et al.， 1990 & 1991; Sugahara ^et a1.， 1991a， 1991b & 1992)や遺伝子L学的 手法を用いる方法が検討されているσriedman ^et a1.， 1989)。 遺伝子工学的 手法を用いる面においては、 dhfrによる遺伝子増幅法(Schimke， 1984) が よく用いられてきた。 しかしこの方法には、 かなりの時間と労力を必 要とすると いう問題点があり、 目的遺伝子の増幅を行うために半年か ら1年近くの問、 段階的にMTX濃度を上げていくという操作が必要とさ れ、 またM1χ添加培地で細胞を培養しなければならない。 これは薬剤 を除去すると大幅に増幅された遺伝子のコピー数が減少していくため

ドキュメント内 ガン遺伝子導入による組換えタンパク質高発現動物 細胞株の育種 (ページ 34-58)