勝 田 敏 哉

奈医誌.(J. N 

a r a  Med

^目

A s s . )

45

， 

253~265， 1994 

実験的骨形成モデルを用いた初期の骨形成に 及ぼすカドミウムの影響

一一一アルカリフォスファターゼ，カルシウム，燐，

およびオステオカルシン mRNA の動態一一

奈良県立医科大学公衆衛生学教室

勝 田 敏 哉

(253) 

EFFECT OF CADMIUM O N   THE EARLY STAGE OF OSTEOGENESIS BY  BONE MARROW  CELLS AND  DEMINERALIZED BONE MATRIX :  BEHAVIOR OF ALKALINE PHOSPHATASE ACTIVITY ，  CALCIUM ， 

PHOSPHORUS ，  AND  OSTEOCALCIN mRNA 

TOSHIY  A  KA  TSUDA 

Dψartment 01 Public Health， Nara Medical U:附versity

R e c e i v e d  March 

31

， 

1994 

A b s t r a c t :   To d e t e r m i n e  t h e  d i r e c t  e f f e c t  o f  cadmium ( C d )  on bone f o r m a t i o n ，  t h e   p o t e n t i a l  o f  C d ‑ t r e a t e d  bone marrow c e l 1 s  and d e m i n e r a l i z e d  bone m a t r i x  (DBM) t o  form  bone and c a r t i l a g e  was a s s e s s e d  u s i n g  a  d i f f u s i o n  chamber (DC)  i n  v i v o ，  by measurement  o f  b i o c h e m i c a l  p a r a m e t e r s  s u c h  a s  a l k a l i n e  p h o s p h a t a s e  (ALP) a c t i v i t y ，  t o t a l  c a l c i u m  and  p h o s p h o r u s  c o n t e n t s ，  t h e  b o n e ‑ s p e c i f i c  p r o t e i n ，  o s t e o c a l c i n  c o n t e n t ，  and by t h e  g e n e  e x p r e s ‑ s i o n  o f  o s t e o p o n t i n  and o s t e o c a l c i n .  

D i f f u s i o n  chambers were i n o c u l a t e d  w i t h  DBM  and bone marrow c e l 1 s  from e i t h e r  Cd 

‑ t r e a t e d   o r   n o n ‑ t r e a t e d  r a t s   ( c o n t r o l )   and were t h e n   i m p l a n t e d   s u b c u t a n e o u s l y   i n t o   s y n g e n e i c  n o n ‑ t r e a t e d  r a t s .   U n l i k e l y  i n  c o n t r o l  DC ，  a  peak o f  ALP a c t i v i t y  d i d  n o t  o c c u r   a t  4  weeks p o s t i m p l a n t a t i o n  i n  DC  i m p l a n t s  i n o c u l a t e d  w i t h  C d ‑ t r e a t e d  bone marrow. ALP  a c t i v i t y ，  and c a l c i u m   and p h o s p h o r u s  c o n t e n t s   i n   t h e s e   C d ‑ t r e a t e d  DC i m p l a n t s  were  s i g n i f i c a n t l y  l o w e r  t h a n  t h o s e  o f  t h e  c o n t r o l  DCs a t  t h e  e a r l y  s t a g e  o f  i m p l a n t a t i o n .   The  a c c u m u l a t i o n  o f  o s t e o c a l c i n  i n  DCs w i t h  C d ‑ t r e a t e d  bone marrow was a l s o  s i g n i f i c a n t l y   l o w e r  t h a n  t h a t  i n  c o n t r o l  D C s .  

By g e n e  e x p r e s s i o n  a n a l y s e s ，  o s t e o p o n t i n  mRNA  was i n t e n s l y  e x p r e s s e d  i n  t h e  DC  w i t h   c o n t r o l  and f o l 1 owed w i t h  C d ‑ t r e a t e d  bone marrow DC  5  weeks a f t e r  i m p l a n t a t i o n .   On t h e   c o n t r a r y ，  t h e  e x p r e s s i o n  o f  o s t e o c a l c i n  mRNA  i n  t h e  DCs w i t h  C d ‑ t r e a t e d  bone marrow  was much l o w e r  t h a n  t h a t  i n  c o n t r o l  DCs by b o t h  Northern b l o t  a n a l y s i s  and a l s o   i n  s i t u   h y b r i d i z a t i o n .   These r e s u l t s   i n d i c a t e  t h a t   Cd a d m i n i s t r a t i o n  r e s t r a i n s  t h e   o s t e o b l a s t i c   d i f f e r e n t i a t i o n  pathway i n  bone marrow t h r o u g h  d i r e c t  e f f e c t s  on t h e s e  c e l 1 s .  

Index Terms 

o s t e o g e n e s i s ，  o s t e o c a l c i n ，  a l k a l i n e  p h o s p h a t a s e ，  bone marrow ，  cadmium ，  i n  s i f u   h y b r i d i z a ‑

t i o n  

( 2 5 4 )  

勝 田 敏 哉

緒

^雪国

カドミウム

( C d )

の長期曝露によって，骨や腎臓に障害 を引き起こすことは，イタイイタイ病患者や産業現場で の

Cd

曝露作業者を対象とした病理組織学的および生化 学的研究により知られていた巾).こうした現象に加え て，

Cd 

による慢性腎障害の起こる機序は肝臓の

Cd

によ る機能障害の結果，肝臓から血液中に流出した

Cd

チオ ネインが腎臓に移行して近位尿細管刷子縁膜を傷つける ことによって二次的に起る機能障害であるとする新しい 説刊:報告された.

一方

Cd

による骨障害は，腎障害によりビタミン

D 3

活 性化が阻害されぺそのため腸管からの

Ca

吸収，腎尿細 管での

Ca

再吸収が障害されることによって二次的に起 こるとする考え方がある5). またクローン化された骨芽 細胞やマウス頭蓋冠を用いた

i nv i t r o

の培養実験におけ る生化学的研究から

Cd

は直接骨組織に作用して，骨吸 収や骨形成を阻害するとも報告されている6)7).このよう に骨障害の機序についてはこれまで多くの研究がなされ ているにもかかわらずいまだ不明な点が多く定説化され ていない.

以前より骨髄細胞を異所性部位に移植すると未分化問 葉細胞が分化し，軟骨や骨を形成することが知られてい た8).最近

Oh

均1沼

g

邸伊

u

凶1陪

s h

註

i e ta l  

ラミツク(心ノハ、イドロキシアパ夕イト吋〉をラツト皮下に移植 すると未分イ化七間質幹細胞がセラミツ Fの気孔表面で骨芽 細胞に分化し骨組織を新生することを証明した.他方

Dohi e t   a l

^lO)は， レシピェγトの細胞が侵入できない閉 鎖性骨形成モデノレとしてミリポアメンブレンで囲んだデ ィヒュージョンチャンパー

(DC)

内にラット骨髄細胞と 脱灰骨粉を封入してラット皮下に移植する実験系を確立

した.

本研究は

Cd

の初期の骨形成への直接作用を解明する 目的で，

Cd

を曝露したラット骨髄細胞と脱灰骨を

DC

に 封入し，ラット背部皮下に移植するln VlVOに近い骨形 成モデルを応用した.

DC

内新生骨について骨の形成の 指標となる

Ca

や燐

(P

i)の沈着量，骨芽細胞膜に存在す るアルカリフォスファターゼ

(ALP)

活性，また非コラー ゲン性蛋白質であるオステオカノレシン

(OC)

の合成量を 定量分析し，かっ

DC

内の骨形成過程における

OC

や同 じく骨基質蛋白オステオポンチン

(OP)

の発現に対する

Cd

の影響を，

OC

および

OPcDNA

プロープを用いたノ ザンプロッティング法と，組織切片上で標識

RNA

をプ

ロープとして組織内に分布する

mRNA

を検出する方法 である

I ns i t u

ハイブリダイゼーション法(I

SH

法?によ

り検討した.

材料および方法

1.ラット脱灰骨基質

(DBM)

の調製

ラット

DBM

は

Nishimotoe t   a l " )

の方法により調製 した.すなわち

3

カ月齢ラット大腿骨，座骨を採取し液 体窒素中で破砕した骨粉

(74‑420μm)

を

0.5NHC1

中， 4'Cで

1

時間ずつ撹持しながら

3

回脱灰をおこなったの ち

pH6 . 0

になるまで蒸留水で洗浄した.続いて

9 5

%ェ タノーノレで

2 0

分

3

回，その後エーテルで、洗浄した.脱 灰骨粉は室温で

1 6

時間風乾し ，

‑ 2 0 ' C

で保存した.

2 .

ラットへのカドミウム

( C d )

投与方法と骨髄細胞浮 遊液の調製法

生理食塩水に溶かした

CdC1

2

(Cd

として

200μg/m

1) を

1 2

匹の

4

週 齢

Wistar

系雄ラット〔体重

6 5

士

5g )

に

750μg/kg

体重で

4

週間，週に

3

回皮下投与した

(Cd

投 与群).対照群のラットには同量の生理食塩水を皮下に投 与した.

Cd

投与群の8週齢雄ラットの大腿骨，座骨より 骨髄を採取し，

3 5  u n i t s / m 1

の へ パ リ ン 含 有

O

^目

01M p h o s p h a t e  b u f f e r / 0 . 1 5  M NaC

 ，l

pH  7.2(PBS)

中でゲ ージの異なる注射針で繰り返し吸引し骨髄細胞浮遊液

(5‑6X10

⁷ 

c e l l s / m

1)を調製した.

Cd

投与群および対照 群の骨髄有核細胞の生死はトリパンフツレー染色法により 調べ，生存率

9 0

%以上であることを確認して以下の移植 実験に供した.

3 .

ディヒュージョンチャンパー

(DC)

の移植方法 ディヒュージョンチャンパー

(DC

，直径

9mm

厚さ

2 m m

，容量

130μ1

，メンプランフィノレターの孔径

0 . 4 5 μm

， 

M i l l i p o r e

社製.

M A

， 

USA)

をエチレンオキサイド

ガ ス で 滅 菌 し た の ち ， ラ ッ ト 骨 髄 細 胞 浮 遊 液(5X 

1 0

⁶ 

c e l l s / 9 0 μ

1)と

DBM 10mg

を

DC

に封入した.

8

週齢

Wistar

系雄ラット

(190‑210g )

の背部皮下に上記のよ

うに調製した

Cd

投与群および対照群のラット骨髄細胞 と

DBM

を封入した

DC

を

3

個づっそれぞれ別々のラッ

トに移植した.

3

， 

4

， 

5

， 

6

週後に

DC

を摘出し，一部 を直ちに

2 0

kv， 1 

m A

の軟X線で撮影した.

4 .

カルシウム

( C a )

，

Cd

およびリン

(PD

濃度の測定

Ca

と

Cd

の定量は原子吸光光度計

(AA‑ 8 1 0   t y p e :  

Nippon J a r r e 1 ‑ A s h

社製.京都〉で行った.

P i

は試料を 濃硫酸と過塩素酸により湿式灰化後，

Chen  e t  a l

らの方 法12)で比色定量した.

Ca

， 

P i

およびオステオカルシンの

実験的骨形成モデルを用いた初期の骨形成に及ぼすカドミウムの影響

( 2 5 5 )  

抽出方法は，摘出した

DC

のメンプランフィノレターを除 ガロースゲノレ電気泳動とガラスビーズ

( G e n eC l e a n  K i t

，  去して，それぞれの新生骨組織の湿重量を秤量したのち

BIO 1 0 1  I n c

， 

CA

， 

USA)

により精製し，その塩基配列は

DC

内 新 生 骨 組 織 を

2 0

% 蟻 酸 中 で ホ モ ジ ナ イ ズ し

DNAsequencer(DSQ‑1 NE

，島津理化器械K.

K)

により

4

⁰

C48

時間振還した.蟻酸抽出物の一部を

P i

およびオス ラット

OPcDNA

であることを確認した.

テオカルシンの測定に供し，他の一部を

1mg/ml

の塩化

2 )   cDNA

プロープの

3 2 p

標識法

ストロンチウム溶液で

2 0 0

倍に希釈し，

Ca

濃度の測定に ラット

OCcDNA(363 bp

， 

D

r. 

P .  

A. P

r i c e

， 

UCLA

よ 供した. り供与)，ラット

OPcDNA(702 b p )

およびラットβア

Cd

投与ラットの大腿骨，腔骨，肝，腎，骨髄中の

Cd

7チン

cDNA(207bp D r .  Y

. Dohiより供与)は

[ a ‑ 3 2 P J

濃度は濃硝酸と濃過塩素酸により各組織を湿式灰化し

dCTP

と

multi‑random p r i m e r   l a b e l i n g   k i t ( R e a d y  

脱イオン蒸留水で希釈後原子吸光法で測定した

To‑Go:  Pharmacia B i o t e c h

社製〉を用いてそれぞれラ

5 .

アルカリフォスファターゼ

(ALP)

活性の測定 ベノレした〔比放射能活性:

8X10

⁸

cpm/μg DNA). 

1mM MgCl

2を 含む氷 冷 し た

0 . 2 %  Nonid

巴

tP‑40  3 )

全

RNA

の抽出とノザンプロッティング法

0.5ml

中で

DC

内新生骨をマイクロホモジナイザーに 全

RNA

は 移 植

5

週 後 の

6

個 の

DC

よ り 酸 性

より砕片したのち

4

⁰

C

で

1 5

，

0 0 0g  1 5

分の遠心分離後，そ

g u a n i d i n e   thiocyanate(AGPC)

法問で、抽出した.全 の 上 清 に つ い て

ALP

活 性13)を 測 定 し た . す な わ ち

RNA  5μg

を

MOPS(0.04M  3‑(N ‑Morpholino)  0 . 5 6  M  2 ‑Amino‑2‑m

巴

t h y l ‑ 1

，3‑propanediol(AMP 

p r o p a n e s u l f o n i c  a c i d / 5  m M   Sodium  c i t r a t e / O .   5  m M   b u f f e r   pH  9 . 8 )  / 1 .  0  m M  MgCl

，

/ 1 0  m M  p  ‑N  i t r o ‑ EDT  A

， 

pH  7 . 2 )

ーホノレムアノレデヒド中で

6 5

⁰

C

，

1 5

分間加

ph

巴

n y l p h o s p h a t

巴からなる基質液

1ml

iこ先の上清を

5

熱変性させ，1.1%アガロースゲノレホノレムアノレデヒド中

μ l

加 え て3TC30分インキュベートしたのち，

0 . 2  N 

で電気泳動した.泳動後の

RNA

をエチジウムブロマイ

NaOH

を

2ml

加えて反応を停止させ，

4 1 0  nm

における ドで染色し

2 8S

と

1 8S

のリボゾーム

RNA

のノミンドを 吸光度を測定した.

ALP

活性は骨組織

1mg

当たり

3 0

確認し，ナイロンメンプランフィノレター

(Hybond‑N+; 

分間に基質から遊離した

p ‑ n i t r o p h e n o l

の

μmole

数 で

Amersham  J  apan

社製〉に転写した.

表した

3 2 p

でラベノレしたそれぞれの

cDNA

プロープC1

.6X 6 .

オステオカノレシン量の測定

1 0

⁷ 

cpm)

を添加した

Q u i c k

Hyb™液 (Stratag巴ne 社製

DC

内 新 生 骨 を

2 0

% 蟻 酸 中 で ホ モ ジ ナ イ ズ し て

CA

，

USA)

中でナイロンメンブレンを

6 8

⁰

C

，

2

時間ハイ

rC48

時 間 脱 灰 後 ， そ の 脱 灰 抽 出 物 を

Sephadex G 

ブリダイズしたのち常法に従って充分洗浄した.ハイブ

2 5  ( f i n e )

カラムにより脱塩し，蛋白画分を凍結乾燥して リダイズしたナイロンメンプランを

KodakXO 

mat™ オステオカノレシン

(OC)

の

Radioimmunoassay(RIA)

に フィノレムに

‑80

⁰

C

下で

4 8

時間露光してオートラジオグ 供した.ラット

OC

標品は

Ohtawara e t  a l

の方法14)で精 ラムを作製した.

製した.すべての試料について抗ラット

OC

ウサギ血清

8 .   I n  s i

似ハイブリダイゼーション法 とラット ¹²⁵

1

標識

OC

を用いた

R1A

法で定量した15). 1) 

OC cDNA

挿入プヲスミドの作製

7 .   cDNA

プロープの作製とノザンプロッテイング法 プラスミド

SP6/0CcDNA

の作製法は

SP6

と

T‑7

1)ラットオステオポンチン

COP)cDNA

の作製法 のプロモータ̲18)を含むプラスミドベクター

(pSP6/T 

ラット

OP

の

cDNA

は次のように作製した.ラット 7)の

EcoR 1

切断部位に

EcoR1 OC cDNA

断片を

T4

OP

の

DNA

塩基配列)16)より

Pro

⁵⁷から

GlU

⁶⁴に 相 当 す

DNA l i g a s e

を用いて挿入し，大腸菌

HB1 0 1

にトラン る

24‑m

巴

r

の

o l i g o n u c 1 e o t i d e

を

5 '

側のプライマーとし スフォームした.得られたクローンのプラスミド

DNA

て ， ま た

S e r

²⁸³か ら

Leu

²⁹⁰に 相 当 す る

2 4 ‑mer

の の

S s t 1

での切断部位より判断してアンチセンス

RNA

o l i g o n u c 1 e o t i d e

を

3 '

側のプライマーとして

DNA

合 成 とセン

( 2 5 6 )  

勝 回 敏 哉

2 )

ジゴキシゲニン

( D I G )

標 識

OCRNA

プロープの

作製

ジゴキシゲニン

( D I G )

標識

OC

アンチセンス

RNA

プ ロープは

DIG‑RNAL a b e l i n g  Kit(Bo

巴

h r i n g e rMann‑

heim

社製〉を用いて以下のとおり作製した.制限酵素

BamHI

により直鎖にした

pSP6 / T ‑ 7 / r e v  OC. DNA(4  μg)

をテンプレートとして，

RNase i n h i b i t o r ( R N a s i n )  

を

2 0u n i t s

，非標識

ATP

，

CTP

， 

GTP

を そ れ ぞ れ

1 0 nmol

，非標識

UTP0 . 5  nmol

， 

DIG‑

l1

‑UTP 1 0  nmol

を 終濃度

1x

転写用緩衝液

(40mM Tris‑HCl  pH 7 . 5 / 6   m M   MgCl

2

/ 2  m M   s p e r m i d i n e   HC

1/

5  m M   NaC

I) 

，  6  m M

のジチオスレイトーノレ

(DTT)

に 混 合 し ， 最 後 に

SP6 RNA

ポリメラーゼ

4 5u n i t s

を加え全量

30μ!

とし た.これを

3TC 2

時間反応させた.ついで

DNas

巴

I2 0   u n i t s

で

DNA

テ ン プ レ ー ト を 分 解 後 終 濃 度

12.5mM EDTA

を加え反応を停止させた.さらに

5ML

i

C l

と冷 エタノーノレを加え，合成された

DIG‑RNA

を沈殿させ

1 5

，

0 0 0  g

で遠心分離した.沈殿を

8 0

%エタノーノレで、洗 浄したのち，減圧乾固してホルムアミド

10μl

と

DEPC DDW20μl

を加えて

2 0 ' C

で保存した.得られた

DIG RNA

はアガロースゲノレーホノレマリン電気泳動後ノザン プロットによりその

RNA

サイズを確認した.

DIG

標識

OC

センス

RNA

プロープは

pSP6/T‑7/0C ・ DNA

をテ ンプレートとして上記と同様に作製した.

3)組織切片の作製

移植した

DC

を滅菌下でラット皮下より採取後，メン プランフィノレターを除去し

4%

パラフオノレムアノレデヒド

(PFA)/O.lM PBS(4'C)

で一夜固定した.その後

4 ' C

，

7 0  

%， 

9 0  

%， 

1 0 0  

%各エタノ‑;レで、順次脱水した後，キ シレンに3時間， 6O'Cのパラフィンに 3時間浸漬後パラ フィン包埋した.切片はミクロトームにより約

4μm

の 厚さに作製し，滅菌後シラン処理したスライドガラス19)

上に載ぜ，ホットプレート上で数日間乾燥させた.

4) 

I n  s i t u

ハイブリダイゼーション法

DIG

標識

RNA

プロープを用いた野村ら20)の方法を一 部改変し

F i g . 1

に示したプロトコーノレに従った.

スライドガラスに貼り付けた組織切片をキシレンに

2 0

分ずつ

3

回浸潰して脱パラファン完了後，

1 0 0  

%エタ ノーノレ

3

回，

9 0  

%， 

7 0  

%エタノーノレで

1 5

秒ずつ順次親 水し，さらに

PBS

に

1

分間漬けたのち

4% PFA/PBS 

で

4 ' C

，

2 0

分間再固定した

.0.2N

塩酸に

2 0

分，

PBS

に

1

分間漬け内因性

ALP

を失活させた.プロテナーゼ

K

(1

0μg/ml  10mM  Tris‑HCl  buffer/1mM  EDTA  (TE))

で

3TC

，

1 7

分反応させた後，

PBS

に

1

分，

0.lM

トリエタノールアミン塩酸

(TEA

，

pH  8 . 0 )

に

1

分，

0 . 2 5  

%無水酢酸

/TEA

に

1 0

分浸潰し，アセチノレ化を行った のち，

PBS

に

1

分間つけ，

7 0  

%， 

1 0 0  

%エタノーノレで、順 次脱水したのち風乾した.

ハイブリダイゼーション溶液は，

DIG‑RNA

プローブ

(0.6μg)

， 

tRNA(80μg

， 

Bakers Y e a s t  t r a n s f e r  RNA

， 

Sigma

社製)，

20mM  Tris‑HCl(pH8.0)

， 

2.5mM  EDTA(pH 8 . 0 )

， 

1  x  D

^巴

n h a r t ' s

液，

0 . 3  M NaCl

， 

5 0  % 

ホルムアミド，

1 0  

%硫酸デキストラン

(Sigma

社製)，

DEPC‑DDW

を加えて全量

1ml

に調製し，

9 0 ' C

， 

1 0

分間 加熱した後，氷水中で急冷した.

前処理した切片に

DIG‑RNA

プロープを含む上記ハ イブリダイゼーション液を滴下し，パラフィノレムで覆い，

5 0  

%ホノレムアミドを入れたモイスチャーチャンバー内 で

5 0 ' C1 6

時間ハイブリダイズした.過剰の

RNA

プロー プ、を洗浄するため以下の操作を行った.

5 0 ' C

の

5xSSC(O. 0 7 5  M  Sodium  c i t r a t e / O .  7 5  M  NaC

I)中で、スライドガラスからパラフィルムを除去し，

2  xSSC/50 

%ホノレムアミド中で

5 0 ' C3 0

分間加熱後，

1 0   m M   Tris‑HCl  b u f f e r   pH8.0/500mM NaC

1/

1mM  EDTA(TNE)

中 で

3TC

，

1 0

分 間 ， つ い で

1μg/ml

の

RNase A(Sigma

社〕を加えた

TNE

中で

3TC

，

3 0

分間 インキュベイトし，さらに

TNE

中で

3TC

，

1 0

分，

2  x  SSC

で

5 0 ' C

，

2 0

分，

0.2xSSC

で

5 0 ' C

，

2 0

分

2

回繰り 返し洗浄した.

DIG‑RNA‑mRNA

ハイブリッドの検出は

DIG Nu

^田

c l e i c  a c i d  d e t

巴

c t i o nK i t ( B o e h r i n g e r  Mannheim

社製〉

を用いて行った.室混で

Digb u f f

巴

r

1(

0 . 1  M T r i s ‑HC

I/ 

0 . 1 5  M N  a C l

， 

pH  7 . 2 )

で

5

分，1.

5%

ブロγキング溶液/

Di

g  b u f f e r  1

で

6 0

分，

Dig b u f f e r  1

で

1

分処理したの ち，

5 0 0

倍に希釈した

ALP

標識抗ジゴキシゲニン抗体を

3 0

分間反応させた.

0 . 0 2  % Tw

巴

e n2 0

含有

b u f f

巴

r1

で

2

回

1 5

分間洗浄し，

b u f f e r  3  ( 0 . 1  M Tris‑HC

I/

0 . 1  M  NaC

1/

0 . 0 5  M MgCl

2， 

pH  9 . 5 )

に

3

分浸潰した後

ALP

の基質である

NBT(nitroblue t e t r a z o l i u m   s a l t )

と

X P h o s p h a t e ( 5 ‑bromo ‑ 4 ‑c h l o r o  ‑ 3 ‑i n d o l y l   p h o s p h a t e

， 

t o l u i d i n i u m  s a l t )

を混合した溶液を滴下し，モイスチャ ーチャンパー内でー晩反応させ発色させた.検鏡後

TE

で反応を停止し，メチノレグリーン染色の後封入し観察し

T

こ.

結 果

1. 

Cd

投与ラットの組織中の

Cd

の蓄積

4

週 齢

w i s t a r

系雄ラットに

CdCl

，を

750μg/kg

体 重 で

4

週間〔総量約

800μg/l

匹〉投与したのちの血清，骨 髄，皮質骨，肝臓，腎臓への

Cd

の蓄積量を

Tabl

巴

l

に

実験的骨形成モデルを用いた初期の骨形成に及ぽすカドミウムの影響

( 2 5 7 )   4μm‑th i  c k   sect i  ons  mounted  o n   APTES‑coated  s  I  i  d e s  

↓ 

Deparaffinization  a n d   rehydration 

↓ 

Postfixation  i n   4

目

PFA/PBS

，

R T

， 

2 0   min 

↓ 

Immerse  i n   0.2  N H C I

， 

RT

， 

2 0   min  a n d   wash  with  PBS

， 

RT

， 

1 min 

↓ 

Treat  w i  t h   10μg/ml  Proteinase  K/TE ，  3 7

"C 

1 5   min 

↓ 

Actylation  with  0.25"  aeetic  anhydride  i n   TEA

， 

RT

， 

1 0   min 

↓ 

Immerse  i n   PBS ，  R T ，  1 min 

↓ 

Dehydration  a n d   a i r   dry 

Hybr i  d  i  z e

， 

5 0

"C， 

1 6 h   w i  t h   h e a t   denatured  DIG‑RNA  probe 

↓ 

RNase A digestion

， 

3 7

"C， 

1 7   min 

↓ 

Immerse  i n   Dig  buffer  1 ( 0 .  1 M   T r  i  s ( p H 7 . 5 ) ，  O.15M NaCI) ，  R T

， 

1 min 

↓ 

Dip  i n  

1. 

5"  blocking  solution  i n   Dig  buffer  I  R T ，  6 0   min 

↓ 

Incubate  with  anti‑digoxigenin  antibody  ( 1   5 0 0 )   c o n j  ugate  t o   a  I  k a  I  i  n e   phosphatase

， 

R T

， 

3 0   m i  n 

↓ 

Rinse  i n   Dig  buffer  3 ( O.IM  Tris  ( p H 9 . 5 )

， 

O.IM N a C l

， 

O.05M MgCI2) 

，日

T 3 min 

↓ 

Color  reaction  with  NBT  a n d   BCIP  i n   buffer  3 ，  RT

， 

over  night 

↓ 

Counterstain with  methylgreen  F i g .  

1. 

Proc

巴

d u r

巴

o f i n  s i t u   h y b r i d i z a t i o n .  

Table 

1. 

Cadmium c o n c e n t r a t i o n  i n  r a t  t i s s u

巴

sa f t e r   Cd

投与量の約

8 7

%は肝臓と腎臓に蓄積され，血清中の

r e p e a t e d  s u b c u t a n

巴

o u s

巴

x p o s u r

巴

t oC d C l C d

は

5 . 1 3ng/ml

と顕著に低濃度であったにもかかわ

T i s s u e   Cd μg/ g  w e t  t i s s u e   C o n t r o l  

Cd e x p o s u r e  

Serum  5 . 1 3

士1.

1 1 "( 6 )   ND(5)  Bone marrow  3 . 2 2

:t 

0 . 7 6   ( 6 )   ND(5)  Bone  0 . 7 6

士

0 . 2 8

(1

2 )   ND(5)  L i v e r   5 0 . 9 5

土

1 8 . 8

1(

1 2 ) < 0 .

1(

5 )   K i d n e y   4 4 . 9 1

士

5 . 9 7 ( 1 7 ) < 0 .

1(

5 )   E v e r y  v a l u e  i n   mean

士

S D . Numeral i s   p a r e n t h e s e s   i n   number o f  r a t s .   T i s s u e s  a n d  b l o o d  w e r e  t a k e n  f r o m  t h e  Cd  t r e a t e d   r a t s   3  d a y s   a f t e r   t h e   l a s t   Cd a d m i n i s t r a t i o n .   C o n t r o l  i s   n o  Cd e x p o s u r e .   ND

， 

n o t  d e t e c t e d  

" n g / m l  

示した.

Cd

投与群のラット骨髄，肝臓，腎臓への

Cd

の 蓄積量はそれぞれ

3.22μg/g

，

50.95μg/g

， 

44.91μg/g 

であり，対照群の検出限界以下に比して有意に高かった.

らず，骨髄の

Cd

濃度はその約

6 0 0

倍であった.

2 .   DC

内骨形成の組織学的検討

前述したように

Cd

を蓄積した骨髄細胞に

d

投与群〕

と対照群の骨髄細胞とを使って脱灰骨基質(DBM)と共 に

DC

内に封入してラット背部皮下へ移植した.移植後 3週目と 6週目の

DC

内新生組織の軟X線撮影をおこ なった結果，対照群の

DC

では移植

3

週後，明らかに骨形 成を示すデンシティの高い部分が観察され

6

週後には 石灰化が進んでいた

( F i g . 2 ) .

ところが

Cd

投与群の移植 6週後では

DC

内の石灰化も認められたが，対照群に比 して低密度を示した.

Cd

投与群および対照群において骨髄細胞による移植

5

週後の

DC

内組織切片の

HE

染色組織像は，

F i g . 3

に 示したように， メンプランフィノレターに接して骨が形成

( 2 5 8 )  

勝 田 敏 哉

C T R  

Cd.BM 

3 W   6 W  

F i g .   2 .   S o f t  X  ‑ r a y  r a d i o g r a p h s  o f   d i f f u s i o n   cham 

b

巴

r si n o c u l a t e d  w i t h  bone marrow c

巴l1

sand  DBM  3  and 6  weeks a f t e r  s u b c u t a n

^巴

o u si m ‑ p l a n t a t i o n .   Bone marrow c e 1 1 s  were o b t a i n e d   from Cd t r

巴

a t

巴

dr a t s   (Cd‑BM) and c o n t r o l   r a t s   (CTR).  R a d i o p l a q u

巴

c o n f i g u r a t i o n s which  i n d i c a t e   m i n e r a l i z e d   s t r u c t u r e s   a r

巴

o b s e r v

巴

di n   t h e  d i f f u s i o n  chambers  6  w

巴巴

k s a f t e r  i m p l a n t a t i o n  

され

DC

の中心に向かつて軟骨細胞様細胞が認められた.

このように対照群では骨と軟骨の形成が組織学的にも観 察されたが，

Cd

投与群では軟骨細胞様細胞が多く，骨の 部分の面積が少なかった.

3 .   DC

内骨形成における生化学的パラメーターの経 時的変化

ラット骨髄細胞による

DC

内骨形成過程を定量的に解 析するために生化学的パラメーターとして

Ca

や

P i

の 蓄積量，

ALP

活性および骨組織に特異的な蛋白質，

OC

濃度を経時的に測定した.

DC

内新生組織中の骨塩量を

F i g .   3 .   L i g h t  m i c r o g r a p h s  o f   c r o s s  s

巴

c t i o n so f   t h e   d i f f u s i o n  chambers c o n t a i n i n g  c o n t r o l  bone  marrow ( a )  and C d ‑ t r e a t e d  bone morrow ( b )   w i t h   DBM 5 we

巴

k s a f t e r   i m p l a n t a t i o

日

( h

巴

m a t o x y l i nand e o s i n  s t a i n i n g

， 

x  1 0 0 )   At t h e  t o p   o f   t h

巴

newlyformed bon

巴，

t h e   s u r f a c

巴

i si n  c

1

0 s e  c o n t a c t  w i t h  t h e  M i l l i p o r e   m

巴

mbrane f i l t e

r. 

Bone  t o g

巴

t h e r w i t h   o s t e o c y t i c  l a c u n a

巴

( B )i s  c

1

e a r l y  s e e n  i n  c

1

0 s

巴

p r o x } m i t y  t o  t h e  membran

巴

f i l t e r

，

and c a r t i   l a g

巴.

( C )  i s   f o u n d  toward t h e  c e n t

巴

ro f  t h e  

D

C. 

M ，  i n d i c a t e s  DBM 

示す

Ca

と

P i

の蓄積量は対照群，

Cd

投与群ともに

4

週 いた.

以後経時的に増加したが，

Cd

投与群においては，

Ca

， 

P i   4 .   DC

内新生骨中の骨基質蛋白質の

mRNA

の発現 共に対照群に比して低値を示した

( F i g . 4 ) . Cd

投与群のラット骨髄細胞による

DC

内骨形成は対

骨芽細胞膜に局在し骨芽細胞の活性を示すとされる 照群に比して抑制されていることが組織学的，生化学的

ALP

活性を測定した結果，対照群の

DC

内新生組織の酵 に明かになったのでさらに

DC

内の骨形成過程における 素 活 性 は

4

週にピークを示した.

Cd

投 与 群 の

DC

内 骨基質蛋白質の遺伝子発現に対する

Cd

の影響を検討し

ALP

活性は移植後3‑

5

週の期間，対照群より有意に低 た.

かったが6週後には対照群の活性値と近い値を示した 移植後5週間を経た両群の

DC

内組織から抽出した全

( F i g .  5 ) .   RNA 5μg

をアガロースゲノレ電気泳動後，

3 2 p

でラベノレ

DC

内で新しく合成された

OC

の量を測定すると，対 したラット

OC

および

OPcDNA

をプロープとしてノ 照群では

5

週以後顕著に増加したが

Cd

投与群では

OC

ザンプロッティング法で分析した後のオートラジオグラ の合成は著しく抑制された

( F i g .6 ) .

この

OC

蛋白量の ムを

F i g . 7

に示した.

経時的変化は特に

P i

の蓄積量の経時的変化と並行して 1.

5  kb

の位置に

OPmRNA

のバンドとして

3 2 p

の集

(259) 

3  4 5 6   Weeks  p o s t ‑ i m p l a n t a t i o n  

F i g .   5 .   A l k a l i n

巴

p h o s p h a t a s ea c t i v i t y   w i t h i n  d i f f u

^四

s i o n  chamber i m p l a n t s .  

R e s u l t s  a r e

巴

x p r e s s e da s  mean

土

SEMfrom  8  o r   9  DC i m p l a n t s  f o r   t h e   c o n t r o l   ( o p e n   b a r s )   o r   C d ‑ t r e a t e d   ( h a t c h e d   b a r s )   bon

巴

marrow c e 1 1 s  and DBM 

A s t a r i s k s   i n d i c a t e   s i g n i f i c a n t   d i f f

巴

r

巴

n c e between  t h e   two  g r o u p s   ( *  *  p  <  0  .  0 1  ; 

*p<O.05)

ー

* *  

実験的骨形成モデルを用いた初期の骨形成に及ぼすカドミウムの影響

1 . 2  1 . 0  0 . 8   0 . 6   0 . 4   0 . 2  

nu  

nり

回

E

¥ 一 _o

一 E

Eミ

E O

坦

φ

コ ω ω

一

H

仏﹂

︿

30 

1 0  

O  20 

15 

10  5 

︒ コ 回 目 一 一

F

︒ EB

ミ 句

︒

︒

ε¥Oミ

a .  

@コ問的恒

* * *  

40 

20 

1 0   30 

︒ コ

一

H

ω ω E

回

h z o o

5  Weeks  p o s t ‑ i m p l a n t a t i o n  

F i g .  

6. 

O s t

巴

o c a l c i nc o n c e n t r a t i o n  i n  d i f f u s i o n  c h a r r

^ト

b

巴

ri m p l a n t s .  

Each d a t a  r e p r e s e n t s  t h

巴

m

巴

anand SEM  o f   d u p l i c a t e  RIAs from 

8 

o r  

9 

i m p l a n t s  f o r  t h e   c o n t r o l   ( o p e n  b a r s )  

or 

C d ‑ t r e a t e d  ( h a t c h e d   b a r s )  bone marrow c e 1 1 s  and DBM. 

A s t a r i s k s   i n d i c a t

巴

s i g n i f i c a n t d i f f

巴

r e n c e betw

巴巴

nt h e  two g r o u p s . 申* *p<O.O

Ol ; 

*p<O.05)  O  6  3 4 5  

W e e k s   p o s t ‑ i m p l a n t a t i o n  

F i g .   4 .   Calcium  and  p h o s p h o r u s   c o n c e n t r a t i o n   i n   d i f f u s i o n  chambers e x p l a n t

巴

d3  t o   6  weeks  a f t

巴

ri m p l a n t a t i o n .   R

巴

s u l t sa r e  e x p r

巴

s s

巴

da s   mean

^土

SEMfrom 

8 

o r  

9 

DCs i m p l a n t e d  w i t h   c o n t r o l  ( o p e n  b a r s )   o r  C d ‑ t r e a t e d  ( h a t c h

巴

d b a r s )  bone marrow c

巴

1 1 sand DBM. 

A s t a r i s k s   i n d i c a t e   s i g n i f i c a n t   d i f f e r e n c e s   between c o n t r o l   and C d ‑ t r e a t

巴

dbone mar  r o w .   (**p<O.Ol; *p<O.05) 

積が認められ，

Cd

投与群の発現量は対照群に比べてやや 低いが両群ともシグナノレ強度は強かった. ところが

Cd

投与群

DC

内の

OCmRNA

の発現量を示すシグナノレ強 度は対照群に比べて著しく弱かった

.Cd

投与群と対照群 における

OCmRNA

の発現量の相違は

OC

蛋白量の相 違に反映されていた.なお，図示していないが移植する 前の対照群の骨髄のみでは

OP

および

OC

の

mRNA

の 発現は認められず内部標準として用いたβ アクチン

mRNA

のみが発現していた.

5 .   I n  s i t u

ハイブリダイゼーション

移植

5

週後の

DC

内組織切片に， DIG標識

RNA

プロ ープを用いて

I ns i t u

ハイブリダイゼーション法(I

SH

法〉を行った.対照群に比し

Cd

~こ曝露した骨髄細胞を使

O  6 

( 2 6 0 )  

勝 田 敏 哉

OP  OC  β‑AC 

← 1 . 5  kb 

← 0 . 6   kb 

← 1 . 2   kb 

F i g

^目

7 .Northern b l o t  a n a l y s i s  o f  o s t e o c a l c i n  and o s t e o p o n t i n  mRNA  i n  DC a t  5  weeks a f t

巴

ri m p l a n t a t i o n

^目

T o t a lRNA ( 5 μ g )  was  l o a d e d  on

巴

achl a n e .   RN  A t r a n s f

巴

r r e dt o   a  n y l o n  f i l t e r  was  h y b r i d i z e d  w i t h  3 2 P ‑ I a b

巴

l e d0

^目

3 6and 0 . 7 0  kbp cDNA f o r  r a t   o s t

巴

o c a l c i nand o s t e o p o n t i n

， 

r e s p e c t i v e l y

， 

and t h e  d u r a t i o n  o f   a u t o r a d i o g r a p h i c  e x p o s u r e  was 4 8 h .   Th

巴

mRNAl e v

巴

I so f  r a t   βactin was shown t o  n o r m a l i z e  t h e  amount o f  RNA 

用した

Cd

投与群では

OCmRNA

のシグナノレ〔紫色〉が

弱かった

( F i g .8 ) .

ネガティブコントロールとしてセン ス

RNA

プロープを使用した

ISH

像ではシグナノレは検 出されなかったことを確認した〔写真は不掲載).

OC  mRNA

のシグナノレはメンブレンに接する骨部分には弱

く，その下部の骨軟骨細胞部分に検出された.移植

6

週 後iこなると対照群の

DC

内新生骨切片の

ISH

像におい て，

OC mRNA

のシグナノレが骨細胞に強く認められた

( F i g .  8  c )

^圃

考 察

これまで，

i n  v i t r o

の骨形成実験における

Cd

の直接作 用について検討が重ねられてきた.それらの報告をまと めると

Cd

はコラーゲン合成に関する酵素であるプロリ ンの水酸化酵素21)やリジノレオキシダーゼを間害し22)，

ALP

活性の低下を引き起こす叫.ことから，

Cd

は骨芽細 胞に直接作用して骨障害を引き起こすとしている.しか し，既報の

i nv i t r o

の培養系では骨芽細胞がすでに存在 しているため，骨芽細胞への分化過程における

Cd

の作 用機序の解明は困難であった.骨髄細胞中には，脱灰骨 基質

(DBM)

に含まれる骨誘導因子などにより骨形成能

を有する細胞に分化しうる未分化間葉系細胞の存在が知 られていた叫.最近

Dohi e t   a l

もラット骨髄細胞と

DBM

を封入したディヒュージョンチャンパー

(DC)

内 で骨髄細胞が骨芽細胞へ分化して骨組織が新生すること を

OCmRNA

の発現により証明した10)，

本研究はこの

i nv i v o

に近い細胞レベノレで、の骨形成モ デルを応用して，

Cd

曝露骨髄細胞の骨芽細胞への分化過 程について組織学的，生化学的，および骨基質蛋白質の 遺伝子発現の観点から検討を行ったものである.

Cd

投与量については

S u g i h i r a e t   a l

25)の

Cd

の連続投 与実験に準じて，

750μg/kg

体重の投与量で司週間連続 投与したが，腎臓に組織学的異常を全く認めず，既存の 報告25)と一致していた.このように，腎障害の出現しない 低濃度の

Cd

投与量であったが，骨髄には平均

3.2μg/g

の

Cd

の蓄積が認められ，これは，血清中での

5ng/ml

の 約

6 0 0

倍の濃度で、あった.

Cd

が体内に取り込まれると肝臓や腎臓で重金属の解 毒蛋白質としてメタロチオネイン

(MT)

が誘導され

Cd

チオネインとして蓄積されることが知られている26).

Cd 

チオネインの形で肝臓から血流中へ流出し，おそらく骨 髄へも同じ化学形態で輸送され蓄積されると考えられて

実験的骨形成モデルを用いた初期の骨形成に及ぽすカドミウムの影響 (261) 

， 

e

… ‑ 公

，，~'Î，O 必

J ど 也 ; J t

4 乏 ‑ . . .

^̲J. 

̲ ， . J   . 

Fig， 8， 1:珂situhybridization for osteocalcin mRNA in DC implants 5Ca， b) and 6Cc， d) weeks  after implantation， Section were incubated with DIG‑UTP‑labelled antisense (posi‑ tive) RNA transcripts，  Binding of AP‑conjugated anti‑DIG‑antibody followed by  reaction with AP substrate  solution  generated  a purplc coloration in  positively 

巴xpressingcells， 

Control sections， (a， c)  Cd‑treated s巴ctionsら(b，d) 

B， bone; M， DBM ; F， membrane filter.  Original magnification (x 200) 

( 2 6 2 )  

勝 田 敏 哉 きた.しかし，著者らの研究では

MTmRNA

が肝臓や

腎臓だけでなく骨髄にも発現しておりペ骨髄における

Cd

の濃縮は

M T

の誘導に起因していることが推察され る.

このような

Cd

蓄積骨髄細胞を封入した

DC

において 骨芽細胞の機能の生化学的な指標である

Ca

，

P i

の蓄積 量，

ALP

活性，骨に特異的な蛋白質

OC

の合成量を測定 することによって初期の骨形成過程を分析した.

Ca

と ?

の沈着量は移植期間中，対照群のそれに比して

3 0%‑60 

%であった.骨のミネラル構成成分の大部分はハイドロ キシアパタイト(H

A)

の結晶であり，

Ca/P

モノレ比は 1.

6 7

である.

DC

内の

Ca

と

P i

の大部分を骨塩とみなし た場合，

Ca/P

モノレ比は

0.4‑

1.

2

となり相対的に

Ca

は 低 濃 度 の 状 態 に あ っ た . 対 照 群 の

Ca/P

モノレ比は 1.

6‑2.3

と高く， これは骨塩である

HA

のそノレ比1.

6 7

に匹敵するものであった.

骨芽細胞における無機

P i

の供給は

ALP

活性に依存 するところが大きい.

Cd

投与群

DC

の

ALP

活性は移植 期間中低値を示し，その結果

P i

の蓄積量も低く

Ca

の蓄 積もそれにともなって低かった.

Ca

と

P

の沈着量は血 清中の

Ca

2+と

P0

42 のイオン積

1 . 2 5

X 

1 0 ‑

⁶ 

M

2をはる かに越えて増加しているにもかかわらず

Ca/P

モノレ比が 小さいので

HA

の結品化には至らず異常な石灰化を引

き起こしている可能性がある.

オステオカルシン

(OC)

は，骨の非コラーゲン性蛋白質 の

1 5

%を占める分子量

5 8 0 0

のビタミン

K

依存性蛋白 質であり28)，骨芽細胞で合成されて骨基質中に分必され たのち，ハイドロキシアパタイト

( H A )

と強固に結合し て存在している2蜘0). 骨形成過程において

OC

の出現は 石灰化の引き金になるのか，逆に石灰化が

OC

発現の引 き金になるのか不明であるが，

DC

内骨形成においても

Ca

， 

P

の蓄積の経時的な増加と並行して

OC

も増加した (対照群).しかし

Cd

投与群の

OC

合成量は対照群に比 して著しく低く，蛋白レベノレでは明らかに

Cd

曝露が骨 髄細胞の骨形成能を抑制していることを示している.

非コラーゲン性骨基質蛋白質オステオポンチン

(OP)

は

OC

と同様骨芽細胞で合成される分子量約

4 4 . 0 0 0

の シアノレ酸含有リン酸糖蛋白質であり，

Arg‑Gly‑Asp

の アミノ酸配列を有することより，細胞の接着機能を持ち

HA

と強固に結合している31)32).これら二つの骨基質蛋 白質は骨形成での重要な指標となり，それらの遺伝子発 現に対する

Cd

の影響を検討することによって，骨髄細 胞から骨芽細胞への分化過程における

Cd

の作用機序が 明らかになると考えられた.

ノザンプロッティング分析の結果，

DC

内新生骨の

OP

mRNA

の発現は

Cd

投与群でやや低いが対照群と大き な差はなく，両群とも強く発現していた. ところが

OC mRNA

は

Cd

投 与 群 で ほ と ん ど 発 現 し て い な か っ た

( F i g .  

7). 

ラット胎仔の頭蓋冠や骨芽細胞の培養系において増殖 期直後から I型コラーゲγの

mRNA

が，そして

ALP mRNA

が発現されついで数日遅れて

OP

，最後に

OC

が 発現されてくると言う叫33).

Owen e t  a l

はこのように骨 形成過程での表現形質の発現は同時ではなく分化の進展 に対応するよう制御されていると推察している33).OP

が

OC

より少し早い時期に発現すること，軟骨細胞でも 発現し，組織特異性が低いことを考慮すると，本実験に おける移植5週後のO Pの発現量は対照群と

Cd

投与群 であまり差がなく発現量も多かったのであろう.そして，

分化の進んだ成熟骨芽細胞で発現される

OC

の

mRNA

は

Cd

投与群

DC

でほとんど発現が認められなかった.

この結果から

OC

蛋白質が非常に少なかったのは

Cd

に よる蛋白合成の阻害ではなく，転写活性の抑制によると 考えられる.また

OP

と

OC

の二つの表現形質は互いに 独立して発現していると考られる

特定の塩基配列の局在部位を明らかにする手法である

i n  s i t u

ハイブリダイゼーション(I

SH)

法は，既知の核酸 をプロープとしてスライドガラスに固着させた組織や細 胞試料上でハイブリッドを形成させ，特に個々の細胞に おける特定遺伝子の転写活性の検出に広く応用されてい る19)

ISH

法は，原理的にはサザンブ戸ティング法，ノ ザンプロティング法と同様に核酸のハイブリッド形成を 利用した検索法であるが，特異的核酸の局在を個々の細 胞レベノレで、明らかにできるという利点を有する.ディゴ キシゲニン

(DIG)

は植物から分離された有機化合物で，

最近

DIG

で標識した

DNA

，

RNA

プローブを用いた抗

DIG

抗 体 で 検 出 す る 非 放 射 性 標 識

ISH

法 が 開 発 さ れ た 叫 著 者 は こ の

DIGRNA

プロープを作製した.

RNA 

プロープは取り扱い上

RNase

混入による分解に注意を 要するが，ハイブリダイゼーション後

RNas

巴処理によ り非特異的吸着を減弱でき，ハイブリッド

(RNA.RNA)

形成の強さが

DNA.RNA

ハイブリッドより強く，厳し い条件での洗浄が可能となり非特異反応の除去ができた.

本実験ではセンス

RNA

プロープも用いているので信頼 性の高い陰性コントローノレが得られた.

今回の実験では

ISH

法による

DC

内

OCmRNA

の発 現はノザンブロティング分析の結果と同様，微量の

Cd

曝露により抑制された.

以上の結果，

Cd

は初期の骨形成において骨髄間質細胞 の骨芽細胞への分化を抑制し特に石灰化以降の高度な分

実験的骨形成モデルを用いた初期の骨形成に及ぼすカドミウムの影響

( 2 6 3 )  

化を抑制していることを示唆している.本研究は徴量の 接，御指導，御教示いただきました土肥祥子助教授に深

Cd

が初期の骨形成において骨髄細胞からの骨芽細胞へ く感謝致します.また，本研究を行うにあたり多大な御 の分化を抑制していることを分子レベルで始めて明らか 助言を頂きました森山忠重名誉教授，化学科講座田端可

にしたものである. 郎教授，整形外科学講座大串 始博士，公衆衛生学教室

結

^墨日間⁴

諸兄らに感謝の意を表します.

Cd

による骨障害の機序を明らかにするため，

i n   v i v o   文 南 犬

実験的骨形成モデノレ，ディヒュージョンチャンパー

(DC)

1) 

Nogawa

， 

K.:  I t aHtai  d i s e a s e   and  f o l l o w ‑ u p  

移植法を応用して，

Cd

曝露ラット骨髄細胞から骨芽細胞

s t u d i e s

^回 初

Cadmium i n   t h e   E n v i r o n m e n t  

への分化を，

Ca

， 

P i

の蓄積量，

ALP

活性，骨基質蛋白質

( N r i a g u

， ]. 

0 .

， 

e d ふ P a r t2

， 

Jhon Wiley and S o n s

，  オステオカノレシン(O

C )

量等生化学的マーカーの推移や

NewYork

， 

p l ‑ 3 8

， 

1 9 8 1

^目

OC

の遺伝子発現から検討し，以下の結論が得られた

2 )Adams

， 

R .  G .

， 

H a r r i s s

， 

J .   F .  and S c o t t

， 

P .  :  The 

1. 

Cd

投与ラット骨髄細胞を封入した

DC

では，移植

d e v e l o p m e n t   o f   cadmium i n d u c e d   p r o t

巴

i n u r e a

，

6

週後でも対照群に比べて

X

線学的にも組織学的にも

impared  r e n a l   f u n c t i o n

， 

and  o s t e o m a l a c i a   i n  

骨軟骨形成量が少なかった

a l k a l i n

巴

b a t t

巴

r yw o r k e r s .  

Q. ]. 

Med.

，

3 8  :  4 2 5 ‑ 4 4 3

， 

2 .   Cd

曝露骨髄細胞の

DC

では骨塩の形成を示す

Ca 1 9 6 9  

や

P

の蓄積量は低く，

ALP

活性{直も移植期間中そのピ

3 )   N  omiyama

， K. 

and N  omiyama

， 

H. :  Cadmium 

ークを示すことなく，低レベノレであり，移植

6

週後に上

i n d u c e d  r e n a l   d y s f u n c t i o n  ;  e p i d e m i o l o g y

， 

t r e a t ‑

昇して対照群

DC

の活性値に近づいた.また骨に特異的

ment and m e d i c a l  p r e v e n t i o n .  DMW  J  apan 1 6  :  i n  

な蛋白質である

OC

の合成量は有意に低く，その推移は

p r

巴

s s

，

1 9 9 4 .  

Ca

や

P

の蓄積量の経時的変化と並行していた

4 )Feldman

， 

S .   L .  and C o u s i n s

， 

R .  J .   :  I n f l u e n c e  o f   3 .  

ノザンプロッティング分析によれば移植

5

週後の

cadmium  on  t h e   metabolism  o f   2 5 ‑ h y d r o x y   DC

内骨形成において，骨基質蛋白質オステオポンチン

c h o l e c a

1c

i f e r o l  i n  c h i c k s .  Nut

r. 

R

巴

p .I n t .   8  :  2 5 1 ‑

(O

P )

の

mRNA

の発現は

Cd

投与群の

DC

でやや弱いも

2 6 0

， 

1 9 7 3  

のの，

Cd

投与群，対照群ともシグナノレ強度は強かった

の Yuhas

，E. M.， 

Miya

， 

T .  S .   and S c h n e l l

， 

R .  C .  : 

一方成熟した骨芽細胞で、発現される

OCmRNA

の発現

I n f l u e n c e   o f   cadmium  on  c a

1c

ium  a b s o r p t i o n  

量は

Cd

投与群で，顕著に低下した

fromt h e  r a t  i n t e s t i n e .  Toxico

l. 

Appl

^目

Pharmacol

I

η s i t u

ハイブリダイゼーション法の検討でも，

Cd

投

4 3  :  2 3 ‑ 3 1

， 

1 9 7 8

^目

与群の

DC

で骨軟骨部における

OCmRNA

の発現量の

6 )   Y o s h i k i

， 

S .

， 

Yanagisawa

， 

T .

， 

Kimura

， 

M.

，  低下が認められた

O t a k i

，

N.

， 

S u z u k i

， 

M. and Suda

， 

T .

^目

Boneand 

以上のことから

Cd

曝露骨髄細胞による

i n v i v o

の

k i d n e y  l e s i o n s  i n   exp

巴

r i m e n t a lcadmium i n t o x i   DC

内骨形成の低下は骨髄細胞の未分化問葉細胞の骨芽

c a t i o n .  A r c h .  E n v i r o n .  H e a l t h  3 0  :  5 5 9 ‑ 5 6 2

， 

1 9 7 5 .  

細胞への分化の抑制に起因しており，特に骨芽細胞の成

7 )   Miyahara

， 

T .

， 

Miakoshi

， 

M.

， 

S a i t o

， 

Y .   and 

熟期に発現するとされる

OC

遺伝子の転写活性の低下が

Kozuka

， 

H. :  I n f l u e n c e  o f  p o i s o n o u s  m e t a l s  on 

骨形成を抑制していることが明らかになった

bonemetabolism

， 

I I I .   Th

巴

e f f e c to f  cadmium on  bone r e s o r p t i o n  i n  t i s s u

巴

c u l t u r e .Toxico

l. 

Appl  Pharmaco

l. 

5 5

・

4 7 7 ‑ 4 8 3 ， 1 9 8 0  

〔本研究の要旨は，

1 9 9 3

年第

6 3

回日本衛生学会総会にお

8 )   F r i e d e n s t e i n

， 

A.  J .

， 

Petrakova

， 

K.  V.

，  いて発表した.)

K u r o l e s o v a

， 

A. 

I. 

and F r o l o v a

， 

G .   P .  :  H e t e r ‑

謝 辞 ^{o t o p i c  t r a n s p l a n t s  o f}  bone marrow. T r a n s p l a n t a

^】

t i o n  6  :  2 3 0 ‑ 2 4 7

， 

1 9 6 8 .  

稿を終えるにあたり，御指導，御校閲を賜りました米

9 )   Ohgushi

， 

H.

， 

Okumura

， 

M.

， 

Tamai

， 

S .

， 

H i o r s

， 

E .  

増園雄教授に深甚なる謝意を捧げるとともに，御校閲

C . and  Caplan

， 

A .  

I.: Marrow  c

e l l   i n d u c e d  

御助言を賜りました生化学講座神谷知調教授ならびに口

o s t e o g e n e s i s  i n  p o r o u s  h y d r o x y a p a t i t e  and t r i c a l ‑

腔外科学講座杉村正仁教授に深謝いたします.さらに直

cium p h o s p h a t e .  ] .   B i o m e d .  Mate

r. 

R e s .  2 4  :  1 5 6 3  

( 2 6 4 )

^ぐ 勝 田 敏 哉

‑ 1 5 7 0

， 

1 9 9 0  

1 0 )   Dohi ，  Y. ，  Ohgushi ， 

H.

，  Tabata ，  S . ，  Yoshikawa ，  T . ，  Dohi ，  K .   and Moriyama ，  T .  :  O s t e o g

^巴

n e s i s a s s o c i a t e d  w i t h  bone Gla p r o t e i n  g

巴

n

巴

e x p r e s s

lO

n i n  d i f f u s i o n  chambers by bone marrow c

巴lI

sw i t h   demin

^巴

r a l i z e dbone m a t r i x .  J

. 

Bone Mine

r. 

Res  7  :  1 1 7 3 ‑ 1 1 8 0

， 

1 9 9 2 .  

1 1 )   Nishimoto ，  S ，  K . ，   Chang ，  C .  

H.

，  G e n d l e r ，  E . ，  S t r y k e r ，  W. F .  and Nimni ，  M. E .  :  The e f f

^巴

c to f   a g i n g  on bone f o r m a t i o n  i n   r a t s  :  B i o c h e m i c a l   and  h i s t o l o g i c a l   e v i d e n c

巴

f o r d e c r e a s

巴

d bon

巴

f o r m a t i o n  c a p a c i t y .   Ca

1c

i f

^目

T i s s u

巴

I n t

^目

3 7:  6 1 7   6 2 4 ，  1 9 8 5 .  

1 2 )   Chen ，  P .  S . ，  T o r i b a r a ，  T .   Y. J r .   and Warner ，  H. :  M i c r o d e t e r m i n a t i o n   o f   p h o s p h o r u s .   Anal  Chem. 2 8  :  1 7 5 6 ‑ 1 7 5 8

， 

1 9 5 6 .  

1 3 )   Haneji ，  T . ，  Kurihara ，  N. ，  I k e d a ， K .   and  Kumegawa ，  M. :  1 ，  2 5 ‑ D i h y d r o x y v i t a m i n  D 3  and  a n a l o g u e s  o f   v i t a m i n  D3 i n d u c e   a l k a l i n e   p h o s

^悶

p h a t a s e  a c t i v i t y  i n  o s t

巴

o b l a s t i cc e l l s  d e r i v e d  from  newborn mous

^巴

c a l v a r i a .J

. 

B i o c h

^巴

m.9 4 :  1 1 2 7 ‑ 1 1 3 2

， 

1 9 8 3 .  

1 4 )   Otawara ，  Y. ，  Hosoya ，  N. ，  K a s a i ， 

H.

，  Okuyama ，  N. and Moriuchi ，  S .

^・

P u r i f i c a t i o nand c h a r a c t

^巴

r

^日

i z a t i o n  o f  c a

1c

ium b i n d i n g  p r o t e i n  c o n t a i n i n g γ   c a r b o x y g l u t a m i c  a c i d  from r a t  b o n e .  

J. Nutr. 

S c i   Vitamino

l. 

2 6  :  2 0 9 ‑ 2 1 9

， 

1 9 8 0 .  

1 5 )   Sugimoto ，  K . ，   Dohi ，  Y . ，  Dohi ，  K . ，   Yonemasu ，  K . ，  Fujimoto ，  J . ，  Kanauchi ，  M. ，  Yamanaka ，  F . ，  Moriyama ，  T .   and Ishikawa ，  H. :  S

巴

ruml e v

巴

l s o f   bone g l a ‑ p r o t

^巴

i ni n   normal humans and i n   p a t i e n t s  w i t h  c h r o n i c  r e n a l  f a i l u r e .  Min

巴

r a

l.

E l e c .   t r o l y t e .  Metab

^目

1 3:  1 5 2 ‑ 1 5 7

， 

1 9 8 7 .  

1 6 )  

Ol

dberg ，  A. ，  Franzen ，  A .  and Heingord ，  D .  :  C l o n i n g  and s

^巴

qu

^巴

n c ea n a l y s i s  o f  r a t  bone s i a l o .   p r o t e i n  C o s t e o p o n t i n )  cDNA r e v e a l s  an Arg‑Gly 

‑Asp c e l l ‑ b i n d i n g   s e q u

巴

n c e . P r o c .   N  a t

l. 

A c a d .   S c i .  USA. 8 3  :  8 8 1 9 ‑ 8 8 2 3 ，  1 9 8 6 .  

1

7) 

P i o t r ，  C .  and N i c o l e t t a ，  S .   :  S i n g l e  s t e p  method  o f   RNA  i s o l a t i o n   by  a c i d   guanidinium  t h i o c y a n a t e ‑ p h e n o l ‑ c h l o r o f o r m  e x t r a c t i o n .  Anal  B i o c h

^巴

m.1 6 2  :  1 5 6 ‑ 1 5 9 ，  1 9 8 7  

1 8 )   Melton ，  D .  A . ，  Krieg ，  P .  A . ，  Rebag

!i

a t i ，  M. R . ，  M a n i a t i s ，  T . ，  Zinn ，  K .  and Green ，  M. R .  :  E f f i .   c i

巴

n t i n   v i t

ァ"0

s y n t h

巴

s i s o f   b i o l o g i c a l l y   a c t i v

巴

RNA and RNA h y b r i d i z a t i o n  p r o b e s  from p l a s .   mids c o n t a i n i n g  a  b a c t

巴

r i o p h a g eSP6 promoter

^目

N u c l e i c  A c i d s  R e s .  1 2 :  7 0 3 5 ‑ 7 0 5 6 ，  1 9 8 4  

1 9 )   Haffen ，  E .  M. ，  L e v i n e ，  M. ，  Garber ，  R .  L .   and  Gehring ，  W. J .   :  An improv

巴

di n  s i t u  h y b r i d i z a

^回

t i o n  method f o r  t h

^巴

d e t e c t i o no f  c e l l u l a r  RNAs i n   D r o s P h i l a  t i s s u e  s e c t i o n s  and i t s   a p p l i c a t i o n  f o r   l o c a l i z i n g   t r a n s c r i p t s   o f   t h e   h o m e o t i c   Anten  nap

^巴

d i ag e n e  c o m p l e x .  J

. 

E u r .  Mo

l. 

B i o

. l

Organ  2

^・

6 1 7 ‑ 6 2 3

，

1 9 8 3 .  

2 0 ) 鷹田誠一，森井英一，伊藤彰彦，野村晋太郎 :RNA

プロープを用いた

i ns i t u  h y b r i d i z a t i o n .

病理と臨 床

1 0:  4 5 1 ‑ 4 5 6 ，  1 9 9 2 .  

2

1) 

Miyahara ，  T . ，  Tsukada ，  M. ，  Mori ，  M.  and  Kozuka ，  H. :  The e f f

^巴

c to f  cadmium on t h

^巴

c o l . l a g e n  s o l u b i l i t y  o f  embryonic c h i c k  bon

巴

i nt i s s u e   c u l t u r e .  Toxico

l. 

L e t t .  2 2  :  8 9 ‑ 9 2 ，  1 9 8 4  

2 2 )   I g u c h i ，  H. and Sano ，  S .  :  E f f e c t  o f  cadmium on  bone c o l l a g e n  metabolism o f  r a

t. 

Toxico

l. 

App

l. 

Pharmacol

^目

6 2:  1 2 6 ‑ 1 3 6

， 

1 9 8 2 .  

2 3 )   Iwami ，  K . ，   Dohi ，  Y. and Moriyama ，  T .  :  E f f e c t   o f  cadmium on t h e  bone f o r m a t i o n  i n   c u l t u r e d   f e t a l  r a t  c a l v a r i a .  Toxico

l. 

E n v i r o n .  Chem. 2 7   1 0 5 ‑ 1 1 1

， 

1 9 9 0 .  

2 4 )   Harada ，  K. ，  Oida ，  S .   and  S a s a k i ，  S . :  Chon

^日

d r o g

巴

n e s i s and  o s t

巴

og

巴

n

巴

s i s o f   bone marrow  d e r i v e d  c e l l s  by b o n e ‑ i n d u c t i v e  f a c t o

r. 

Bone 9  :  1 7 7  ‑ 1 8 3

， 

1 9 8 8  

2 5 )   S u g i h i r a ，  N. ，  Toyama ，  C . ，  Murakami ，  M. and  S a i t o ，  H. :  S i g n i f i c a n c e   o f   i n c r

巴

a s

巴

i nu r i n a r y   m e t a l l o t h i o n e i n   o f   r a t s   r

^巴

p e a t e d l y e x p o s e d   t o   cadmium. Toxicology 4 1

・

1 ‑ 9

，

1 9 8 6  

2 6 )

区

a g i ， J .  H. R . ，  Himmelcoch ，  S .  R . ，  Whanger ，  P .   D . ，  Bethune ，  J .   L .   and V a l e e ，  B .   L .  :  E q u i n

巴

h e p a t i c  and r e n a l  m e t a l l o t h i o n e i n s  :  p u r i f i c a t i o n

， 

m o l e c u l a r  w e i g h t

， 

amino a c i d  c o m p o s i t i o n  and  m e t a l   c o n t e n

t.  J. 

B i o

l. 

Chem.  2 4 9 :  3 5 3 7 ‑ 3 5 4 2

， 

1 9 7 4 .  

2

7) 

Dohi ，  Y. ，  Sugimoto ， K . ，   Yoshikawa ，  T . ， 

Ohgushi ， 

H.

，  Katsuda ，  T . ，  Tabata ，  S .   and 

Moriyama ，  T .   Effect  o f   cadmium  on 

o s t

^巴

og

^巴

n e s i sw i t h i n  d i f f u s i o n  chambers by bone 

marrow  c

巴lI

s:  B i o c h e m i c a l

巴

v i d e n c

巴

o f d e .  

c r e a s e d  bon

^巴

f o r m a t i o nc a p a c i t y .  Toxico

l. 

App

 l.

Pharmaco

l. 

1 2 0

^・

2 7 4 ‑ 2 8 0

，

1 9 9 3 .  

実験的骨形成モデルを用いた初期の骨形成に及ぼすカドミウムの影響

( 2 6 5 )   2 8 )   P r i c e ，  P .   A . ，  Otska ，  A .   S . ，  Poser ，  J .   W. ，  F o s t e r ，  R .  A. and B u t l e r ，  W. T .  :  M

巴

c h a n i s mo f  

K r i s t a p o n i s ，  J .   and Raman ，  N. :  C h a r a c t

巴

r i z a . f i b r o b l a s t   attachm

巴

n t t o   bone  e x t r a c e l l u l a r   t i o n   o f   a γ ‑ c a r b o x y g l u t a m i c   a c i d ‑ c o n t a i n i n g   m a t r i x  :  r o l e   o f   a 4 4   k i l o d a l t o n  bon

巴

p h o s p h o ‑ p r o t e i n  from bon

巴

P r o c .Nat

 1.

A c a d .  S c i .   USA.  p r o t e i n .  J

. 

Bone Min

巴

r .R e s .  2  :  2 5 9 ‑ 2 6 5

， 

1 9 8 7   7 3

^目

1 4 4 7 ‑ 1 4 5 1 ， 1 9 7 6 .   3 2 )   Yoon ，  K . ，   Buenaga ，  R .   and  Rodan ，  G .   A .  :  2 9 )   Hauschka ，  P .  V. and Reid ，  M. R .

^目

VitaminK  T i s s u e  s p e c i f i c i t y  and d

巴

v e l o p m e n t a l

巴

x p r e s s

^lO

n

d e p e n d e n c e  o f  a  c a l c i u m ‑ b i n d i n g  p r o t e i n  c o n t a i n

ー

o fr a t  o s t

巴

o p o n t i n .B i o c h e

m. B

i o p h y s .  R e s .  Com‑

i n g  y ‑ c a r b o x y g l u t a m i c  a c i d  i n   c h i c k e n  b o n e .  J

. 

mun. 1 4 8  :  1 1 2 9 ‑ 1 1 3 6

， 

1 9 8 7 .  

B i o

 1.

Ch

巴

m.2 5 3  :  9 0 6 3 ‑ 9 0 6 8 ，  1 9 7 8 .   3 3 )   Owen ，  T .   A. ，  B o r t e l l ，  R . ，  Yocum ，  S .   A .   and  3 0 )   P r i c e ，  P .  A . ，  L o t h r i n g e r ，  J .   W. ，  Baukol ，  S .   A.  Smock ，  S .   L .  :  C o o r d i n a t e   o c c u p a n c y  o f   AP‑l  and Reddi ，  A .  H. :  Dev

巴

l o p m e n t a la p p e a r a n c e  o f   s i t e s   i n   t h e  v i t a m i n  D‑r

巴

s p o n s i v eand CCAA  T  t h e  v i t a m i n  K  ‑ d e p e n d

巴

n tp r o t e i n  o f  bone d u r i n g   box  e l e m e n t s   by  F o s ‑Jun  i n   t h e   o s t

巴

o c a l c i n c a l c i f i c a t i o n  :  a n a l y s i s  o f  m i n e r a l i z i n g  t i s s u e s  i n   g

巴

n e:  Model f o r  p h e n o t y p

巴

s u p p r e s s i o no f  t r a n ‑ human

， 

c a l f

， 

and r a

t.  J. 

B i o

1. 

Chem. 2 5 6  :  3 7 8 1 ‑ s c r i p t i o n .  P r o c .  N  a t

. 1

A c a d .  S c i .   USA. 8 7  :  9 9 9 0   3 7 8 4

， 

1 9 8

1. 

9 9 9 4

， 

1 9 9 0 .  

3

1) 

Somerman ，  M. J . ，  P r i c e ，  P .   A . ，  Sauk ，  J .   J . ，