脳梗塞後の神経細胞死におけるDNAメチル化の病態生理学的意義

論文 内 容の 要旨

1900 年 代 半 ば か ら 30 年 に 渡 り 我 が 国 に お け る 死 因 の 第 1 位 を 占 め て い た 脳 血 管 疾 患 も, 医 療 技 術 の 進 歩 と と も に そ の 死 亡 率 は 年 々 低 下 し て き た . と こ ろ が , 一 命 を 取 り 留 め て も 重 篤 な 脳 機 能 低 下 に 苦 し む 患 者 は 未 だ に 多 く, 現 在 で は 介 護 が 必 要 と な る 主 な 原 因 の 第 2 位 と な っ て い る . し た が っ て 脳 血 管 疾 患 は , 今 日 に お い て も 私 た ち が 克 服 で き て い な い 疾 患 で あ る と 言 え る. 脳 血 管 疾 患 の う ち 最 も 多 い 病 態 は , 脳 血 管 の 閉 塞 に よ り 引 き 起 こ さ れ る 脳 梗 塞 で あ る. 脳 梗 塞 治 療 の 第 一 義 的 目 的 は , 虚 血 に よ り 惹 起 さ れ る 神 経 細 胞 死 を 抑 制 し, 脳 機 能 を 維 持 す る こ と で あ る . そ の た め の 有 効 な 手 段 と し て 血 栓 溶 解 薬 の 投 与 が 行 わ れ る. こ の 薬 剤 は 劇 的 な 作 用 が 望 め る 一 方 で , そ の 適 応 は 発 症 4.5 時 間 以 内 に 限 ら れ て い る . し た が っ て , こ の 治 療 薬 を 使 用 で き る 患 者 は 全 体 の 数% と わ ず か で あ り , 異 な る 機 序 に 基 づ く 新 規 脳 梗 塞 治 療 薬 の 開 発 が 急 務 で あ る. DNA の 塩 基 配 列 に よ ら な い 遺 伝 子 発 現 制 御 機 構 の こ と を , エ ピ ジ ェ ネ テ ィ ク ス と い う. エ ピ ジ ェ ネ テ ィ ッ ク な 遺 伝 子 発 現 制 御 機 構 に は , DNA メ チ ル 化 , ヒ ス ト ン 修 飾 お よ び 非 翻 訳 RNA が 知 ら れ て い る が , 本 研 究 で は そ の う ち の DNA メ チ ル 化 に 着

目 し た . 一 般 に DNA メ チ ル 化 は , DNA メ チ ル 基 転 移 酵 素 (DNA

ー タ ー 領 域 の 内 部 や そ の 近 傍 に 存 在 し て い る CpG ア イ ラ ン ド に 含 ま れ て お り , こ の 領 域 で DNA メ チ ル 化 が 起 こ る と , 転 写 因 子 の 結 合 抑 制 や ク ロ マ チ ン の 構 造 変 化 を 引 き 起 こ し, 遺 伝 子 発 現 が 抑 制 さ れ る こ と が 知 ら れ て い る . 近 年 で は , DNA メ チ ル 化 に よ る エ ピ ゲ ノ ム 制 御 が, が ん を は じ め い く つ か の 疾 患 の 病 態 形 成 に 関 与 し て い る と 報 告 さ れ て い る. 中 枢 神 経 系 に お け る DNA メ チ ル 化 異 常 は , Rett 症 候 群 や MeCP2 重 複 症 候 群 と い っ た 重 度 の 精 神 ・ 神 経 症 状 を 引 き 起 こ す 先 天 性 疾 患 に 加 え, う つ 病 や パ ー キ ン ソ ン 病, さ ら に は ア ル ツ ハ イ マ ー 病 の 病 態 へ も 関 与 す る と さ れ て い る . と り わ け, DNA メ チ ル 化 の 亢 進 は , 筋 萎 縮 性 側 索 硬 化 症 の 運 動 神 経 細 胞 死 や 網 膜 色 素 変 性 症 の 視 細 胞 死 な ど, 種 々 の 神 経 細 胞 死 へ の 関 与 が 報 告 さ れ て い る . 脳 梗 塞 に お い て も , DNA メ チ ル 化 と 神 経 細 胞 死 と の 関 連 が 示 唆 さ れ て い る が , そ の 詳 細 は 未 だ に 明 ら か に さ れ て い な い. そ こ で 本 研 究 で は ， 脳 梗 塞 の 新 た な 治 療 標 的 創 出 を 目 的 と し, 脳 梗 塞 後 に 惹 起 さ れ るDNA メ チ ル 化 の 病 態 生 理 学 的 意 義 に つ い て 検 討 を 行 っ た . 第 1 章 で は , ラ ッ ト 一 過 性 局 所 脳 虚 血 モ デ ル お よ び 初 代 培 養 大 脳 皮 質 神 経 細 胞 に 対 す る N-methyl-D

-aspartate (NMDA) 誘 発 性 神 経 障 害 を 用 い て , 脳 梗 塞 病 態 に 伴 う DNA メ チ ル 化 の 変 化 に つ い て 検 討 し た. 第 2 章 で は , DNA メ チ ル 基 転 移 酵 素 の 阻 害 薬 お よ び siRNA を 用 い ， 脳 梗 塞 後 神 経 細 胞 死 に お け る DNA メ チ ル 化 の 寄 与 に つ い て 検 討 し た ．

第 1 章 虚 血 性 神 経 障 害 時 の DNA メ チ ル 化 の 変 化

第 1 章 で は 中 大 脳 動 脈 閉 塞 再 灌 流 (middle cerebral artery occlusion and reperfusion : MCAO/R) モ デ ル お よ び 初 代 培 養 大 脳 皮 質 神 経 細 胞 の NMDA 誘 発 性 神 経 障 害 モ デ ル を 用 い て DNA メ チ ル 基 転 移 酵 素 も 含 め た DNA メ チ ル 化 の 変 化 に つ い て 検 討 し た. MCAO/R 後 の DNA メ チ ル 化 の 変 化 を 5mC を 指 標 に 検 討 し た 結 果 , 5mC 陽 性 細 胞 数 は 梗 塞 中 心 領 域 に お い て 脳 梗 塞 24 時 間 後 ま で 経 時 的 に 増 加 す る こ と が 明 ら か と な っ た (Fig. 1). ま た , こ の 5mC 陽 性 細 胞 の 約 70% は 神 経 細 胞 マ ー カ ー で あ る NeuN 陽 性 で あ っ た (Fig. 2). 一 方 DNMT1, DNMT3a お よ び DNMT3b タ ン パ ク 質 お よ び mRNA の

変 化 を 検 討 し た と こ ろ, DNA メ チ ル 化 が 亢 進 す る 梗 塞 中 心 領 域 で は い ず れ も Sham 群 と 比 べ て 変 化 が な か っ た . こ れ ら の 結 果 を 受 け, 神 経 細 胞 で の 変 化 に 着 目 す る た め, 大 脳 皮 質 神 経 細 胞 を 用 い た 検 討 を 行 っ た. 脳 梗 塞 後 細 胞 外 に 放 出 さ れ た グ ル タ ミ ン 酸 に よ る NMDA 受 容 体 の 過 剰 刺 激 は Ca2+ _{の 細 胞 内 へ} の 過 剰 流 入 を 招 く. こ の こ と は グ ル タ ミ ン 酸 興 奮 毒 性 と し て 知 ら れ, 脳 梗 塞 後 の 神 経 細 胞 死 の 一 端 を 担 っ て い る と さ れ る. NMDA 受 容 体 刺 激 に よ る 細 胞 障 害 モ デ ル を 用 い て 検 討 し た 結 果, in vivo モ デ ル で の 変 化 と 同 様 に 5mC 陽 性 細 胞 数 が 増 加 し た (Fig. 3). 5mC 陽 性 細 胞 数 は NMDA 処 置 30 分 後 を ピ ー ク に 一 過 性 に 増 加 し, そ の 後 コ ン ト ロ ー ル 群 と 同 程 度 ま で 減 少 し た. ま た , DNA メ チ ル 化 の 亢 進 に は DNMTs の 量 的 変 化 は 伴 っ て い な か っ た. 以 上 の 結 果 よ り, DNMTs タ ン パ ク 質 量 の 増 加 を 伴 わ ず に 虚 血 性 神 経 細 胞 死 に 先 行 し て DNA メ チ ル 化 が 亢 進 す る こ と が 示 唆 さ れ た . 第 2 章 虚 血 性 神 経 障 害 に 対 す る DNMT 阻 害 の 影 響 第 1 章 で は , 脳 梗 塞 後 神 経 細 胞 で DNA メ チ ル 化 が 惹 起 さ れ る こ と を 示 し た . そ こ で 第 2 章 で は DNMT 阻 害 薬 を 用 い て , DNA メ チ ル 化 亢 進 が 脳 梗 塞 病 態 に 与 え る 影 響 に つ い て 検 討 し た. ま た , 各 DNMT ア イ ソ フ ォ ー ム の siRNA 導 入 を 行 い , 脳 梗 塞 後 神 経 細 胞 で 亢 進 す る DNA メ チ ル 化 に 寄 与 す る DNMTs の 同 定 を 試 み た . 大 脳 皮 質 神 経 細 胞 を 用 い た 検 討 で, DNMT 阻 害 薬 の 投 与 は NMDA 誘 発 性 神 経 障 害 に 対 し て 保 護 効 果 を 示 し た (Fig. 4). ま た , DNMT 阻 害 薬 は NMDA 処 置 に よ り 惹 起 さ れ る 5mC 陽 性 細 胞 数 の 増 加 も 抑 制 し た . グ ル タ ミ ン 酸 興 奮 毒 性 は ア ポ ト ー シ ス を 引 き 起 こ し, 梗 塞 巣 の 進 展 に 寄 与 す る こ と が 知 ら れ て い る た め , ア ポ ト ー シ ス の 実 行 に 関 与 す る cleaved caspase-3 に つ い て も 検 討 を 行 っ た . そ の 結 果 , NMDA 処 置 に

Fig. 3 Changes in the ratio of 5mC-positive neurons to total cells after start of NMDA (closed triangle) or vehicle (open circle) treatment. *Significant difference against the control group of same time point (p<0.05). NT, non-treated group.

よ り 増 加 し た cleaved caspase-3 は , DNMT 阻 害 薬 投 与 に よ り 抑 制 さ れ た (Fig. 5). 次 に, 神 経 系 の 株 化 細 胞 Neuro2a に 各 ア イ ソ フ ォ ー ム の siRNA を 導 入 し , グ ル タ ミ ン 酸 興 奮 毒 性 に 対 す る 効 果 を 検 討 し た. こ の 検 討 を 行 う 前 に , 分 化 誘 導 後 Neuro2a に 対 す る グ ル タ ミ ン 酸 処 置 は, NMDA 受 容 体 を 介 す る 細 胞 障 害 で あ る こ と, お よ び 大 脳 皮 質 神 経 細 胞 で 得 ら れ た 結 果 と 同 様 に, こ の 細 胞 障 害 は DNMT 阻 害 薬 に よ り 保 護 さ れ る こ と を 確 認 し た. こ の 系 を 用 い て siRNA に よ る 各 DNMT ア イ ソ フ ォ ー ム の ノ ッ ク ダ ウ ン を 行 っ た 結 果, い ず れ の ア イ ソ フ ォ ー ム の ノ ッ ク ダ ウ ン も グ ル タ ミ ン 酸 興 奮 毒 性 に よ る 生 存 率 の 低 下 を 抑 え な か っ た (Fig. 6). 以 上 の 結 果 か ら, 脳 梗 塞 後 神 経 細 胞 に お け る DNA メ チ ル 化 の 亢 進 は caspase 依 存 性 の 細 胞 死 を 誘 発 す る こ と が 明 ら か と な っ た. ま た , 虚 血 性 神 経 障 害 に よ り 惹 起 さ れ る DNA メ チ ル 化 の 亢 進 と そ れ に 続 く 神 経 細 胞 障 害 に は, DNMT1, DNMT3a お よ び DNMT3b が 協 調 的 に 関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た .

Fig. 4 Effects of DNMT inhibitor (Zebularine) on NMDA-induced cell injury. (A) Representative images of PI staining are shown. The scale bar indicates 50 μm. (B) PI -positive cells were counted as dead cells and are shown as the ratio to total cells. PI, propidium iodide; CTL, control group; Zeb, zebularine.

Fig. 5 Effect of DNMT inhibitor (zebularine ) on the protein level of cleaved caspase-3 8 h after NMDA treatment.

総 括 本 研 究 に よ り, 脳 梗 塞 後 神 経 細 胞 に お け る DNA メ チ ル 化 は , 各 DNMTs を は じ め 種 々 の タ ン パ ク 質 が 協 調 す る こ と に よ り, 細 胞 死 の 開 始 因 子 の 一 つ と し て 亢 進 す る こ と が 明 ら か に さ れ た. ま た , DNA メ チ ル 化 の 亢 進 は caspase 依 存 性 の 細 胞 死 を 惹 起 す る こ と が 示 唆 さ れ た (Fig. 7). こ れ ら の 結 果 は, 脳 梗 塞 の 梗 塞 巣 の 進 展 に DNA メ チ ル 化 が 寄 与 す る こ と を 示 し て お り, 脳 梗 塞 の 新 た な 治 療 標 的 創 出 の た め, 有 益 な 知 見 を 見 出 し た. 【 研 究 成 果 の 掲 載 誌 】

Asada M. et al., Front Neurosci., 14:581915 (2020).

論文審査の結果の要旨 医療の進歩とともに脳血管疾患での死亡率は年々低下しているものの、重篤な脳機能低下に苦 しむ患者は未だに多い。脳血管疾患のうち最も多い病態は脳血管の閉塞により引き起こされる脳 梗塞である。その脳梗塞に対する治療の第一義的目的は虚血により惹起される神経細胞死を抑制 し脳機能を維持することである。血栓溶解薬の投与は劇的な作用が望める一方で、副作用回避の ため投与開始時間が制約され、この治療が適用される患者は限られている。このため異なる機序 に基づく新規脳梗塞治療薬の開発が急務とされている。 エピジェネティックな遺伝子発現制御機構のひとつである DNA メチル化とは、DNA メチル

基転移酵素 (DNA methyltransferase : DNMT) により DNA 中のシトシンにメチル基が付与さ

れことを指す。哺乳類ではDNMT1 および DNMT3（DNMT3a および DNMT3b）が DNA メ

チル化反応を担っている。DNMT1 は DNA 複製の際にメチル基を転移する維持 DNA メチル化

酵素として、DNMT3a および DNMT3b はそれぞれ成熟期および発生初期におけるde novo DNA

メチル化酵素として機能する。中枢神経系における DNA メチル化の亢進は筋萎縮性側索硬化症 の運動神経細胞死や網膜色素変性症の視細胞死など、種々の神経細胞死へ関与する。脳梗塞にお いても DNA メチル化と神経細胞死との関連が示唆されているものの、その詳細は未だに明らか にされていない。 そこで本研究では脳梗塞の新たな治療標的創出を目的とし、脳梗塞後に惹起される DNA メチ ル化の病態生理学的意義について検討を行った。第 1 章では、ラット一過性局所脳虚血

（MCAO/R）モデルおよび初代培養大脳皮質神経細胞に対する N-methyl-D-aspartate (NMDA)

誘発神経障害を用いて脳梗塞病態に伴うDNA メチル化の変化について検討した。MCAO/R 後の

DNA メチル化の変化を 5-methylcytosine（5mC）を指標に検討した結果、5mC 陽性細胞数は梗

塞中心領域において脳梗塞 24 時間後まで経時的に増加した。この 5mC 陽性細胞の約 70%は

NeuN 陽性の神経細胞であった。一方、DNMT1、DNMT3a および DNMT3b タンパク質量およ

びmRNA 量は DNA メチル化が亢進する梗塞中心領域でいずれも Sham 群と比較し変化しなかっ