学 位 論 文
遺伝子工学的手法を用いた新たなエイズ予防・治療薬の開発
一ヒト化抗HIVモノクローナル抗体一
2003年3月
江 田 康 幸
Development of a Humanized Anti−HIV Monoclonal Antibody for Prevention and Therapy ofAIDS by Using Gene Teclmology
Yasuyuki Eda
ABSTRACT
AIDS is caused by human irnm皿ode且ciency vi皿s（HIV）infection．圃s s加dy， we constructed a broad neutralizing humanized anti−HIV monoclonal antibody （mAb）． Mass
・production of this mAb was successfu1 and it was suggested that the clinical applications were possible．
The amino acid sequences of the third variable （rV3） region of the HIV−1 envelope
glycoprotein，gp 120， known as the principal neutralizing．determina頭PND）were analyzed with Japanese field isolates HIV−1 and it was confirmed that the GPGR sequence located at the central site of the V3 region was relatively conserved． Using six synthetic peptides，
including the GPGR sequences of field and laboratory HIV−1 strains， we sequentially irrununized mice to produce broadly neutralizing antibodies． Mice with−highly cross−reactive anti−sera were selected and cells from these animals were used to produce hybridomas． Hybridomas were sgreened by a combination of ELISA and neutralizing assays，
and mAb C25 was selected． C25 was highly cross−reactive with peptides derived from heterologous field isolates that have the GPGR sequence in the V3 region． A sequential immunization血e血od， using various antigen peptides including a common sequence， made it possible to induce antibodies recognizing the relatively short common amino acid sequence．
It was undesir〜ible that C25 be administered to humans丘om the standpoint of safety and efficacy， because C25 is a murine antibody． For the purpose of clinical applicatibn of C25 as a
therapeutic antibody， the mi血e飢ibody was h㎜a証zed． The complementarity determi血g regions and several sites in the framewQrk region of the C25 antibody gene were transferred into a human imm皿oglobulin gene and the stable reshaped antibody clone，1Φ一247， w恕 produced． The reshaping not only resulted in continued antigen binding activity， but also in improvements in safety by directing the high isoelectric point toward the neutral region． An expression vector of KD−247 was using a glutamine synthetase vector （GS−System）． The vector was transfected into NSO myeloma cells and glutamine−independent transfectants were isolated． The master cell bank（MCB）and the post−production cells（PPC）丘om the MdB were tested for cell growth， antibody expression， immunological properties， and the base sequence of the structure gene． All results of these examinations were similar to each other．
KD−247 is a humanized mAb of C25 constructed as a broad neutralizing antibody． lhe epitope of KD−247 was examined by Pepscan analysis． KD−247 revealed relatively strong binding to peptides which had more than five amino acid residues including an IGPGR sequence． The neutralizing activity of KD−247 against both CCR5 and CXCR4−tropic viruses was anticipat6d because the epitope region is distinct丘om the site related to interaction between HIV−1 and coreceptors． KD−247 neutralized cell一こ口e virus， such as the MN strain，
which is a typicai laboratory strain， and field isolates． ln addition， KD−247 suppressed the spread of infection caused by persistently infected cells and peripheral blood mononuclear cells （PBMC） from HIV−1 infected individuals． These results suggest that KD−247 binds to not only cell一三ee virus but also to gp 120 budding on the host cell．membrane． Furthemlore，
the effector血nction of KD−247 reshaped as human lgGl was examined． KD−247 had antibody−dependent， complement−mediated cytotoxic activity and antibody−dependent，
cell−mediated cytotoxic activity against HIV−1 infected cells． These results suggest that KD−247 is able to induce infected cell specific cytolysis and suppress the spread of HIV−1 infection．
An HIVIAIDS model using the highly pathogenic chimeric virus SHIV−C2／1 in cynomolgus monkeys， which causes intense plasma viral load and rapid loss of CD4 positive T cells in peripheral blood as well as in various 1ymphoid organs， was developed in the National lnstitute of infectious Diseases． We investigated the in vivo efficacy of KD−247 using this animal model． Cynomolgus monkeys were administered with KDny−247， followed by SHIV−C2／1 challenge after 24 hours． KD−247 suppressed plasma viral loads and the depletion of peripheral blood CD4 positive cells in a dose−dependent manner． ln the highest dose （45 mg／kg） administration， neither plasma viremia， detection of anti−virus antibodies （using Western blot analysis）， nor other evidence of infection was obserVed， and the monkeys inj ected with KD−247 were completely protected 丘om SHIV infection． From the pharmacokinetic analyses of KD−247， we determined that the maintenance of KD−247 concentration in blood is important to obtajn efficacy due to the differentiation between the exposure amount for each monkey． ln CD4 positive 1ymphocytes， the expression of CD95 antigen， an apoptosis−related molecule， increased by the inoculation of SHIV−C211． KD−247 also suppressed the increase of the expression of CD95． lt is considered that KD−247 affects not only the protection of CD4 positive cells from infection with neutralizing activity， but also the suppression of CD4 positive cell death from apoptosis caused by virus infection．
目 次
第1章 緒論．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．＿．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 1
第2章
2−1 2−2 2−3
マウス抗HIVモノクローナル抗体の作製と性状解析．．．．．．．．．
HIV・1主要中和領域の解析とマウスへの免疫抗原の選定 ．．．．．
マウス抗HIVモノクロ■・・…ナル抗体C25の作製．．．＿＿．＿．
C25抗体の性状解析 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．
5 5 8 9
第3章 遺伝子工学技術を用いたヒト化C25抗体（an−247）の作製．．．
3・1 構造遺伝子の構築 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．
3・1・1 C25抗体遺伝子の同定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．
3・1・2 ヒト化VH遺伝子の合成．．＿．＿．＿．＿＿．＿＿＿．
3・1・3 ヒト化VL遺伝子の合成 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．
3・2 発現プラスミドの構築 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．
3・2・1 pEE6，R且C25の構築 ．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．
3・2・2 pEE12．R：LC25 ver．IBの構築 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．
3・2・3 pEE．RC25 ver．7の構築 ．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．
3・3 KD・247産生細胞の作製 ．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．
3・4 構造遺伝子の塩基配列及び予想されるアミノ酸配列の解析．．．．
3・5 セルバンクの安定性 ．．．．．．．．，．．．∴．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．
3・5・1 継代時の安定性 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．
3・5・2 細胞の増殖性・抗体産生能 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．
3・5L3 発現タンパク質の確認 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．
14 14 14 14 15 27 27 27 29 34 35 39 39 39 40
3・5・4 構i造遺伝子の確認 ．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 41
第4章 KD−247のin vitroにおける有効性評価 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．
4・1 KD・247のエピトープ解析＿．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．
4・2 日本人感染者由来のV3発現タンパクとの反応性 ．．．．．．．．．．．
4・3 BIAcoreシステムを用いた平衡定数の測定．．．．．．．．．．．．．．．．．．
4・4 遊離ウイルス中和活性 ．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．
4・4・1 HIV・1 MN実験室株に対する中和活性 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．
4・4−2 種々の且IV」1実験室株に対する中和活性 ．．．．．．．．．．．．．．．
4・4−3 臨床分離ウイルスに対する中和活性 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．
4・5 細胞間感染抑制活性 ．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．
4・5・1 HIV・1 MN株持続感染細胞に対する細胞間感i染抑制活性．．．
4・5・2 HIV・1感染者末梢血単核細胞に対する感染拡大抑制活性．．．
4・6 感染細胞破壊活性 ．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．
4・6・1 抗体依存性補体媒介性細胞傷害（CDC）活性 ．．．．．．．．．．．．
4・6・2 抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）活性 ．．．．．．．．．．．
4−7 CCR5指向性臨床分離ウイルスに対する中和活性 ．．．．．．．．．．．
4・7−1 ：コレセプター指向性の異なるウイルスに対する効果 ．．．．．．．
4・7・2 CCR5指向性臨床分離ウイルスに対する効果．．．．．．．．．．．．．．
48 48 53 53 56 56 57 58 60 60 60 63 63 64 66 66 69
第5章 5−1 5−2 5−3
KD・247のin vivoにおける有効性評価．．．．．．．。．．．．．．．．．．．．．
KD・247投与サルへの病原性キメラウイルス接種．．．．．．．．．．．．
KJ）・247血中濃度の測定．．，．＿．．．．．．．．．．．＿．．．．．．．．．．．．．
血漿中ウイルス量の変化 ．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．
70 70 71 72
韮
5・4 ウェスタンプロッティングによる感染の確認 ．．．．．．．．．．．．．．． 72
5−5 フローサイトメトリーによる細胞表面抗原及び細胞数の解析．． 73
第6章 総括 80
参考文献．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 84
謝辞．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 90
iii
第1章 緒論
ヒト免疫不全ウイルス（且IV：Human lmmunodeficiency Virus）は、後天性 免疫不全症候群（AIDS：Acquired lmmunodeficiency Syndrome）の原因ウイル スである。HIV感染症の治療法として、現在では、核酸系逆転写阻害剤、非核 酸系逆転写阻害剤、及びプロテアーゼ阻害剤を用いた多剤併用療法（HAART：
Highly Active Antiretroviral Therapy）が標準的な治療法となり、AIDSによ る死亡者数とAIDS関連日和見感染症の頻度は著しく減少した。その一方で、
化学合成薬であるこれらの既存薬は生体内での半減期が短いため、1日に数回の 服用が必要であり、また、乳酸アシドーシス、脂肪肝、血糖値上昇、糖尿病、
体脂肪分布異常、高脂血症など多様な副作用も現れるため、患者への負担が大 きく、長期にわたり服薬を継続することが困難になっている1）。また、これらの 薬剤に対する耐性ウイルスの出現が見られるようになり、作用機序や用法の異 なる薬剤の開発が望まれている。
HIVに対する新たな治療法へのアプローチとして、 H：IVの感染を阻止する中 和モノクローナル抗体を用いる受動免疫療法が考えられる。モノクローナル抗 体は、抗血清を精製して得られるポリクローナル抗体と比較し、抗原に対し高 い特異性及び親和性を有する均質な抗体であり、恒常的に生産することが可能 である。遺伝子量換え技術や細胞培養技術の発達により大量のモノクローナル 抗体が生産可能となり、工業的に製造されるようになった。モノクロV・一・bナル抗 体の応用は、研究用試薬や臨床検査試薬のみならず、動物2）やヒト3・4）の医薬品
にまで広がり、その有用性が示されている。
従来作製されてきた多くのモノクローナル抗体は、抗原で免疫されたマウス の脾細胞とマウスミエローマ培養細胞を細胞融合して得られたハイブリドーマ
1
により産生されたものである。マウスで作製されたモノクローナル抗体を医薬 品として用いることは、安全性及び有効性の観点から問題を生じる可能性があ る。特に、がんやエイズなどの慢性疾患の治療にモノクローナル抗体製剤を反 復投与して用いる場合、マウスモノクローナル抗体が異種動物由来のタンパク 質であるため、その抗原性によりアレルギー反応やアナフィラキシーショック などの副作用を引き起こしたり、抗イディオタイプ抗体が誘導されることによ り薬理作用が中和される可能性がある。これらの問題を解決するため、タンパ ク質工学及び遺伝子工学技術を用いて、マウス抗体を、その抗原結合活性を保 持したまま、ヒト抗体に近づける手法が確立されてきた6・7）。
1987年、熊本大学の松下らは、HIVの実験室分離ウイルス株である
HTLV・IIIBに対する中和マウスモノクローナル抗体0．5βを作製し、ヒト免疫不 全ウイルス1孕（HIV・・1）の主要中和決定基（PND：Principal Neutralizing Determinant）が外被糖タンパク質gp 120の3番目の可変領域（V3）に位置す
ることを明らかにした5）。
同年、我々は、熊本大学との共同で、この0．5β中和マウスモノクローナル抗 体を臨床に応用するため、遺伝子工学技術を用いてヒト型化し、マウス・ヒト IgG 1キメラ抗体Cβ1を作製した8・9）。チンパンジーにおけるCβ1のHIV・1感 染防御実験により、ウイルス接種の前後いずれの投与によっても、Cβ1が HTLV・IIIBの感染を阻止することが示された10）。これらの結果から、抗V3中
和モノクロ・一・・ナル抗体による受動免疫療法の可能性が期待された。
一方、1989年より熊本大学及び国立予防衛生研究所（現国立感染症研究所）
との共同で、日本において流行しているH：IV・1のV3・PNDのアミノ酸配列を解 析した11）。その結果、H：TLV・IIIBと一致する配列は確認されず、：HrV＝・1MN株
2
と相同性の高い配列が多く認められた。また、V3・PNDの中央部分に位置する 配列は、患者間で良く保存されていた。このため我々は、HIV・1 MN型の中和 モノクローナル抗体の作製に着手し、H：IV・1 MN型特異的モノクロ置旧ナル抗体
μ5．5を作製した12）。1989年、英国のMedica1 Research Councilより、最新の ヒト化抗体作製法であるリシェイピング技術を導入し13）、ヒト化μ5．5（Rμ5．5）
を作製した14）。Rμ5．5は、 SCID・huマウスを用いた実験で、 HIV・1臨床分離株 の感染を防御した15）。
しかし、日本の多くの臨床分離株をRμ5．5のみで中和することは困難であっ たため、我々はさらにスペクトルの広い中和抗体の獲i得をめざし、研究を続け た。1992年、複数のV3・PND由来合成ペプチドをマウスへ順次免疫する連続免 疫法を開発し、ついに、HIV・1サブタイプBを幅広く中和するモノクローナル 抗体C25を確立するに至った。 C25は、 Rμ5．5と同様の方法によってヒト化さ れ、RC25と命名された16）。
RC25の性状解析の結果、等電点が比較的高い（9．0±0．4）ことが示され、ヒ トでの安全性を確保するため、検討の必要性が生じた。RC25の動物を用いた安 全性の検討において、カニクイザルへRC25を投与することにより、溶血性貧 血の症状が観察され、この原因は高い等電点にあると考えられた。この問題点
を改良するため、1993年、RC25の抗原結合活性を保持したまま等電点を低下 させることを目的に、RC25改変体の作製に着手した17）。 RC25抗体の可変部遺 伝子を改変し、10種類のRC25改変体を作製した。これらの抗体について、抗 原結合活性、HIV・1中和活性、及び動物を用いた副作用の検討により、有効性
と安全性が最も期待されたRC25改変体（抗体全体の89．2％がヒト抗体由来の アミノ酸残基から成る）を、KD・247と命名し、1996年より臨床応用へ向けて
3
の研究を進めている。
本学位論文では、第1章の緒論に続き、下記の各章でKD・247の作製及び薬 効評価につき詳細に述べる。
第2章 マウス抗HIVモノクローナル抗体の作製と性状解析
第3章 遺伝子工学技術を用いたヒト化C25抗体（KD・247）の作製
第4章 KD・247のin vitroにおける有効性評価
第5章 iKD・247の血加。における有効性評価
第6章では総括として、各章で得られた知見をまとめ、考察を加えた。
4
第2章 マウス抗HIVモノクローナル抗体の作製と性状解析38）39）
2・1 HIV・1主要中和領域の解析とマウスへの免疫抗原の選定
HIV・1感染者から採血した末梢血単核細胞（PBMC）よりDNAを調製 し、PCR（核酸増幅）法を用いて、 HIV・1の外被糖タンパク質gp 120の第 3可変領域V3に相当する部位の遺伝子を増幅した。プライマーにはV3 領域の両側に位置する保存領域より選択した以下の配列を用いた。
A： 5 primer （5 ）TGTACACATGGAATTAGGCCAG（3 ） C： 3 primer （3 ）GGAGTCCTCCCCTGGGTC 1 TTA（5 ）
この増幅したV3・DNAを大腸菌のpU：EX1ベクター（シークエンス並び に発現ベクター）に組み込み、V3領域の塩基配列をチェーンターミネータ 一法により解析した。また、V3・DNAを発現させ、結合性試験に用いた。
29名の日本人感染者由来HIV・1分離株におけるV3領域の塩基配列よ り推定したアミノ酸配列を、表1に示す11）。主要中和決定基（PND）とし て知られているV3領域中央部分の配列に注目すると、多くのウイルス株 でGPGRという配列が良く保存されていることがわかった。
これらの結果より、このGPGR共通配列を認識するモノクローナル抗 体を作製すれば、多くのHIV・1変異ウイルスを中和し、抗体の臨床応用が 可能となると考えた。しかし、GPGRペプチドのみの免疫では抗原性が低 く、目的の抗体はできない。また、特定ウイルスのV3・PND領域のペプチ ド抗原を用いて免疫を行った場合、GPGRよりも長い配列を認識する株特 異的な抗体が誘導される可能性が高い。そこで、共通配列としてGPGRを 含み、その両側の配列が異なる、複数のウイルス株由来のV3・PNDペプチ ド、及びGPGRA：F配列を3回繰り返した配列を有するペプチドを合成し、
免疫用抗原に用いた（図1ω）16）。
5
表1 日本人感染者由来H：IV−1分離ウイルスのV3領域アミノ酸配列
分離株名 V3領域アミノ酸配列
且丁：LV一皿MN CTRPNYNKRKR 工HI GPG FYTTKN工工GT工RQAHC
TM−10 一 一 一 一 一 一 一 一 印 口 禰 幽 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 ＿
TM−16 噌 一 聯 鱒 藺 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 幽 一 日 脚 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一
N工一54 一一一一一m−IK一一工一一一 一 一 一 一 一一一一一f．E一一ム1一一一一一一
N工一17 一一一一一m−T一一S 一一一 一 一 禰 轍 一一一一一fD一一一D一一・一一一一
KM−01 一一一一rN−T一一S 一一一 一 闇 一 一 一一一一一fD一一一D一一・一一一一
KM−02 一一一一一m−T一一一 一S一 一 一 一 顧 一一一一一qQ一一一D一一A一一一 N工一〇9 一一一一一m−T一一S −P一 疇 幽 一 一 一一一一一fE一一一N一一一一一一
N工一23A 一一一一一m−T一一S −P一 一 一 一 一 一一一一一fE一一一N一一一一一一
N工一23B 一一一一一m−T一一G −R一 一 一 一 一 一V−A−GK−T−D一一一一一一 N工一42 一一一一一m−T一一S −P一 一 一 一 日 一一一一一fD一一一D一一K一一一 N工一26 一一一一一nN−T一一S −P一 一 一 一 闇 一一一一一fD一一一D一一K一一一 N工一63 一一一一一m−T−RG −R一 隔 一 旧 一 一一一̀−DK一一一D一一一一一一
N工一61A 一一一一一m−T一一G −R一 一 一 一 一 ▽一A−G王く一一一N一一一一一一
N工一61B 一一一一一m−T一一G −R一 一 一 一 一V−A−GK一一一D一一一一一一
TM−11 一一一一一m−T一一S −X一 一 一 一 一 一：L−A−GD一一一D一一一一一一
TM−20 ・一一一一rN−T一一G 一一一 一 一 一 一 一VF一一EK一一一D一一R一一一 N工一29 ． 一一一一一N−T一一S 一一一 一 一 一 一 ・一l一一一GE一一一N一一一一一一
KM−03 一一一一一m−T一一G −R一 一 一 一 一 一V−A−EK一一一D一一一一一一 N工一60 一一一一一一m−T一一G 一一一 一 一 馴 脚 一一̀−GD一一一D一一一一一一 N工一工8 一一一一一m−T一一一 一TT 一 一 一 一 Y・一一一・GE−V−DV−K一一一
N工一12 一一一一一m−TK−A−RV 一 一 日 一 TL−A−RR・一一一D一一一一一一 N工一53 一一一一一m−TK−A−RV 一 一 一 一 T：L−A−RR一一一D一一一一一一 N工一〇4 一一一一fN−T一一G 一一M 欄 囎 一 一 TL−A−GE一一一D一一一一一一 N工一66 一一一一一mYTERK −T：L 一 一 一 一 ：L一一一G王く一一一D一一R一一一
N工一27 一一一一一m−T一一G 一一M 一一一f一一一一一GK−T−D一一一一一一
TM−01 一一一一一m−T一一S −PM 一一一j一工一一一GE一一一D一一一一一一 丁凹一17 一一一一一嚠鼈鼈鼈黷f −TK 一一一jV工一A−GQ一一一D一一K一一一 N工一31 一一一一一m−T一一G 一一M 一W一一一一一A−GA一一一D一一一一一一
N工一1：L 一一一一rMKT一一G 一一L 一四K−TM−A−GE一王く一D一一一一一一
N工一24 一一一一一g−T一一S 一RMZ−W一一一L−A−RS−T−D一一一一一一
N工一36A 一一一一一m−T一一S 一RMZ−W一一一L−A−GS−R−D一一一一一一
N工一36B 一一一一一m−TK−S 一RMZ−W一一一V−A−KS−M−D一一一一一一
6
冨
l Immunization with synthetic peptides
e
（A）合成ペプチド免疫スケジュール
． Dose Strain Peptide
Day Adゴuvant
narne d ｛ g） derived
Araino acid sequence
splenocyte ＋鐙
P3×63Ag8 U 1 （P3Ul）， Cell fusion
SPI SP17 SPII SP14 SP12 SP13
0 7 14 21 28 35
ECA
工FA 工EA 工FA 工FA
100 100 100 100 100 100
甑
N：18
NI54 RE NI53
YNKRKR工H工GPGRAFYTTKNC
N−T一一一一一TT一一一一VY一一一GEC N−T一一G−RV一一一一一・一1−A−EKC N−T一一S−TK一一一一一V工一A−GQC N−TK一一A−RV一一一一TL−A−RRC
GPGRAEGPGRAEGPGRAEC Cloning
★ FCA＝Freund cornplete adゴuvant！IEA：Freund incornpiete adゴuvant
bridoma C2
Extraction of total RNA
Purification using a poly（A） Quick Kit
mRNA
，
／ Preperation of single chain cDNA from the mRNA
cDNA@ （B）PCR用のプライマー
Name Nucleic acid
M肌4ve凱4 50一質CG航G㎝GCCGCCACCATGG舶TGGAG㏄GGGT（㎜
MH：Cve黒1 5 一GGATCCCGGGAGTGGATAGACCGATG
MκL7veエ2 5曾一ACTAGTCGACATGGGCATCAAGATGGAGTCACAGATTCTGG MκCveユ1 51．GGATCCCGGGTGGATGGTGGGAAGATG
PCR ： PCR ：
MH：Lve二4 MκL7ve払2
MHCve二1 MκCve濫1
ph丘ed gene fヒagment（H chain） Amphfied gene丘agment （L ch
．Ampr
Ligeltion
pV］HC25LC
pUC 18 Hinc II digestion
Ampli丘ed gene fragment （H chain）
Arnpr
Ligation
pV rc C25LC
Amplified gene fragment （L chain）
Determination of base sequence by dideoxy method
VHC25 VLC25
図1マウス抗HIVモノクローナル抗体産生ノ・イブリドーマの作製と抗体遺伝子の同定
7
2・2 マウス抗HIVモノクローナル抗体C25の作製
前述のV3・PNDペプチドを、免疫用担体のキーホ「ルリムペットヘモシ アニン（KLH：）と結合させ免疫用抗原とした。免疫用マウスは、4週齢の C3且1H：eNマウスを使用した。免疫感作は図1（A）に示すスケジュールに従 い、腹腔内経路で5回接種した後、静脈経路で1回接種した。最終免疫の 3日後に免疫マウスから採取した脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞 p3×63Ag8・U1 （P3U 1）とをポリエチレングリコール法で細胞融合させ、
限界希釈法によりハイブリドーマをクローニングした16）
ハイブリドーマのスクリーニングは、培養上清中に産生された抗体の抗 原ペプチドとの結合活性、及びHIV・ 1に対するウイルス中和活性を指標に
行った。
培養上清中の抗体の結合活性は、酵素免疫測定法（E：LISA）により確認 した。すなiPち、96穴ELISA用プレートに抗原ペプチドを吸着により固
相化し、洗浄及びウシ血清アルブミンによるブロッキング後、培養上清と 反応させた。これに、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体を反応させ、
酵素基質を用いて発色・検出を行った。
ウイルス中和活性の測定は培養T細胞株であるMT・4細胞を用いて実施 した。すなわち、ハイブリドーマの培養上清を培地を用いて段階希釈し、
実験室株であるHIVlMNウイルスと37℃で1時間反応させた後、 MT4 細胞に接種した。数日後、H：IV・1感染により生じる合胞体形成を顕微鏡で
観察することにより、中和活性を求めた。
図1ωのスケジュールで免疫したマウスの血清について、抗原ペプチド との結合活性を調べた。図2Aに示すように、免疫に用いた複数のV3・PND
ペプチドと強く結合するマウス血清が確認された。このマウスの血清は
8
GPGRA：Fの繰り返し配列であるSP13ペプチドにも強く結合しており、目 的とする抗GPGR抗体が誘導されていることが示唆された。
このマウスの脾細胞を用いて作製したハイブリドーマより、免疫に用い た複数のV3−PNDペプチドと強く反応し、かつGPGRAFの繰り返し配列 であるSP・13ペプチドとも反応するクローンを選択した。この中から、
HIV・ IMNをはじめ多くの分離ウイルスを中和するクローンを選択し、こ の細胞が産生するモノクローナル抗体をC25と命名した。
2・3 C25抗体の性状解析
このようにして確立したC25抗体の結合活性および中和活性について、
性状解析を行った。16）
まず、免疫したV3・PNDペプチドとの結合性について調べた。図2Bに 示すように、C25抗体は免疫した全てのV3・PNDペプチドと幅広く反応し た。特に、GPGRA：Fの繰り返し配列であるSP 13とも強い結合活性を有し ており、C25抗体は多くのウイルス間で保存されているGPGRを含む配列
を認識している可能性が示唆された。
次に、C25抗体の種々の実験室株および臨床分離ウイルスに対する申和 活性について測定した。HIV・MNをはじめとする実験室株に対する中和活 性の測定は培養丁細胞株であるMT・4細胞を用いて実施した。すなわち、
C25抗体を培地を用いて段階希釈し、実験室株と37℃で1時間反応させた 後、MT4細胞に接種した。数日後、 HIV・1感染により生じる合胞体形成を 顕微鏡で観察することにより、中和活性（IC90）を求めた。また、8種類の臨 床分離ウイルスに対する中和活性を末梢血単核細胞（PBMC）を用いて測 定した。すなわち、CD8陽性細胞を除去した健康な人の末梢血単核細胞
9
（PBMC）をフィトヘマグルチニン（PHA）で刺激後、 IL・2存在下でHIV・ 1 感染者の血漿と混合培養を行い、その培養上清より臨床分離ウイルスを得
た。培養液を用いて希釈したC25抗体に臨床分離株ウイルス液を加え、37℃
で1時間中和反応を行った後、上述の方法で得た健康な提供者より採取し たPBMCに接種した。1日間培養後ウイルス液を洗浄し、更に3〜5日間
培養した上清中のH：IV・1 p 24抗原を定量して感染性の強さを判定し、中和 活性を求めた。p24抗原量は、且IV抗原検出キット及びp24抗原定量パネ ル（ダイナボット社製）を用いて測定した。その結果を表2に示す。C25 抗体はHIV−1MN株をはじめとする多くの実験室株を強く中和し、8種の 臨床分離ウイルスに対しても幅広く中和する抗体であることが示された。
さらに、国内に広がっている臨床ウイルスに対するC25抗体の反応性を 調べる目的で、日本人感染者に由来するV3発現タンパクを用いて、 C25 抗体との反応夕1生を調べた。その結果を表3に示した。C25抗体は31種の感 染者由来V3発現タンパクのうち、 GPGR配列が保存されている22種の V3発現タンパクと強く結合し、約7割の反応性を示した。一方、型特異的 抗体であるμ5．5抗体は3割の反応性しか示さなかった。
以上の結果より、C25抗体はV3・PND領域内の多くのウイルス間で保存 されているGPGRを含む配列を認識しており（4・1．ヒト化C25抗体KD・247 のエピトープ解析参照）、国内に広がっている種々のHIV・1変異株と幅広く 結合し、これらを中和することのできる臨床応用可能な抗体の性状を有し ていることが示唆された。
10
OLt，
吝
。 3
2
1
o
A
s3 s4 ss
Serum
s6 s7
dilution
s8
5
4
0 3
ゆ寸
aO 2
1
o
B
O．OOOI O．OOI O．Ol O．1 1
C25 concentration （mg／ml）
10 100
Peptide Amino acid sequence
e spl O SP17 A SP14A SP 一 SP12 口 SP13
0 SP9 SP6
× SPIO
YNKRKR l H l GPGMFYTTKNC N一・T一一一TT一一一VY−GE−
N一一一T一一G−RV一一・一・一 1 一A−EK−
N−T−S一一TK一一一一V 1 一A−GQ一一 N一一TK−A−RV一一TL−A−RR−
GPGRAFGPGRAFGPGRAFC
N一丁一一G−R一一一V−A−GK−
N−T−S−P・一一一一一一一一GE−
N−T−RG−R一一一一一一A−DK一
図2免疫マウス血清及びC25のペプチドに対する結合性
11
表2 C25抗体のHIV−1分離ウイルスに対する中和活性
Target H lv−l
Cells lsdate HIV−1 V3−PND sequence 中和活性
ICpo （pglin1）
beT−4 H工V−MN H工V一皿B
N154 N161 DBA3
N工63 N工53
！1！M2
CTR l？NYNKRKR工H工 GPGRAE YTTKN工工GT工RΩAHC
・一一一一・一m−T一一一KS−9R一一一一一・一V−rGK一 一NM一一一一一
一一一一一m一工K一一 一 一一 一一一 一一GE一一一N一階一一一一
一・一一一一m−T−ny−G−R一・ ・一一一一一・V・一A−GK一一一D一一・一一・一一一
一一一一ny−m−T一一G−R一 一一一一一V−A−EK一一一D一一一一一一・一
一一一一一m−T−RG−R一 一一一一一・一一A−GK一一一D一一一一一一
一一一一一一m−T一一A−RV 一一一一一TL−A−RR一一一D一一一一一一 一一一D一NKA−G−LSV 一一一一・一S一一一一RQ−T−D一・一一一一一
2．0
＞500 1．0 3．9 3．9 0．5 31．2
3・． 9
PBMC JIR−CSF JR−M
CS3−5 CS6−8 JC工一3 JC工一9 JC工一11 JC工一22
・一一一一rN−K一一S一一一
一一一一・一m−T一・一S一一一
一一一 H・一N−T一一一S一一一
一工一一N−T 一 G一一一
一一一一一m−r一一H一一一
一一 一一 一一一一 一一一 11一一G一 一・ 一
一一一一一・一・一一sS一一G−R一 一一一一一m一工一一H一一一
一一一一一一一一一GE一一一一D一一一一・一一一一
一一一一一・・一一一一fE一一一D一一一一一一
一一一一一一一一̀−GE一一．N−K一一一一
一一一一一・一d−̀−D一一一一一一N一一・一一一一
一・一一一一一一・一一qG 一RD一一K一一一・一
一一一一一一一u一一一一G 一RD一一一一K一一一
一一一一一一一・̀SER 一RD一一K一一一一 一一一一一一一一一qG 一RD一一一K一・一一
5．0 8．0 10．0
8．0 10．0 21．0 34．0 12．0
．x
The HIV」1 sequences were co血med by proviral DNA sequencing of Virus・infbcted cells． Dashes indicate sequence homology to HIV 1 MN．
12
表3 C25抗体の国内HIV−1感染者由来V3発現タンパクとの反応性
分離株名 ヨエV−MN lM−10
M−16
N工一54 N工一17 Klyr−01 KbE−02
Nコ：一〇9
N工一23A N工一23B N工一42 N工一26 N工一63 N工一61A
M−11
1Md−20 N工一29
1myr−03
N工一60 N工一18 N工一12 N工一53 N工一〇4
N工一66 N工一27
！CM−01 口M−17 N工一31 N工一11 N工一24 N工一36A
V3領域アミノ酸配列 C25 5．5
CTRPNYNKRKR 工H工 GPGRAFYTTKNエエGT工RΩ胆C
一一一一一一一一一一幽 一一一 一一脚一一一一一一一一一一一一一一一一一一
一一一一一m一工K一一工一一一 一一囎一一一一一一G．E一一N一一一一一一
一一一一一・一一m−T一一S 一一・一 一一一一一一一・一一GD一一一D一・一一一一一一一一
一一一一rN−T一一S 一一一 一一扁一一一一一一GD一一一D一一一一一一 一一一一一m−T一一一 一S一 一一一一一一・一一・一・一R9一・一一D一一一A一一一
一一一一一・一m−T一一一S 一P一 一・一一一一一一一一GE一一一N一一一一一一一
一一一一一一m−T一・一S 一P一 一一一一・・一一一一一一GE一一一一N一一一・一一一
圏一一一一m−T一一G−R一 一一一一V−A−GK−T−D一一一一一一
一一一一一m−T一一S −P一 一嗣囎一一一一一一GD一一一D一一K一一一 幽一一一一m−T一一S−P一 一一剛一一一一一一GD一一一D一一K幽一一 一一一ロー m−T−RG−R一 一…一一一一一一・A−DK一■・一一D一一一一・一一 一一一一一m−T一一G 一R一 一一一一一V−A−GK一一一一N一一・一一一一 一一t一一一m−T一一S 一X一 一一一一・一L−A−GD一一・一D一一一一d一一
一一・一一rN−T一一G 一一一 一・一一一一VE 一一EK一一一D一一R一一一
廟一一一一m−T一一S 一一一 一一一一一W一一一GE一一一N一一一一一一
一一 一 一m−T一 一G 一R一 一一一一一V−A−EK−e 一D 一一一一一・
國一一一一m−T一一G 一一一 一一一一V一一A−GD一一一D一一一一一一
一一・一一・一m−T一・一一 一TT 一一一・一VY一一一一GE一・V・一DV−K・一一一
一一 一一m−TK A 一RV 一一q rZ−A−RR一一 D一一一一一一一 一一一一一m−TK−A 一RV 一 一TL−A−li（R−e−D一一一一一一 一一一一fN−T一一G 一一M 一一一一TL−A−GE一一一D一一一一鯛一 一一一一一mYTERIK一一TL 一一一一V工」一一一GK一一一D・一一R一薗一
一一d一一一m−T一一一G 一一M ・一一一G一一一一一一GK−T−D一一一一一一一 一一一一一m−T一一S −PM 一一一K一一一一一GE一一一D一一一一 一
一一一一一嚠鼈鼈鼈黷f−TK一一一KV一一A−GΩ一一一D一一K一一幽
一一一一一m−M一一G一一M−W一一一一一A−GA一一一D一一一一陶一
d一一一一一rIYIIKT一一G 一一一L 一WK一1I M−A−GE−K−D一一一一d一一一
一一一一一一m−M一・一S 一RMZ−W一一一L−A−RS−M−D一一・一一一一
一一一一一m−T一一S −RMZ−W・ 一 ・ L−A−GS−R−D一一一一一爾
十 十 十 十 十 十 十 十 十 十 十 十 十 十 十 十 十 十 十 十 十 十
十 十 十 十 十 十
十
十
十
22／31 9／31
710／o 290／o
13
第3章 遺伝子工学技術を用いたヒト化C25抗体（KD・247）の作製38）39）
3・1 構造遺伝子の構築 3・1・1 C25抗体遺伝子の同定
マウス抗且IVモノクローナル抗体（C25）を産生しているハイブリドー マからmRNAを調製し、それをもとに、1本鎖cDNAを合成した。この1 本鎖cDNAを鋳型に、図1のプライマーを用いてPCRを行った。得られ た増幅遺伝子断片を制限酵素 Hinc IIで消化したpUC18ベクターに組込み、
ジデオキシ法によりC25のVH遺伝子（VH：C25）、及びVL遺伝子（VLC25）
の塩基配列を決定した。その結果を、図3及び4に示す。
3・1・2 ヒト化VH：遺伝子の合成．
上記で得られたVHC25の塩基配列より、予想されるアミノ酸配列を求 めた（図3）．。このVHC25を、その且IV結合性を保持したままヒト化す るために、VHC25の相補性決定領域（CDR）と、コンビュー手口モデリ ングで決定した一部のフレームワーク領域（FR）のアミノ酸を、ヒト抗体 （SGI）のVH：領域に移植し、ヒト化V且C25のアミノ酸配列を設計した （図5）。このアミノ酸配列を発現しうる遺伝子を得るために、SGIを基本 骨格とするRVHμ5．5及びRVH：0．5βを有するプラスミド（pRHμ5．518）
及びpRHO．5β13））の遺伝子を鋳型に、図6−1及び6・2のプライマーを用 いてPCR変異導入法によりRV且C25を合成した。以下にその操作方法を
述べる。
pRH：μ5．5を鋳型にプライマー＃1と＃2を用いてRVHC25遺伝子の5 側をPCR増幅し、 pVR且0．5βを鋳型にプライマー＃3と＃4を用いて RVHC25遺伝子の3 側をPCR増幅した。次に、これらの遺伝子増幅断片
14
の混合物を鋳…型にプライマー＃1と＃4を用いてPCR増幅を行い、2っの遺 伝子断片を結合させた。この遺伝子断片をKpn l・Me lで消化し、 pR且μ 5．5のKpn I・M5e I部位にクローーニングして塩基配列を確認し、pRVHC25 を得た（図7）。
3・1・3 ヒト化vr遺伝子の合成
RVHC25と同様に、得られたV：LC25のアミノ酸配列（図5）のCDR
と、コンピュターモデリングで決定した一部の：FRのアミノ酸を、ヒト抗 体（REI）のVL領域に移植し、ヒト化VLC25（RV：LC25 Ver．1）のアミ ノ酸を設計した（図5）。このアミノ酸配列を発現しうる遺伝子を得るため に、REIを基本骨格としたRV：Lμ5．5遺伝子を有するpHCMVd・RV：Lμ 5．5・Cκを鋳型に、図8のプライマーを用いてPCR変異導入法により RVLC25 Ver．1を合成した（図9）。本遺伝子産物は等電点が比較的高く、
これを改良するため、ヒト化VL遺伝子pRV：LC25 Ver． 1を鋳型に、図10 のプライマーを用いたPCR変異導入法によって、主として中性アミノ酸 を酸性アミノ酸に置換したヒト化VL遺伝子p：R；VLC25 ver．1Bを合成した （図11）。これにより、9以上であった等電点が約8に改良された17）。以 下にその操作方法を述べる。
まず、pHCMVd・ RVL pt 5．5・Cκを鋳型にプライマーneo Aとプライマー ＃5を用いてRV：LC25遺伝子の5 側をPCR増幅し、 PCR産物をHind III で消化してpUC8のHind III・」田力。 II部位にクローニングし、pfHを得た。
次にプライマー＃8とプライマーintron hCκVer．2を用いてRVLC25遺伝 子の3 側をPCR増幅し、そのPCR産物をKpn l・BamH：1で消化してpfH
のKpn 1・」Bani且1部位にクローニングし、 pf：HBを得た。このプラスミド
15
の塩基配列を確認したところKpn I部位の5 側にPCRエラーと思われる 変異配列を見つけた。そこでプライマーneo Aとプライマー＃5による5 側PCR産物をHind III・Kpn Iで消化し、 pfH：BのHind III・Kpn 1部位に
挿入して再度塩基配列確認を行い、pfHBIIを得た。最後に、合成DNA＃6 と＃7をそれぞれT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて3 末端をリン酸化 し、さらに両合成DNAを等量混合しアニーリングさせてpUC18のKpn I 部位にクローニングし、塩基配列を確認してpfKを得た。このプラスミド
より、Kpn I遺伝子断片を切出し、p鉦IBIIのKpn I部位にクローニングし、
挿入方向を確認してpRVLC25 Ver． 1を得た（図9）。
次に、pRVLC25 V砿1を鋳型とし、 M 13プライマーM4とプライマー一
＃14で遺伝子の5 側領域を増幅し（FO 1）、プライマー＃13とプライマー＃16 及びプライマー＃15とプライマー一＃18で中央部分を増幅し（それぞれFO3 及び：FO2）、．プライマー＃17とM13プライマーRVで3 側領域を増幅した
（FO4）。次に、鋳型として：FO2、 FO3及びFO4断片を混合し、プライマー
＃13及びプライマーM13RVを用いてPCRを行った。増幅された：FO234
断片をStu 1・BamH 1で、 FO1断片をHind III・Stu lでそれぞれ消化し、
両消化断片をT4 DNAリガーゼで連結した。このようにして得られた
：FO1234断片を制限酵素flind III及びBamH Iで再度消化し、 pUC18の Hind III・BamH I部位に導入し、その塩基配列を確認することによって最 終的にpRV：LC25 ver． IBを構築した（図11）。
16
Primer MH工J4ver。4今5 一一ttcgaagcttgccgccacc AAGCTTGCCGCCACC
atggaatggagctgggtcttt
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTATCTTTCTCCTGTCAGTAACTGCAGGT fTCCACTCCCAG
MEWSWVF工FLLSVTAGVHSQ
FRI
GTCCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGG！［tAAGGCCTGGGACTTCAGTGAAGATGTTC V Q L Q Q S G A E L V R P G T S V K M F
FRI 1 CDRI 1 FR2
TGCAAGGCTGCTGGATACACCTTCACTAACTCCTGGATAGGTTGGTTTAGGCAGAGGCCT
CKAAGYTETNSW工GWFRQRP
l cDR2
GGZICATGGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTTACCCTGGAGGTGGTTATACTAACTACAAT
GHGLEW工GDIYPGGGYTNYN
、A。A＿C血GGGC払GGCCA，All二A。。GCAGACA，A＿CCAGCA，AGCCTA。ATG
E工FKGKATLTADTSSSTAYM
l
CAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCIGCCATCTATTACTGTTCAAGGGGGATACCG
ΩLSSLTSEDSAIYYCSRG工P
cDR3 GGATATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACA
GYAMDYWGQGTSV−T VSSAKT
Cy 2a
gtagccagataggtgagggccctagg−5 〈一 Primet MHCver．1
ACAGCCCCATCGGTCTATCCACTCCCGGGATCC
TAP．SVYP工、P
図3VHC25のDNA配列及び予測されるアミノ酸配列
17
60
120
180
240
300
360
420
Primer MKL7ver．2一〉 5 一actagtcgac ACTAGTCGAC
I Leader
atgggcatcaagatggagtcacagattctgg
ATGGGCATCAAGATGGAGTCACAGATTCTGGTCCTCATGTCCCTGCTGTTCTGGGTATCT 60
MG工KMESΩ工LVLMSLLFWVS
l FRI
GGTACCTGTGGGGACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGA 120 G T C G D 1 V M T Q S P S S L T V T A G
I cDRI
GAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAGATCAAAAG 180
EKVTMSCKSSQSLLNSGDQK
l FR2 1
AACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTATTGG 240
NYI、TWYΩΩKPGQPPKLL工YW
cDR2 1 FR3
GCATCCACTGGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGAAACAGAT 300 A S T G E S G V P D R F T G S G S E T D
ER3 1
TTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAAT 360
FTLT工SSVΩAEDLAvYYCQN
cDR3 1 FR4 l
GATTATAGTTATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAACGGGCTGAT 420
DYSYPWTFGGGTKLE工KRAD
c rc
gtagaagggtggtaggtgggccctagg−5 〈一 Prirner MKCver．1
GCTGCACCAACTGTATCCA，TCTTCCCACCATCCACCCGGGATCC
AAPTVS工FPPSTR
図4V：LC25のDNA配列及び予測されるアミノ酸配列
18
〈6
VH region SG工 RVHC25 VHC25
SG工
RVHC25 VHC25
VL region
RE工
RVLC25 ver．1 RVLC25 ver．IB VLC25
RE工
RVLC25 ver．1 RVLC25 ver．IB
VLC25
10 20 30 40 5C 60QVQLV QSGAE VKKPG ASVKV SCKAS GYTFS SHWMH WVRQA PGQGL EWVG E ENPSN GRTNY NEKFK S QVQLV QSGAE VKKPG AS▽KV SCKAS GYT屯［画咽RQA PGQG二E咽G DエYPGG GYTNY NEエFK G
QVQLQ QSGAE L▽RPG TSVKM FCKAA GYTFT NSWIG． WFRQR PGHG：［I EW工G D 工YPGG GYTNY NEIFK G
魑蟹固臨薗圏■ 岡闘■園圃臨薗圏■圏懇欝翻臨醤圃躍圃膿臨謹幽團薗圏謄
CDRI CDR2
70 80 90 100 110RVTM TLDTS TNTAY MELSS LRSED TAVYY CASR DYDY DGRYF DY WGQ GTLVT VSS 團rM咽DTS TNTAY MELSS LRSED TAVYY dヨSR 一一GエPGYAI）C DY WGQ GTLVT VSS KATL TADTS SSTAY MΩ：LSS ］」TSED SA工YY C−SR 一一G工 PGYAM DY WGQ GTS▽T VSS N
CDR3
10 20 30 40 50 60
D工QMT QSPSS LSASV GDRVT ITC R一 一一A一一 一SGN工 HNYLA WYQQK PGKAP KLL工Y YTTTL AD D工QMT QSPSS ：LSASV GDRVT圃C S S S］」L NSGD KNY：LT WYQQK PGKAP KL：L工Y ASTG ES
DエQMT QRPDS LSASV GDRVT瞬 SSSLL NSGD KNYLT WYQQK PGQpP KLLrY ASTG ES
D工VMT ΩSPSS ］LT▽TA GEKvT MSC KS SΩSLL NSGDΩ KNYLT WYΩQK PGΩPP K：［、L工Y WASTG ES
圃肥圃躍騒脳脳圏臨闘翻瞳圏囲躍圏騨腿圃聰騨脳謹鵬團 細臨鰯賜鰯圃㎜謝鶴
CDRI CDR2
70 80 90 100 110
GVP SRFSG SGSGT DFTFT 工SS：LQ PED工A TYYC． QHFWST PRT FG QGTKV E工K GVP SRFSG SGSGT DFTFT 工SSLΩPED工A TYYC QNDYSY PWT FG QGTK▽E工K GVP．DRFSG SGSGT DFTFT 工SSLΩPED工A TYYC QNDYSY PWT EGΩGTKV E工K GVP DRFTG SGSET DFTLT 工SSVQ AEI）LA VYYC QNDYSY PWT FG GGTK：L E工K m
CDR3
Box indicates transplant arnino acid residues frorn rnouse antibody
図5 ヒト化C25のアミノ酸配列の設計
HindM AAGCTTGCCGCC
一 Leader 十ERI
M D W T W R V E C L L A V A P G A H S Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V
ACCATGGACTGGACCTGGCGCGTGTTTTGCCTGCTCGCCGTGGCTCCTGGGGCCCACAGCCAGGTGCAACTAGTGCAGTCCGGCGCCGAAGTGAAGAAACCCGGTGCTTCCGTGAAGGTG
Nhe 工
一 CDRI一 FR2 一 CDR2
SCKASGYTFTEYTMHWVRQAPGΩGLEWIGG工NPNNGDTSY
AGCTGTAAAG．．CTAGCGGTTATACCTTCACTGAATACACCATGCATTGGGTTAGACAGGCCCCAGGCCAAGGGCTCGAGTGGATTGGCGGTATTAACCCTAACAATGGCGATACAAGCTAT
一一＝一一一一一一一一一一一一一一 ．A−C雪C雷TGG鴇＝AGG＝旨竃＝T＝＝＝＝呂雷壽鴇＝話冒富富 一一一一一一一一一 A −T＝＝＝＝＝GGAGG＝＝＝＝丁鴇耳置＝＝＝A＝＝嵩；
Primer ＃1＞ aaagctagcggttataccttcactaactcctggataggttggtttagacaggcccc ctcacctaaccgctataaatgggacctccaccgatatgtttgata
KASGYTFTNSW工GWFRQA EW工GD工YPGGGYTNY
No
Bgユ 工工
T Q K F K G K A T M T V D T S T N T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C A T P Y
ACCCAGAAGTTTAAGGGCAAGGCTACCATGACCGTAGACACCTCTACAAACACCGCCTACATGGAACTGTCCAGCCTGCGCTCCGAGGACACTGCAGTATACTACTGCGCCACACCCTAC
＝A＝G＝＝，＝＝TC＝＝＝＝＝＝＝＝
ttgctctagaaattccc−e Primer ＃2
N E 工 F K
Kpn 工 ． B∂mh 工
CDR3−ER4−
YAYAIDS 1）V GQGTLVTVSS
TACGCCTACGCTATTGACTCCTGGGGACAGGGTACCCTTGTCACCGTCAGTTCAGGTGAGTGGATCC
The letter lines show restriction enzyrne narne， description of antibody region， pRH 5．5 arnino acid sequence， pRH 5．5 base sequence，
prirnertand humanized C25 arnino acid sequence， in order frorn up to down．
図6・1 ヒト化C25抗体VH領域遺伝子構築のためのプライマー（1）
N一
一 Leader 一 FRI
Hind工工工
AAGCTTGCCGCC
M DW T W R V FC L L A V A PGA H S QV Q LV Q S G AE V K K PGASVKV
ACCATGGACTGGACCTGGCGCGTGTTTTGCCTGCTCGCCGTGGCTCCTGGGGCCCACAGCCAGGTGCAACTAGTGCAGTCCGGCGCCGAAGTGAAGAAACCCGGTGCTTCCGTGAAGGTG
Nhe 工
一 CDRI一 FR2一 CDR2
AGCTGTAAAGCTAGCGGTTATACCTTCACCACCTATCCAATAGAGTGGATGAAACAGAACCCAGGCCAAGGGCTCGAGTGGATAGGCAATTTCCACCCTTACAGTGACGATACAAATTATSCK：ASGYTFTTYP工EWMKΩNPGΩGLEW工GNFHPYSDDTNY＝＝ c＝＝ ＝ Primer ＃3・〉 aactat N Y
B9ユ 工臨
N E K E K G K A K L T V D T S T N T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C A 1 H Y
AACGAGAAATTTAAGGGCAAGGCTAAGCTGACCGTAGACACCTCTACAAACACCGCCTACATGGAACTGTCCAGCCTGCGCTCCGAGGACACTGCAGTCTACTACTGCGCCATACACTAC ：＝＝＝＝TC＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ ＝＝＝＝ ＝CAA＝＝＝ ＝＝＝C＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ ＝＝＝＝＝＝＝ ＝＝＝＝＝ T＝A＝GGGGGATA
aacgagatctttaagggcaaggctacaatgaccgcagacacctctac cagatgatgacgagttccccctat
NE工FKGKATMTADTS ▽YYCSRG工
Kpnエ Ba，mHエ
CDR3十 ER4 一
G S A Y A M D Y W G Q G T L V T V S S
GGTAGTGCCTACGCTATGGACTATTGGGGACAGGGTACCCTTGTCACCGTCAGTTCAGGTGAGTGGATCC
CCG一一一＝GA＝ ＝＝ ＝ ＝ ＝＝＝ ＝＝ ＝ ＝ ＝ ＝＝＝＝z ＝ ＝＝ ＝＝＝＝ ．，．，，＝，，，．，，．．．＝．，＝＝＝
ggc一一一cctatgcgatacctgataacccctgtcccatgggaaca（Prirner ＃4
P GYAMDYWGQGTL
The letter lines show restriction enzyme narne， description of antibody region， pRHO．5Bamino acid sequence， pRHO．5Bbase sequence，
prirner，and hurnanized C25 arttino acid sequence， in order from up to down．
図6・2 ヒト化C25抗体V且領域遺伝子構築のためのプライマー（2）
