RC25 L chain ver． IB
（6．9kb）Hind III
3・3 KD・247産生細胞の作製
pE：E．RC25 ver．7を制限酵素Sal Iで消化し、線状化した。この線状化した
プラスミド40μgを用い、107個の宿主NSO細胞をエレクトロポレーション
法にて形質転換した。形質転換後、96穴プレートに細胞を段階希釈して播種し、グルタミンの濃度を低下させた培地にて培養することで、発現プラスミ ドを取り込みGSを発現している形質転換細胞を選択した。この選択培地で 約1ヶ月間培養し、約100種の形質転換体を得た。このうち抗体産生量の高 い細胞株を選択し、GSの阻害剤であるL・メチオニンスルホキシミン（MSX）
を10μmo1！1含有する培地で培養を続けることで、遺伝子増幅による産生量 増強を計った。約4週間後、MSX耐性となり増殖した細胞株を抗体産生量を 指標に選択し、一つの株（A3・E10株）を得た。この株をさらに限界希釈法で
クローニングすることでA3・E101D2を得た。
このクローぞを約1ヶ月の期間で培地中の血清濃度を徐々に低下させる方 法にて無血清培地に順応化させた後、細胞を拡張培養し、マスターセルバン クNC−MCB・AO 1を作製した。このマスターセルバンクNC・MCB・AO1より
産生されるヒト化C25抗体を：K］D・247と命名した。
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3・4 構造遺伝子の塩基配列及び予想されるアミノ酸配列の解析
作製したマスターセルについて、構築通りの塩基配列が組み込まれている ことを確認するために、構造遺伝子の塩基配列を調べた。以下にその操作方
法を述べる。
マスターセルから抽出したmRNAを逆転写しcDNAを調製し、図16のプ
ライマーを用いたPCR法により、且鎖あるいは：L鎖の遺伝子を増幅した。各遺伝子とpUC19をHind IIIとBaniH 1により消化し、 pUC19に挿入し、
大腸菌への形質転換を行った。得られた形質転換体中に存在する挿入DNA
の塩基配列を解析した（図16）。その結果、構造遺伝子の塩基配列及び予想されるアミノ酸配列は、構築通りであることが確認された（図17・1及び17・2）。
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KD−247抗体産生細胞（MCB， PPC）
，
mRNAの抽出
，
cDNAの合成
H鎖全領域の増幅（PCR法）
i i
！
s
フ。ライマー：PEEl
HA8−Bam
DNA末端の制限酵素処理
制限酵素：Hlhd皿一BamH 1
（PEE1部位は欠落）
へ Nターへのクローニング ベクター：pUC19
大腸菌へのトランスフォーメーション（クローン化）
コンヒ。テントセル：E． colV HBIO1
テンプレートDNAの増幅（PCR法）
増幅用酵素；TaKaRa EX Taq
断片：＃1（RVE−hCγ1exon）＃2（HSI 一 HAI）
＃3（HS2 一 HA2）
＃4（HS3 一 HA8−Bam）
L鎖全領域の増幅（PCR法）
t
使用プライマー：PEEI LAI−BamDNA末端の制限酵素処理
！
制限酵素：1伽d皿一BamH I（PEE1部位は欠落）
へ Nターへのクローニング
！ es一：pucig
大腸菌へのトランスフォーメーション（クローン化）