468 156
CDR3 ER4 CK
W
oo GTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAA，CGCCCTCCAATCGGGTIMCTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCIUUt
GTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAIUtGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAA 624
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GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGIVtGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGC￠eGTCACAIIAGAGCTTCIVLCAGGGGAGAGTGTTAG 7 S OADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC tl 239
LAI−Bam
AGGGAGAAGTGCCCCCACCTGCTCCTCAGTTCCAGCCTGACCCCCTCCIATCCTTTGGCCTCTGACCCTGGATCC
AGGGAGAAGTGCCCCCACCTGCTCCTCAGTTCCAGCCTGACCCCCTCCATCCTTTGGCCTCTGACCCTGGATCC
Upper ： Designed base sequence
Middie ： Confirmed base sequence of structural gene Lower ： Predicted arnino acid sequence
図17・2 構造遺伝子の塩基配列および予想されるアミノ酸配列（L鎖）
3・5 セルバンクの安定性
3・5・1 継代時の安定性
マスターセルバンク（NC・MCB・AO 1）由来の細胞を、スピナーフラスコを 用いて継代培養し、細胞の増殖性及び抗H：IV抗体産生能の安定性について確
認した。
マスターセルバンク（MCB）を解凍し、125 mlスピナーフラスコに60 ml のスケールまで拡張した。この細胞を約4倍希釈継代で66日間にわたって維 持・継代し、その期間の増殖特性及び抗体産生能を評価した。培養は、無血 清培地を用い、125mlスピナーフラスコ60 m1培養を行った（37℃，5％CO
2，50rpm）。培養期間中は培養液を採取し、トリパンブルー染色法により 生細胞数を測定した。また、抗体産生能は、継代時の細胞を1×106cells！ml
となるよう培地に再懸濁し、24時間培養して培養上清を採取し、酵素免疫測 定法により抗H：IV抗体濃度を測定した。
66日間にわたり継代培養したところ、継代培養期間を通じて、細胞増殖能 及び抗体産生能は安定であった（図18）。
実施した66日間の継代は、約50世代に相当する。MCBから実製造の本 培養終了までの継代数の概算は25世代であることより、本MCBは実製造本
培養終了まで、増殖性、産生能のいずれにおいても安定であると考えられる。3・5・2 細胞の増殖性・抗体産生能
MCB由来の細胞と製造終了後の細胞（PPC）について、細胞の増殖性・
抗体産生能の比較を行い、製造条件下での安定性を調べた。
MCB（NC・MCBrAO1）及びPPC（Lot CC・008）を解凍後、75 cm 2のT
フラスコで1代継代し、125m1のスピナーフラスコに約2×105 cells／ml（培39
養量60ml）で播種して2代継代培養した（無血清培地，37℃，5％CO2，
50 rpm）。この細胞を125 mlスピナーフラスコに播種し（播種密度：約3×
105cells／m1，培養量：60 m1）、7日間培養を行った。培養期間中は毎日培養 液を採取し、トリパンブルー染色法により生細胞数を測定した。また、培養 上清中の抗HIV抗体濃度を酵素免疫測定法により測定した。
図19及び20に細胞数、単位細胞当りの抗体産生量をそれぞれ示す。増殖 性及び抗HIV抗体の産生能は、 MCBとPPCの間でほとんど差が無かった。
これらの結果から、MCB（NC−MCB・AO1）は製造期間にわたり安定的に目 的の抗体を産生することが可能なセルバンクであると言える。
3・5・3 発現タンパク質の確認
無血清培地で7日間培養後の、約0．2mglm1の抗体産生量を示す、 MCB
培養上清（NC：MCB・AOI）およびPPC培養上清（CC−008）に産生された抗 体の、抗ヒトIgG、抗KD・247イディオタイプ抗体または抗原ペプチド（SP1）に対する結合性を、ELISA法により確かめた。 E：LISA用のマイクロプレー トに、抗ヒトIgG、抗KD・247イディオタイプ抗体またはSP1を固相化し、
培地を用いて10％から2倍段階希釈したMCBまたはPPC培養上清と反応
させた。陽1生対照として、KD・247（0．2 mglml）を同様に希釈して用いた。
検出抗体として酵素標識抗ヒトIgG抗体を用い、基質の発色反応を吸光度
（450 nm）で示した。
図21に示す通り、MCB及びPPC培養上清の発現たん白質は、抗ヒトIgG、
抗KD・247イディオタイプ抗体またはSP1に対し同様の結合を示した。従っ て、培養期間にわたりMCBの産生する抗体は、免疫化学的に安定であり、
抗原との結合性も維持されていることが示された。
40
3・5・4 構造遺伝子の確認
MCB（NC・MCB・AO1）またはPPC（Lot CC・008）よりmRNAを抽出し、
cDNAを合成した。これを鋳型にPCR法で1｛鎖及びLI鎖全領域の増幅を行
い、ベクターに組み込んでクローニングした。H鎖を4断片に、 L鎖を2断片に分割してテンプレートDNAをPCR法で増幅し、各断片を用いてシーケ
ンスを行った。
各断片の増幅に用いたプライマーは、以下の通りであった（図22・1及び
22 2）o
H鎖断片 ＃1： RVE−hCγ1exon
＃2： HSI 一一 HAI ＃3： HS2 一 HA2 ＃4： HS3 一一 HA8 Bam
：L鎖断片 ＃5： REV−hCκexon
＃6 ： LSI 一 LAI Bam
図22・1及び22・2に示す通り、MCB及びPPCに挿入されているH：鎖及び L鎖のDNA塩基配列に変化は認められなかった。従って、 MCBの培養期間
を通じて、組換え体は安定に発現すると考えられる。41
107
倉 還 当
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