H工V−MN

H工V一工工工B

Ni54 N161 DBA3

N工63 N工53

tEbt［2

CTRP一工H工 GPGRAEYTTKN工工GT工RΩAHC

一一一一一m−T・一一・一KS一ΩR一一一一一一V一工GK：一 一一NM一一一一一

一一一一一m一工K一一一一一 一一一一一一一一一GE一一一N一一一一一一

一・・一一一一m−T一一G−R一 一一一一一・一一V−A−GK一一一D一一一一一一

一一一・一一・m−T一一G−R一 一一一一一V−A−EK一・一一D一一・一一一一

一一一一一m一一M−RG−R一一 一一一一一・一一一A−GK一・一一一一D一一一一一一

一一一一一m−r一一A−RV 一一一一TL−A−RR一一一D一一一一一一

一一一一・・一・一一mKA−G−LSV 一一一一S一一・一一一RQ−T−D一一一一一一

2．0

＞500 1．0 3．9 3．9 0．5

31．2

3．9

2．0

＞500

1．0 2．0 2．0 1．0

31．2

3．9

The HIVL 18equences were co血med by prov廿al pNA sequencing of v廿us−infbcted

cells． Dashes indicate sequence homology to HIV 1 MN．

57

4・4・3 臨床分離ウイルスに対する中和活性

 熊本大学医学部または国立予防衛生研究所（現国立感染症研究所）との共 同研究により、8種類のHIV・1臨床分離ウイルスに対する1（D・247の中和活 性を測定した。CD8陽性細胞を除去した健康な人の末梢血単核細胞（PBMC）

をフィトヘマグルチニン（PHA）で刺激後、1：L・2存在下でHIV・1感染者の血 漿と混合培養を行い、その培養上清より臨床分離ウイルスを得た。これらの

ウイルスを用いて、PNDの塩基配列よりアミノ酸配列を解析し、この領域の 発現タンパク質とKD・247との反応性を、ドットプロットを用いた酵素免疫 法により確認した。KD・247との反応性が確認された臨床分離ウイルスを用

いて中和試験を実施した。

 培養液を用いて希釈したK：D・247に臨床分離株ウイルス液を加え、37℃で 1時間中和反応を行った後、上述の方法で得た健康な提供者より採取した

PBMCに接種レた。1日間培養後ウイルス液を洗浄し、更に3〜5日間培養し

た上清中のHIV−1 p24抗原を定量して感染性の強さを判定した。 p24抗原量 は、且IV抗原検出キット及びp24抗原定量パネル（ダイナボット社製）を用

いて測定した。

 表7に示すとおりK：D・247は8種類の臨床分離ウイルスを中和した。ED50

値は29〜260μg／mlの範囲であった。陰性対照として用いたNHIgG（450

μglm1）は、すべての臨床分離ウイルスに対し中和活性を示さなかった。

58

表7 KD−247の臨床分離ウイルスに対する中和活性

臨床分離株 実験番号

感染価（TCID，。）

ED，。＊（μ9／ml）

PI−MOK

^{1 7}

¹⁸¹

PI−YHI

123456

68

@7 @7

R16R16

R2

87T0 Q9W7 P50W7

CI−1

123 5771

50

Q60W7

CI−2

12 77 158

P81

CI−7

¹

＞316 50

CI−10

¹

14

87

CI−22

¹

⁷

87

CI−25

^{1 3} 60

＊検体のp24抗原量が、 KD−247を添加していない対照群のp24抗原量の対数平均値から

標準偏差を差し引いた値の1／10以下に減少した場合に陽性と判定し、中和抗体力値（ED50）

は前述の合胞体観察と同様の方法に従い計算された。

59

4・5  細胞間感染抑制活性

4・5・1 HIV・1 MN株持続感染細胞に対する細胞間感染抑制活性

 KD・247のH】V・1持続感染細胞に対する細胞間感染抑制活性を測定した。

培養液を用いて2倍段階希釈したKD・247に、且IV・1 MNが持続感染してい る株丁丁細胞（CEM・NKR）を加え室温で1時間中和反応を行った後、感染 細胞数の5及び25倍の標的細胞（MT・4）を加え培養を行った。25時間後に 合胞体を観察することにより、ウイルス感染の有無を判定し、前述の計算式

を用いて中和抗体価（ED50値）を求めた。

 表8に示すようにKD・247はHIV・1感染による合胞体形成を抑制し、細胞

間感染抑制活性を示した。

表8 KD・247の細胞間感染抑制活性

感染糸陣・標的細胞 ED，。（μ9／ml）

1 ：5

28．7

1：25

^26．3

4−5−2 HIV・1感染者末梢血単核細胞に対する感染拡大抑制活性

 KD・247のHIV・ 1感染者の末梢血単核細胞（PBMC）に対する感染拡大抑 制活性を調べた。研究用目的での使用に承諾を得たH：IV・1感染者のPBMC

よりCD8陽性細胞を除去し、抗CD3モノクローナル抗体（OKT 3）で刺激

後、IL・2存在下でK：D・247（60及び240μglml）とともに培養を行った。3

〜4日毎に培養上清を交換し、培養上清中のHIV・1p24抗原量を測定した。

 表9に示すように、KD・247はH：IV・1感染者のPBMCに対して感染拡大

60

抑制活性を示した。患者KMO、 Y lrA及びYAKでは、 KD・247濃度依存的に ウイルス産生量（P24抗原量）が抑制されたが、 YKAでは240μ91m1での抑

制効果が不十分であった。これは、KMO、 YTA及びYAKのPBMCでは、

解析したウイルスクローンの全てが、PND領域にIGPGRA配列を有してい

たのに対し、YKAではエピトープ解析の結果：K］D・247との結合性に必須であ るアルギニン（R）がグリシン（G）に置換しているウイルスクローン（IGPGgA 配列）が存在しているためであると考えられる。また、YAKにおいて、60μ glm1のKD・247で効果が示されなかったのは、実験に用いた細胞数が他の患 者の約2倍であったため、多量のHIV 1が産生されたものと考えられる。そ

の結果として抗体を添加していない群では、宿主となる細胞が死滅したため ウイルスの複製が止まり、60μglm1のKD・247存在下では一部のウイルスが 完全に中和されずにウイルスの複製が生じたものと考えられる。

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表9 KD・247のHIV・1感染者末梢血単核細胞に対する感染拡大抑制活性

Patient

code

HIV−1 Env−V3 sequence

CD8  depleted

ドキュメント内 一 Leader 一 FRI (ページ 63-68)