90 麻布大学雑誌第 9 10 巻 2004 年 多くの低温生物学者らの手によって改良され続け, するこ とにより, この医源性不妊を回避することが 近年, 冷却! 加温法の劇的な改善により, 課題であった溶液の毒性問題が解決され, 細胞非侵襲的な, 極めて有効な卵子 / 胚の凍結保存法として完成さ

第7回　 麻 布大学　生殖

・

発 生 工 学セ ミナ

ー

89

第

7

回

麻布大学　

生

殖

・

発

生

工

学

セ ミ

ナ

ー

ヒ

ト

卵

子

の

凍結保存

ヒ

ト卵 子

バ ン

ク

の

_{実 際}

一

桑 山

　

正

成

加

藤

レディス ク リニ _ッ ク

　 先端

生

殖 医学研 究所

はじめに 　 我が国で は現 在 10組に 1組の夫 婦が不 妊で悩んで お り

，

その

5

分の 1が 不 妊 医 療 を 受 け

，

新生児の う ち すで に

97

人に

1

人 が 体 外 受 精 由 来で ある。 不 妊 原 因は男 性 因 子と女 性 因 子に 二分 さ れるが

，

遺伝的 材 料 と な る 卵 子 と胚 が 着 床 す る 子 宮 を持つ _{女 性 要 因 が} 全 体の

7

割 を 占め る

。

不 妊 症は

_，

治 療 し な くとも直 接 身 体 的に は重 大 な 支 障 を きたす もの で はな く

，

ま た不 妊で ある_事実 を認め た くない患 者が多い た め_， 概 して治 療の 開 始 時 期 が 遅 れ が ちで ある。

一

方で

，

女 性には年 齢 要 因に よる絶 対 不 妊があ り， 治 療 開 始 年 齢 が 高い 場 合に は

，

その疾 病 的 不 妊 原 因 が 解 決 さ れて も

，

年 齢 要 因によ り妊 娠 す るこ とがで き ない 。 女性の妊 孕 性は

35

才 頃 か ら減 少 し

，39

才 を超える と その傾 向 は 顕 著にな り， 妊 娠 率 が 有 意に低 下 する だ けで な く

，

胎 児の 染 色 体 異 常 率の上昇 も 見ら れ る

。

そ して閉 経 を待 た ず

，45

才 を もっ て卵 子の 老 化に よ り妊 娠の可 能 性はほ ぼゼロ となる

。

　 当 院では 年 間 1万 例 以 上の 体 外 受 精 治 療 を 行っ て い るが

，

患 者の_{平 均 年齢}は約

39

才であ り

，

多くの女 性 患 者 が 年 齢 性 不 妊 とい う

一

般 不 妊 治 療の タ イム リ ミッ トに直面 してい る

。

　

一

方

，

男 性不妊に対 する近 年の 治 療 技 術 開 発は目 覚ましく

，

体外受 精や顕微授 精 技 術の _確立によ り

，

精 巣 内か ら1精 了で も得 ら れ れば

，

これを もと に正 常な産 子へ _と結びつ けるこ とが 可 能 と なっ た

。

さ ら に無 精 子 症患者に おい ても

，

その

一

_部は精巣内に

，

精 子細 胞 あるい は 精 母 細 胞 な ど

，

精子のも と と なる 精 細 胞が存 在し て お り

，

これ ら を 用い た_{治 療 法}が臨 床応用 されつ つ _ある。 し か し な が ら

，

男性 患 者の妻 が高 齢であっ た場 合 ， 夫の治 療を待つ 問に妻の卵 子 が老 化し

，

妊 娠 する こ と が で きなくな る ケ

ー

スが少 な く ない。 そこで

，

妻の卵 子を少 しで も若い うちに 採 取 し

，

凍結 保存して お くこ とで

，

卵子の 老化を防 ぐこ とが 可 能となる。 我々 はもともと この 目 的

，

す なわち夫婦 間の 不 妊治 療の

一

環と して

，

卵子の将 来 的 本 人 利 用のた めの卵 子セル フ バ ン ク を実現 する た め_， 卵 子 凍 結 保 存 技 術の 開発を行っ た。 ヒ ト卵 子 凍 結 保 存1卵 子バ ンク設立 の背 景

　

1972年， マ ウス胚で成功例が示 さ れ た凍 結保 存技 術 （緩 慢 凍 結 法 ）は_， その後 様々 な 動 物 種の胚 や 卵 子へ の応用が試み ら れ

，

実に多くの哺 乳 動物 胚で素 晴 ら しい _{保 存 性 が 示 さ}れ た。 この技 術は1983 年より ヒ ト体 外受精プロ グラ ム に導入さ れ

，

墓幹技 術の

一

つ として広 く世 界 中に普 及 し

，

胚の凍 結 保存に日常 的に用い ら れて き た

。

し か し な が ら受 精 前の卵 子は 低 温 感 受 性 が 高 くかつ _{物 理 抵 抗 性}に_乏 しい た め

，

緩 慢 凍 結 法に よ る保 存は極めて困 難で あっ た。 1985年， 新 しい凍 結 保 存 法

，

ガ ラス 化 保存法が開 発 され

，

従 来の緩 慢 凍 結 法で は凍 結 保 存 が 困 難で あっ た偶 蹄 類 胚 など耐 凍 性の低い胚の迅 速かつ _{効 率 的 な 凍 結 保}存 が 可 能 となっ た

。

し か し依 然これ らの ガ ラス保 存 法 を 応 用 して も

，

物 理 抵 抗 性の低い卵 子で は凍 結 失 敗 例 が 相 次 ぎ

，

その 原 因として高 濃 度の凍 結 保 護 物 質 を含むガラ ス化 液に よる MII プ レ

ー

トの損 傷が指 摘 さ れ た

。

手 法の改 良 が すで に

80

年 代に行 き 詰 まっ て い る緩慢凍結法を尻 目に

_，

ガラ ス化 保 存 法はその後，

NII-Electronic Library Service 90 麻 布大 学雑 誌 　第9

・

10巻 　2004年 多 くの 低 温 生 物 学 者 らの手によっ て改 良 さ れ 続 け

，

近 年

，

冷 却！加 温 法の劇 的 な 改 善によ り

，

課 題であっ た溶 液の毒 性 問 題 が 解 決 さ れ

，

細 胞 非 侵 襲 的 な

，

極 めて有 効 な 卵子／胚の_凍結保存法と して_完成さ れた1） 。 　こ の低 毒 性ガ ラス化 液 と超 急 速 な 冷 却！加 温法を用 いた最 少 容 量 冷却法

，

す なわち

Cryotop

法 （図 3）で は

_，

各 種 動 物

，

発 育ス テ

ー

ジの胚 は も ちろ ん

，

ヒ ト 未 受 精 卵子におい て も保存融解 後の極め て高い生存 率が得ら れ

，

さらに 顕微 授 精後の正常 受精率が90％ 以 上 と

，

非 凍結卵子の成 績 と比較し て も遜色が な く

，

その後の胚 発 生や胚 移 植 成 績 も良好であっ た

。

これ まで凍結保存卵子由 来胚を移植した29症例 （平均 移 植 胚 数 2

．

2 個

1

移植 ）の _うち12例に妊 娠成立 （GS 確 認 ：妊 娠率 41

．

3％）が確 認さ れ

，

すで に5例の正常 な挙 児が得られ てい る。 こ の手法が追試さ れ た米国

，

メキシコ

，

コ ロ ンビ ア に おい て も同様の_好成績が得 られ

，

同技術の再 現 性も証 明さ れ てい る。 マ ウス未 受 精 卵

．

f・

を 用い た アニ マ ルモ デル_試験 でも 同法に よ りほ ぼ 100％ の生存 率が得ら れ

，

従 来の ガ ラ ス化保 存 法で 問 題となっ てい たス ピン ドルの異 常もCryotop 法では 発 生しない こ とが明ら か とな り

，

その_安全性 の _高さ が証 明さ れ てい る。 こ の効果 的かつ 安全 なガ ラス_{化 保 存技 術}の _完成に より

，

卵子を臨床 治療目 的 で

一

時的に保 存す る卵 子バ ン クの _設立 が可 能となっ た

。

生 殖医 療 分 野 に お け る卵 子 凍 結 保存の意 義 ： 卵子 バ ン ク 　卵子バ ンク に は

，

自己の卵 子を将 来 本 人が利 用 す る た め に保存 する セ ルフ卵 子バ ンク と

，

卵 了提 供 プ ロ グ ラム に用い る第三者の卵 子を保 存 する ドナ

ー

卵 子バ ン クの 2 種類がある。 （1）卵子セ ル フ バ ンク （本 人 利 用の た めの卵 子バ ンク） 1）ガン_{患 者}に おける治 療後の妊 孕 性維持

　

未 婚 女 性に おける白血病など で は

_，

骨 髄 移 植 をは じ め と す る造血幹 細 胞 移 植に よりその 多 くが治 療 可 能となっ た反 面

，

化学 治 療の た め多量 に 投 与 さ れた 抗癌 剤お よ び放 射 線 治 療の 副 作 用に よりほ ぼ全 例が 不妊とな る現実がある

。

　し か し な が ら， 骨 髄 移 植 治 療 前の 寛 解 期に， 男 性 の_{場 合}は精子

，

既婚の女 性の場 合は受精 卵 を採 取 し て凍 結 保存 し

，

治 療 後， そ れ ら を 融 解 して

IVF −ET

するこ とに より

，

こ の医源性不妊を 回 避 する こ と が 可能 となっ てい る

。

し か し未受精 卵 子は ， その凍 結 保存 技術が確立さ れ てい な かっ た た め

，

未婚の女 性 ガ ン_{患 者}に は その _道は閉 ざさ れて い た。 2001 年， 我々 が卵 子の_{凍 結保 存 技 術}を確立 し たこ と を知っ た 血液 内科 医か ら

，

未 婚の _白血病 女 性 患 者の卵 子 を 骨 髄 移植 治療 前に凍結 保 存して もらえない か

，

とい う 依頼があっ た。 直ち にその実 現へ 向けて

，

採 卵の 可 能 性

，

リス ク， タ イ ミ ン グ やス ケ ジュ

ー

_ルなど ， 専 門家 技術会 議お よ び倫 理委員 会に おい て十 分に検 討

，

協議 さ れ た後， 同 年に第

一

_{例が実 施さ れ た}

_。

2）高齢不妊に備え た若年時に おける卵 子 保 存 　女 性の 妊 孕 性は

一

般に

35

才 頃 か ら減 少 を は じめ

，

その_{傾 向}は40 才を越 える と顕 著となる

。

そ して 45 才をもっ て閉 経を待たず に_， ほ ぼ全て の女 性は妊 娠 する能 力を失 う。 し か し な が ら現 代 社 会におい て は 多くの女 性が

，

晩 婚 や 職 業 的 理 由 など に よ りこ の生 殖 年 齢 内に伴 侶と出 会い_， 子を生む機 会を逸 する_場 合が少なくない。 晩 年におい て も 自 らの子 を得 るこ と がで き る男 性と性の差がある に も関わ らず

，

男 性 型の社 会 構 造に より

，

女 性 にとっ て の 出 産 が

，

そ れ まで積 み 上 げて き た キャリアの致命的 なハ ンディ と なる現 実 問 題 が 存 在 してい る

。

これらの性 差 別 を 解 消 し， 自分の人 生の ， 適 した 時 期に子供 を持て る よ うにする技 術 として卵 子の セ ル フ バ ンキン グ が注目 さ れは じめて いる

。

3） 夫が不 妊 治療中で ある_{高 齢婦}人の妊孕 性維 持 　生 殖 補 助 医 療で は

_，

男 性 因 子 不 妊 症におい て

，

精 液 ある い は精 巣 中に例 え1細 胞で も正常 精子が存 在 す れば

_，

顕 微 授 精 （lntra　Cytoplasmic　Sperm　Injection_；

ICSI

）に よ り正 常 な 受 精 卵 を作出 するこ とが 可能と なっ て い る

。

無 精 子 症 患 者の約 15％ に は

，

精巣内に 精 子の も と と なる精 細 胞

，

す な わ ち精 子 細 胞

，

精母 細 胞 あるい は精 祖 細 胞が存 在し て お り

，

現在

，

これ らの細 胞 を体 外で精子に発 育 させる技 術が確立さ れ つ つ _ある

。

しかしなが ら

，

40 才を越 えた女 性は段階 的に卵 子 老 化によっ て絶対不 妊へ と 移行するため

，

不 妊 男 性の妻がこ の_{精 子形}成！完成培 養 技術を用い た 治 療 法の 臨 床 応 用 を待つ 間に

，

年齢を重 ねて子 供を 作る機 会 を 失うこ と と なる。 そ こ で

，

あら か じ め

，

妻の健 康な卵 子 を 凍結保存し て お くこ と に よっ て

，

こ の高齢由 来不妊に対応 するこ とが 可能である。 N工 工

一

Eleotronio _Library

第7同 　 麻 布 大 学 　生殖

・

発生 匚学セ ミナ

ー

91

（2） 卵 子バ ン ク （第三者 利 用のた めの バ ンク） 　欧 米 をはじめ とする多くの国で は

，

早 期 卵 巣 不全 や両 側 卵 巣 摘 出 女 性 など， 本 人 卵 子に よ る妊 娠が不 可 能

，

ある いは困 難な場 合

，

精 神 的

，

身体的に_{健 康} な 第 三 者 か らの提 供 卵 子を用い た体 外受精が

，

不 妊 治 療の

一

つ _{と し}て 目常 的に_実施さ れて い る。 我が国 で は現 在

，

この卵 子の Donationは凵本 産 科 婦 人 科 学 会の ガ イ ドラ イン で認め ら れてい ない が， 近 く

，

患 者に卵 子 が 全 くない症 例に限っ て実 施 可 能と な る見 通 しで あ る。 　提 供 者の卵 子が凍 結 保存に よりバ ンク で きる よう にな れば， 提 供 者 が 都 合の 良い 時に採 卵でき

，

凍 結 卵 子の状態で

，

必 要な場 所まで_輸送

，

使用時まで_保 管 が 可 能とな り， 空 間 的， 時 間 的 制 約が解 除 さ れ

，

卵 子の利 用 性が飛 躍 的に_向上する。 さ ら に

，

患 者の 治 療に必 要 な 数だけ 凍 結 卵 子 を融 解し

，

受精さ せ る こ とに よ り， 限ら れ た貴重 な卵 子を， 無 駄な く有 効 に利 用 する こ と が可 能と な る。 ガラス_化保存の理 論と実 際 （1）ガ ラス化 保 存 理 論 　ガラ ス化 保存法と は

，

高 濃度の_{凍 結保 護 物 質}を添 加 した溶 液に よっ て細 胞を十 分に脱 水 濃 縮 後

，

液体 窒 素へ の直 接 注 入に よ る急速な冷 却に より

，

細 胞 内 外 を非 結 晶 化 （ア モ ル フ ァス状態 ）し て凍 結保 存す る手 法である。 　この手 法は細 胞へ の冷 温 障 害を回 避で きる だけで な く， 保 存 中 溶 液 内に有 害な氷 品が発生 し ない た め に

_，

従 来の緩 慢 凍 結 法に比較し て

，

より高い_{凍 結 保} 存 後の生 存 性 が 得 られ る。 また従 来 法に比 較 して処 理が極めて簡 易で

，

プロ _グラ ム フ リ

ー

ザ

ー

な ど特別 な 機 器 も必 要 としない た め

，

実 用 的 観 点か ら臨 床応 用に極めて有 効 な手法で ある。 （2）ガラ ス化 保 存の歴 史 　高 濃 度の凍 結 保 護 物 質 （Cryoprotectant；CPA ）を 添 加 した水は

_，

低 温 下 に おい て も水 素 結 合に よ る氷 晶 形 成が著 しく阻 害 さ れ る た め_， 液 体の分 子 状 態の ま ま固 化 する

。

す なわち 物 理 的 な損 傷 無 く

，

細 胞を 低 温で永 久 保 存 す るこ とが 可 能で ある。 1937年， 低 温 生 物 学 者Luyet に より提 唱 され たこ の凍 結手 法は

Vitrification

（ガ ラス化 保 存 〉 法と名 付 け ら れた2 ）。 しか しなが ら十 分に毒 性の低い 凍 結 溶 液 （ガラ ス化 液）が開発 で きず

，

最初の画期的 な成 功は実に半世 紀 後の 1985 年 （マ ウ ス胚3

_り

_{に な} っ て か らで あっ た。 その後

，

ウ サ ギ胚

，

ウ シ4 ）

，

ブ タsl な ど11 種以 ヒの 動 物 種に おい て_{保 存 後}の生存が報告さ れ

，

今日 で は その_多くの _種に おい て実用的にガラス _{化 保存 技 術}が 利 用さ れてい る。 　 手 法的に は

，

初期に用い ら れ た高濃 度のCPA を添 加 し た ガ ラス_化液は90 年代に 入 り

，

よ り低い_濃度の 溶液6）へ

，

ま_た同時_に

，

添加 す_るCPA _の種 類_や

，

超 急 速 な冷 却

一

加 温法7｝の_検討

，

さ ら に

，

専用の ガ ラ ス化コ ンテ ナT

，

8）_{が開発 さ れ}

_，

_{現 在すで に不妊治 療} 分 野に おけるヒ ト卵子

1

胚に おい て

，

好 成績が報 告さ れてい る9

・

　10／， 。 （3）卵子のガ ラス_保存プロ トコ

ー

ル 　 我々 が用い てい る卵 子の ガ ラス化 保存の プロ トコ

ー

_{ルを図 1に示 し た} 。 　 採取さ れ た卵 子は まず卵丘 細胞を 除去し て裸 化し

，

細胞 内へ CPA を浸透 _{さ せ る た め に}平 衡液へ _浸漬す る

，

J 浸 透圧 差 に よ り

一

時的 に収縮 し た卵 子 細 胞 体 積 が回復 する のを待ち

，

細 胞 内外の氷 晶 形成 を抑制 す る た め

，

凍 結し ても氷 晶が形成さ れ ない ガ ラス_{化 液} 中へ 卵 子を導_{入 し}

，

細 胞 外 液を完全_に

i

換 後

，

ガ ラ ス _化保存用 に開発し た凍 結 保存 容 器

，

ク ラ イ オ トッ プへ 載_{せ る} 。 直ちに液体窒素中 （

−

_196℃ ）に容 器 を投入 し て急速に冷却

，

保 存する。 この温度域では 細 胞が ほ と ん ど劣 化 し ない た め

，

品質を 良好に保 持 し た ま ま

，

半永 久 的に保 存が 可能であるc

、

解 凍は

，

37℃ に加温 し た解 凍 液中 に

，

直接凍 結卵子を導入す る ことに より急速に行い

，

ショ糖を1お よび

O．

5モ ル 添 加 し た希 釈 液を用い て段 階的に卵子細 胞 内の CPA 図1Vitrificationプロ トコ

ー

ル

NII-Electronic Library Service 92 麻布 大 学雑 誌　 第9

・

IO巻　2 04年 図2　Vitrification前 後の ヒ ト卵 子 を希 釈除 去 する。 4 時間の培 養に より細 胞 膜の機 能 回復を待っ て か ら顕微 授精法に より媒 精 し受精さ せ

，

さ らに5日間の発 生培 養後に胚盤胞期へ 発 育_{し た}胚 を患者の

f

・

宮 内に非 手術 的に移植す る。 （4 ）ガ ラス_{化 保存}し たヒ ト卵 了の生存性 　これまで に解 凍し た 107個の卵子の 生存 率は98％ で

，

従 来の_{緩 慢凍 結 法 （}22％）に 比較 して 明ら か に 高い _良好な成績であっ た。 また 生存 卵子を顕微 授精 後

，

90％ が雌雄両 前核の _{形 成}を伴う正常受精 卵とな り

，

培 養後

，

91％ が分割

，

さ ら に4 日後

，

その 50％ が分化し た 正常な胚 盤 胞へ _{発生 し た} 。 この成 績は凍 結保 存して い ない_{卵子 と}比較して _も遜色の ない_良好 な値であ り

，

凍結に よ る卵 子の Viabiliy　lossが最 小 限 で あっ たこ と が証 明さ れ た。 従 来の緩 慢 凍 結 法では， 生存卵子の_{半 数}が受精し た もの の胚 盤 胞へ の発生 は 見ら れ な かっ た。 こ れ まで の緩 慢 法で は妊 娠が滅 多 に得ら れ な かっ た こ と が この結 果か ら も示さ れ る

。

　現在ま で に同 手法を用い て 187 人の不 妊 治 療 中 患 者より498 個の_卵子が凍結保 存さ れて いる。 お わ り に 　毒 性の_低い ガ ラス_液と最 速の 冷 却／融 解 方 法で構 成 さ れ た最 少 容量冷 却 法に よ る ガラ ス化 保 存 法を用い る こ と に よっ て

，

従 来

，

極め て困 難iと さ れて いた ヒ ト卵 子の凍 結 保存が 可能 と な っ た。 これに より， 白 血病患 者や卵 巣ガン_患者な ど

，

卵 巣 あるい はその機 能 消失に よっ て妊 孕 能 を失 う状 況 に置 かれ た女 性 が_， 自己卵子の_凍結保 存に より

，

その後の人生 におい て

，

自分自身の 挙 児を得る道 が 開かれた。 　 すで に

，

日本

，

米 国お よ び中 南 米 諸 国にお い て演 図3 卵子の Vitrification用容器 「ク ラ イ オ トッ プ 」 （左 ）と 　 　 卵 子 をの せた状 態の同先 端 部 （右 ） 者の技 術 指 導の も とに ヒ ト卵 子セ ル フ バ ンク施 設が 設立 さ れ

，

100 名を越 える女性 達に利 用さ れて い る

。

　

近年の卵 子 体 外 成 熟 培 養 技 術の確 立に より， PCOs 患 者な ど

，

その _{臨床 応}用 場 面が広がっ た未 成 熟 卵 了

・

や

，

さ ら に基 礎 段 階で 画 期 的 な 成 果が報 告 さ れつ つ ある様ざ まなス テ

ー

ジの発育途上卵 母 細胞の不 妊 治 療へ _{の利 用 性 拡 大のた め}

，

_{こ れ らの卵 母 細 胞}

_，

_ある い は卵 巣 組 織に適 し た ガラ ス化 保 存 法の開 発を実 施 中である、， 引用文献

1）Kuwayama

．

　M

．

，Osamu ，　Kato

．

　All　round 　vitrification

　 　of　human　oocytes 　and 　embryos

．

　J

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　Assist

．

　Reprod

．

　 　Gentic

．

17（

8

）：477

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2000

．

2 ＞Luyet

，

　B

．

J

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　Thc　vitrification 　of　organic 　colloids 　and

　 　of　protoplasm

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S ．

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bovine

　

blastocysts

　ebtained 　

by

　

in

　 　vitro　culture 　of　oocytes 　matured 　and　fertilized　

in

　 　vitro

．

　

J．

　Reprod

．

　Fert

．

96

：

187−193，1992．

5）Kuwayama

，

　M

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　P

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，

　

Jacobsen

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　H

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，

　

Greve，

　T

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＆

　 　

Callesen

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H ．

　

Successful

　cryopreservation 　of　_porc血e

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　 　365

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1997

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6）Kuwayama

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　In　straw 　dilution　of 　bovine　IVF

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by

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7）Vajta

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．

，

　Kuwayama

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　M

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　P

，

，

　Booth

，

　PJ

．

，

　 　

Jacobson

，

　

H ．

，

Greve，

　

T．

＆

Callesen

，

　

H ．

　

Open

　pulled

　 　straw 　vitrification ：anew 　way 　to　reduce 　eryoinjuries

ng7pm

fiinlt*tsre

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