短 報
種豚場における胚採取のための未経産豚の発情同期化法の検討
内倉健造
1・渡邉拓也
1・中田智子
2・鈴木雅大
2・
糟谷 淳
2・相良鮎美
1・田島茂行
1・栗田隆之
1 1愛知県農業総合試験場，愛知県長久手市，480-1193 2愛知県畜産総合センター，愛知県岡崎市，444-0006 （2020 年 3 月 23 日受付，2020 年 6 月 19 日受理） ─────────────────────────緒
言
近年，日本や周辺諸国で家畜伝染病が発生し，農 場へのこれら疾病の侵入リスクの高い状態が続いて おり，養豚産業への影響が懸念されている。特に我 が国では 1970 年代から育種改良として閉鎖群であ る豚系統の造成が行われており（阿部，1987），それ らは多くの場合，1 つの農場内で造成・維持が行わ れている。そのため豚熱等の家畜伝染病が発生する と，多くのコストと時間を掛けて育種改良された貴 重な遺伝資源が全て失われる。ブタの胚移植技術は 透明帯を有する胚を利用するため，疾病伝播を防止 しつつ遺伝子を保存することが可能である（小島， 2000）。このことから優良種豚の胚を採取・保存す ることは，遺伝資源の消失リスク低減に有効と考え られる。 ブタ生体からの胚採取はその子宮の解剖的構造 （蛇行している 50∼140（未経産）もしくは 100∼170 cm 長（経産）の子宮；COWANと MACPHERSON，1966） から，ウシやウマのように経直腸による操作で子宮 灌流が実施できない。過去に非外科的採取を目的と して，子宮角先端部と子宮角基部を結合させて子宮 角の長さを短縮させたブタを用いることが検討され （KOBAYASHIら，1989），近年では，超音波ガイド下 で卵巣から卵子を採取して胚を作出する方法（生駒 ら，2014；YOSHIOKAら，2020）が報告されているが 未だ普及していない。そのため現在は特殊な設備や 技術を要する外科採胚が一般的に行われている。一 方で，外科採胚はブタへのストレスが大きく頻回に 実施することが出来ないため，1 回の採胚で複数の 胚を確実に得ることを目的に発情/排卵同期化のホ ルモン投与が実施されている。供胚豚（ドナー）の うち経産豚については離乳時に合わせて同期化する 方法（ANGELら，2014）が有効と考えられるが，体が 大きく外科採胚時の取り扱いに困難が伴う。未経産 豚のうち初回発情前のブタでは任意の時期にホルモ ン投与することで発情を同期化できる（FUJINOら， 2006）。しかし，ブタの初回発情は早いものでは生 後 143 日から始まると報告される（KNAUERら， 2010）一方で，種豚登録のための審査は 180 日齢以 降で行われる（日本養豚協会，2019）。つまり，種畜 に相応しいと判断された未経産豚を採胚に用いる場 合，初回発情後であることが多いと考えられ，発情 周期が回帰している未経産豚に対して有効な発情同 期化法が求められる。 今回，種豚場において発情周期中の未経産豚に対 して，複数の同期化法を用いて採胚を行い，その採 胚成績を比較したので報告する。材料および方法
ドナーとして愛知県畜産総合センターで飼養して いる大ヨークシャー種系統豚「アイリス W3」雌豚 Investigation of Estrus Synchronization for Porcine Embryo Collection in Breeding CenterK. UCHIKURA, T. WATANABE, T. NAKATA, M. SUZUKI, A. KASUYA, A. SAGARA, S. TAJIMAand T. KURITA Key words : embryo recovery, gilt, ProstaglandinF2α, estrus synchronization
12 頭（約 8ヶ月齢，体重約 130 kg）を用いた。実験 は愛知県農業総合試験場実験動物等実施規定を遵守 して実施した（農総試動物実験承認番号 31-6）。ド ナーは 1 日 1 回雄豚の前で背圧を行い，不動反応を 示したものを発情と判定した。 12 頭の雌豚は以下に記述する 3 試験区に 4 頭ず つ分けた。妊娠黄体退行区:発情中のドナーに人工 授精を行い，交配後 23∼26 日目に超音波診断装置 で妊娠を確認後，プロスタグランジン F2α（PGF2α） として 0.184 mg のクロプロステノール Na（プラ ネート®，株式会社インターベット）を投与し，24 時 間 後 に 再 び PGF2αを 同 量 投 与 し た。2 回 目 の PGF2α投与時に 1000 IU ウマ絨毛性性腺刺激ホルモ ン（eCG；動物用セロトロピン®，あすか製薬株式会 社）を投与した。PG2 回区：過去の報告（柴田ら， 2006；中田ら，2014）に従い，発情終了日を 0 日目と して，12 日目のドナーに 0.184 mg PGF2αを朝夕 2 回投与し，2 回目の PGF2α投与から 24 時間後に 1000 IU eCG を投与した。PG4 回区：PG2 回区に対 して黄体退行を促進させる目的で PGF2α投与回数 を 4 回に増やした。すなわち，発情終了後 12 およ び 13 日目のドナーに 0.184 mg PGF2αをそれぞれ朝 夕 2 回投与し，4 回目 PGF2α投与時に 1000 IU eCG を投与した。いずれの区も eCG 投与 72 時間後に 500 IU ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG；ゲスト ロン 1500®，共立製薬株式会社）を投与して排卵を 誘起した。これらのホルモン製剤はすべて頸部筋肉 内に投与した。hCG 投与後 24 時間および 40 時間 に人工授精を実施した。人工授精の精液は「アイリ ス W3」雄豚から採取し，精子の前進運動率が 80% 以上のものについて，50 mg/l エンフロキサシン （バイトリル®5% 液，バイエル薬品株式会社）を添 加した保存希釈液（ヒロスワイン B®液，株式会社 ヒロスワイン）で等倍希釈し，希釈後に精子濃度が 1 億/ml 以上のものを用いた。人工授精はスポンジ カテーテルを用いて，雌豚に希釈精液を 50 ml 注入 した。hCG 投与後 161∼165 時間に外科採胚を行っ た。 外科採胚は過去の報告（柏崎，1996）に準じて実 施した。豚舎内に設定した隔離部屋において，鎮静 薬としてドナーに 100 mg メシル酸マホプラジン （マフロパン 1% 注射薬®，DS ファーマアニマルヘ ルス）を筋肉内投与し鎮静後，導入麻酔薬として 0.25 g チアミラールナトリウム（イソゾール®，日医 工株式会社）を静脈内投与し，維持麻酔としてイソ フルラン（動物用イソフルラン®，MSD アニマルヘ ルス株式会社）を吸入させた。十分な麻酔深度に達 した後，解剖台を加工した手術台（図 1）に仰臥位に して保定した。腹部正中を切開し，腹腔外へ卵巣お よび子宮を露出した。卵巣の黄体数を計測し，両子 宮角をそれぞれ 50 ml の灌流液（POE-CM®，株式会 社機能性ペプチド研究所）で灌流し，卵子/胚を回収 図 1． 解剖台を加工して作成した手術台 Fig. 1. Operating table made from dissection table.
した。回収後，切開部位を縫合し感染予防のために 2 g アンピシリン（水性アンピシリン注「KS」®，共 立製薬株式会社）を筋肉内投与した。回収した胚は 発育段階を記録し，過去の報告（MISUMIら，2013） に従ってガラス化保存を行った。各試験区の平均黄 体数，平均回収胚数は統計ソフト R（バージョン 3.6.1）を用いて一元配置分散分析およびチュー キー・クレーマー検定で比較し，P＜0.05 を有意差 ありとした。
結果および考察
発情周期中の家畜において PGF2α投与は黄体を 退行させ，発情を誘起するのに有効であることが知 られている（WEEMSら，2006）。ただし，ブタにおい て，妊娠黄体は PGF2αの単回投与によって退行する が，発情周期中の 12 日目以前の黄体を退行させる には，PGF2αを頻回投与する必要がある（DIEHLと DAY，1974 ; HALFOLDら，1975 ; ESTRILLら，1993）。 そのため，ブタにおいて妊娠初期に PGF2αを投与す ることによって発情を同期化する方法が行われてき た（GUTHRIEと POLGE，1978 ; LOVEと GREY，1993）。しかし，この方法は流産が伴うことから動物福祉の 面での懸念がある。一方，柴田ら（2006）は発情終 了後 12 日目に PGF2αを 2 回投与することで発情周 期を 2 日間短縮できるとともに，eCG および hCG をその後に投与することで胚採取において発育段階 の均一な胚が得られると報告している。本研究では 豚系統の維持機関において，上記の 2 種の手法（妊 娠黄体退行区，PG2 回区）とさらにより確実に黄体 を退行させる目的で発情終了後 12 日目から PGF2α を 4 回投与した方法（PG4 回区）を用いて採胚を行 い，その採胚成績を比較した。 各試験区の採胚成績を表 1 に示した。各試験区と も 1 頭につき 10 個以上の黄体が観察され，平均黄 体数は試験区間で有意差は見られなかった。回収さ れた全ての卵子・胚数は 1 頭あたり 6∼35 個で，試 験区間に有意差は見られなかった。全ての個体から 受精後の胚が観察された。1 頭あたりの回収された 拡張胚盤胞は，妊娠黄体退行区，PG2 回区および PG4 回区でそれぞれ 13.8±3.1，4.8±9.5 および 17.3 ±7.2 個で，有意ではなかったもの PG4 回区で PG2 回区に比較して多い傾向がみられた（P＜0.1）。ま た，妊娠黄体退行区および PG4 回区で 4 頭全ての ブタで 10 個以上の拡張胚盤胞が回収された一方で， PG2 回区では 4 頭中の 3 頭で拡張胚盤胞が得られ なかった。 ブタ胚を遺伝資源として有効活用するには液体窒 素中でのガラス化保存を行う必要がある。ブタ胚の ガラス化保存後の生存性（FUJINOら，2008）や移植 後に子豚まで発育して出生する割合（子豚生産効 率；大曲ら，2015）は拡張胚盤胞期の胚で優れてい ると報告されている。過去の報告（BERTHELOTら， 2000 ; FUJINO ら，2007, 2008 ; KOBAYASHIら，1998 ; MISUMIら，2013）ではガラス化保存した拡張胚盤胞 の子豚生産効率は約 15％程度であり，10 個以下の 胚を移植しても安定的に受胎しないと考えられてい る。一方で，人工授精後に胚移植を行う「追い移植 （TAJIMAら，2019）」や複数のドナーから得られた胚 を混合して移植を行えば 1 頭のドナーから得られた 少数の胚が活用可能であり，近年その産子について も血統登録が可能になっている（日本養豚協会， 2018）。しかし，その際には分娩後の毛色による判 別または DNA を用いた親子鑑定が必要であり，通 常の胚移植よりも作業が煩雑となる。また同一家系 から確実に後継を得るためにも多くの胚を 1 頭のド ナーから得ることが望ましいと考えられる。これら のことから PG2 回区と比べて PG4 回区は胚を遺伝 資源の保存に活用する上で有効であることが示唆さ れた。 性成熟前のブタを用いた研究では，hCG 投与後 164 時間の採胚で胚盤胞∼拡張胚盤胞の割合が 80.0 % と最も多いのに対して脱出胚盤胞の割合は 3.2% であり，その後 hCG 投与後 171 時間で 41.0% に増 加したと報告されている（FUJINOら，2006）。この ことから排卵が正常に同期化された場合，本研究で 採胚を行った hCG 投与後 161∼165 時間では拡張胚 盤胞が多く得られると考えられる。中田ら（2014） は発情確認を 1 日 2 回以上行った上，発情終了後 12 日目から PG2 回区と同様の発情同期化処理を行っ たところ平均 15 個程度の正常胚が得られたと報告 している。一方で本研究では当該施設での慣行どお り，1 日 1 回のみの発情確認であったことから発情 終了日の判定に個体間で差異が生じ，PGF2αの 2 回 のみの投与では黄体退行が不十分であった可能性が 考えられる。そのため血中プロジェステロンの濃度 が低下せず正常な卵胞発育が阻害され，排卵・受精 の時期が同期化せずに，胚のステージが一定となら ないとともに変成卵子や脱出胚盤胞が増えて回収率 が下がることで，採取される拡張胚盤胞が減少する 傾向にあったのではないかと予想される。これらの
ことから胚採取のための発情同期化処理を選択する 場合は，実施する種豚場の発情確認頻度に留意する ことが必要であることが示唆された。本研究では， 黄体退行の観察や血中ホルモン測定を行っていない ことから，種豚場での効率的な胚採取のための発情 同期化法の開発には今後，これらについても検討が 必要と考えられる。 本研究では，妊娠黄体退行区も PG4 回区と同様 にすべてのドナーから 10 個以上の拡張胚盤胞を採 取することが可能であった。近年，持続性エストロ ジェンの単回投与により偽妊娠を誘起し，維持され た黄体を PGF2αで退行させる事で，流産を引きおこ すこと無く発情を同期化させる方法が報告されてい る（NOGUCHIら，2010）。さらにこの同期化法を胚採 取に利用した報告もある（HIRAYAMAら，2019 ; U CHI-KURAら，2020）。このことから今後は種豚場での採 胚に上記の方法を利用することも検討する必要があ る。 以上のことから，種豚場において発情同期化を利 用した胚採取が可能であるとともに，実施する種豚 場の飼養管理に合わせた発情同期化法を選択し，実 施することが有効であることが示唆された。
謝
辞
本研究を実施するにあたり，ブタの飼養管理およ び胚の回収作業に御協力頂いた愛知県畜産総合セン ターの関係者各位に感謝申し上げます。文
献
阿部猛夫：1987，わが国豚系統の造成とその利用， 表 1. 未経産豚から得られた黄体数および胚数 Table 1. The number of corpus luteum and embryos in gilts.Treatment group*1 Gilts ID The number of CL*2of ovaries Oocytes/Embryos
recovered*3 recoveredEmbryos EXBL* 4 recovered Early abortion 1 17 15 15 11 2 23 23 23 18 3 23 23 23 12 4 23 22 22 14 Total 86 83 83 55 （mean±SD） 21.5±3.0 20.8±3.9 20.8±3.9 13.8±3.1 2 times PGF2α 5 23 22 22 19 6 23 23 5 0 7 18 6 2 0 8 11 8 8 0 Total 75 59 37 19 （mean±SD） 18.8±5.7 14.8±9.0 9.3±8.8 4.8±9.5 4 times PGF2α 9 35 35 33 28 10 17 16 16 14 11 17 17 17 13 12 15 15 15 14 Total 84 83 81 69 （mean±SD） 21.0±9.4 20.8±9.5 20.3±8.5 17.3±7.2 *1Early abortion : PGF
2αinjection at early pregnant followed by gonadotropin, 2 times PGF2α: 2 times of PGF2αinjection at 12 days after finish of estrus followed by gonadotropin, 4 times PGF2α : 2 times of PGF2α injection at 12 and 13 days after finish of estrus followed by gonadotropin.
*2Corpus luteum
*3including degenerated oocytes and non-fertilized oocytes *4Expanded blastocysts
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