25-ヒドロキシコレカルシフェロールの新規指定及び基準・規格の設定 飼料添加物については、飼料の安全性の確保及び品質の改善に関する法律（昭和 28 年 法律第 35 号）第 2 条第 3 項並びに第 3 条第 1 項及び第 2 項の規定に基づき、農林水産大 臣が農業資材審議会の意見を聴いて指定し、その基準又は規格を設定している。 平成 24 年 7 月 12 日付け 24 消安第 1496 号をもって諮問された 25-ヒドロキシコレカル シフェロールについて、効果安全性の確認や基準・規格案を作成した。その概要は次のと おりである。 1. 要望品目 飼料添加物名 ：25-ヒドロキシコレカルシフェロール 用 途 ：飼料の栄養成分その他の有効成分の補給 2. 経過 平成 24 年 7 月 12 日 諮問 24 年 7 月 30 日 第 4 回飼料安全部会（飼料添加物効果安全性） 24 年 12 月 20 日 第 6 回飼料安全部会（飼料添加物効果安全性） 26 年 9 月 12 日 第 15 回飼料安全部会（飼料添加物規格） 3. 飼料安全部会の審議結果 資料 7－2 及び資料 7－3 のとおり。 参考：飼料添加物に係る食品健康影響評価 平成 25 年 12 月 20 日 26 年 7 月 8 日 農林水産省より、食品安全委員会に評価依頼 食品安全委員会より、飼料添加物として通常使用 される限りにおいて、食品に残留することにより 人の健康を損なうおそれのないことが明らかであ ると判断した旨の結果通知
資 料 ７
25-ヒドロキシコレカルシフェロールの概要 （新規指定） 項 目 概 要 製品の概要 ・ 飼料添加物として指定されているコレカルシフェロール（VD3） は、家畜や家きんのカルシウムやリンの代謝などに必要な栄養素 である。しかしながら、家畜等が暑さのストレス環境下に置かれ ると、肝機能の低下に伴い、VD3の代謝が低下し、畜産物の生産性 の低下が懸念される。 ・ 25-ヒドロキシコレカルシフェロールは VD3の生体内での代謝物で あり、これを VD3の代替として家畜等に摂取させることにより、 肝機能の低下による VD3の利用効率の低下を防止することを目的 としている。 VD3は酵素 25-ヒドロキシラーゼにより、肝臓にて 25 位に水 酸基が付与されることで 25-ヒドロキシコレカルシフェロール に代謝され、その後、腎臓においても 1 位に水酸基が付与さ れ、生理機能を有する 1α,25-ジヒドロキシコレカルシフェロ ールへ代謝される。 ・ なお、今回要望のあった 25-ヒドロキシコレカルシフェロール は、遺伝子組換え酵母 Saccharomyces cerevisiae ATC1562 株が産 生したコレスタトリエノールを化学的に修飾することで製造され る。 EU や米国等では 2006 年に飼料添加物として指定されている。 ・ 飼料安全部会（飼料添加物効果安全性）の審議では、それぞれ上 限を鶏用飼料 80µg/kg、豚用飼料 50µg/kg として使用される場合 において、飼料添加物としての効果及び安全性が確認された。 ・ 遺伝子組換え飼料部会の審議では、組換え DNA 技術を用いた飼料 添加物の安全性が確認された。 ・ 飼料安全部会（飼料添加物規格）の審議では、飼料添加物の新規 指定に関する基準・規格案が作成された。
資 料 ７ － １
日本における 審議状況 農業資材審議会（遺伝子組換え飼料部会） H24. 5.31 遺伝子組換え飼料部会 H24.11.16 遺伝子組換え飼料部会（終了） 農業資材審議会（飼料安全部会） H24. 7.30 飼料安全部会（飼料添加物効果安全性） H24.12.20 飼料安全部会（飼料添加物効果安全性）（終了） H26. 9.12 飼料安全部会（飼料添加物規格）（終了） 食品安全委員会 H26. 1.16 GM 専門調査会 H26. 2. 5 肥料・飼料等専門調査会 H26. 9. 5 GM 専門調査会
飼料添加物の効果安全性について（案）
25-ヒドロキシコレカルシフェロール
平成２７年３月２日
農林水産省消費・安全局
畜水産安全管理課
資 料 ７ － ２
目 次
１ 名称等 ... 1 ２ 起源又は発見の経緯、外国での飼料添加物としての許可状況及び使用状況等 ... 1 ２－１ 類縁物質 ... 1 ２－２ 起源又は発見の経緯 ... 1 ３ 効果に関する事項 ... 3 ３－１ 効果を裏付ける野外応用による試験 ... 3 ３－１－１ 豚 ... 3 ３－１－２ 鶏（ブロイラー） ... 4 ３－１－３ 鶏（採卵鶏） ... 5 ４ 残留性に関する事項 ... 5 ４－１ 豚 ... 5 ４－２ 鶏（ブロイラー） ... 6 ４－３ 鶏（採卵鶏） ... 7 ５ 安全性に関する事項 ... 7 ５－１ 毒性試験 ... 7 ５－１－１ 一般毒性試験 ... 7 ５－１－１－１ 単回投与毒性試験 ... 7 ５－１－１－２ 反復投与毒性試験（長期） ... 8 ５－１－２ 特殊毒性試験 ... 9 ５－１－２－１ 繁殖試験 ... 9 ５－１－２－２ 発生毒性試験 ... 9 ５－１－３ 生体内運命に関する試験 ... 10 ５－２ 対象家畜等を用いた飼養試験 ... 10 ５－２－１ 豚 ... 10 ５－２－２ 鶏（ブロイラー） ... 12 ５－２－３ 鶏（採卵鶏） ... 13 ６ その他（ヒトにおける知見） ... 13 ６－１ 日本人の食事摂取基準 ... 13 ６－２ 国民健康・栄養調査 ... 14 ６－３ 飼料添加物に起因する畜肉及び卵由来の 25-OH-D３の摂取量の推定... 14 ６－４ EFSA Journal ビタミン D の耐容上限量についての見解(2012) ... 14 ６－５ アメリカでの耐容上限量 ... 14 ７ 審議結果 ... 14 ８ 参照（参考文献及び参考資料） ... 14 - 1 -25-ヒドロキシコレカルシフェロールに関する効果安全性について １ 名称等 一般名：25-ヒドロキシコレカルシフェロール（以下「25-OH-D3」とする。） 5 化学名：(3β,5Z,7E)-9,10-secocholesta-5,7,10(19)-triene-3,25-diol 化学式：C27H44O2（分子量400.64） CAS 番号：19356-17-3 化学構造式： 10 15 商品名：ロビミックスHy・D （ハイディー）1.25％ 用途：飼料の栄養成分その他の有効成分の補給 対象家畜及び至適添加量： 豚 50µg/kg 飼料 （企業推奨量） 鶏（ブロイラー） 80～100µg/kg 飼料 鶏（採卵鶏） 80µg/kg 飼料 20 ２ 起源又は発見の経緯、外国での飼料添加物としての許可状況及び使用状況等 ２－１ 類縁物質 ビタミンD3（コレカルシフェロール）は、家畜や家きんのカルシウムやリンの代謝、 25 骨格の形成等に必要な栄養素である。ビタミンD3は、肝臓で25 位の位置に水酸基が付 与されて25-OH-D3に代謝され、さらに腎臓に送られ1 位が水酸化され、1α,25(OH)2D3 に代謝され、生理機能を有するようになる。〔参考文献1〕 日本では、ビタミン D3は飼料添加物として指定され、栄養補給の目的で使用されて いる。通常ビタミン D3は、鶏（うずらを含む）・豚用飼料に 25～75μg/kg 飼料（鶏で 30 は約4～10μg/kg 体重/日、肥育豚では約 1.8～4μg/kg 体重/日）、養魚用飼料に 40μg/kg 飼料の割合で不断添加され、また肉牛に対しては 1 頭当たり 125μg/日、乳牛では 1 頭 当たり600μg/日程度の割合で不断給与されている。〔申請者調べ〕 ２－２ 起源又は発見の経緯 35 25-OH-D3は、肝臓でビタミンD3が、酵素である25-ヒドロキシラーゼの作用によっ て代謝された物質であり、その後、腎臓で代謝され、1α,25(OH)2D3となり効果を有す るという、ビタミンD3と同じ代謝機序を持つ。 家畜等は、密飼い・ウィンドーレスのような閉鎖的飼育環境や暑さといったストレス - 2 -
にさらされており、その結果、肝臓での正常な代謝が損なわれ、生産性が悪化すること 40 が懸念されている。 25-OH-D3は、ストレスによって肝機能が低下した場合でも、肝臓中での酵素活性に 左右されずに利用されること、また、近年経済性を追求した大規模飼育の手法において は、家畜・家きんの生産性の極僅かな違いでも収益に大きく影響をもたらすことから、 海外（EU、米国等）では、1970 年代から特に鶏に対しての 25-OH-D3の有用性に関す 45 る研究が行われ、既にビタミンD3の代替として用いられている。 EU 諸国では、2006 年に 25-OH-D3が飼料添加物として許可され、上限100μg/kg 飼 料添加でブロイラーに、上限80μg/kg 飼料添加で採卵鶏に使用されている。2009 年に は上限50μg/kg 飼料添加で豚（子豚、育成、肥育豚及び母豚の全てを含む）への使用も 許可された。米国では、2007 年からブロイラー用飼料に上限 69µg/kg 飼料添加で利用 50 されている。〔参考文献2～5〕 ３ 効果に関する事項 ３－１ 効果を裏付ける野外応用による試験 55 ３－１－１ 豚 【試験①】 生後 28 日齢の平均体重 8.4kg の離乳期子豚 124 頭（Large-White × Landrace × Pietrain）を用い、豚での 25-OH-D3の至適添加量である50μg/kg 飼料に対し、その 0.8 倍量にあたる 40μg/kg 飼料群（2.4～2.8μg/kg 体重/日 ***）を設け、さらに、ビタミン 60 D3を25μg/kg 飼料（1.5～1.75μg/kg 体重/日）、50μg/kg 飼料（3.0～3.5μg/kg 体重/日） 及びビタミン D3 25μg＋25-OH-D3 20μg/kg 飼料（2.7～3.2μg/kg 体重/日）の計 4 群 を設定し、32 日間給餌した。 25-OH-D3投与群とビタミンD3投与群において、１日あたりの増体重、飼料要求率に 有意な差は認められず同様な効果を示した。試験期間を通じて全群でへい死はなかった。 65 〔参考資料1〕 ＊＊＊：日本飼養標準 豚（1998 年版・中央畜産会）「一日当たりの養分要求量」を参照し、算出。以下豚の 試験データで同様に活用した。 【試験②】 70 平均体重 10.7kg の離乳期子豚 72 頭を用い、豚での 25-OH-D3の至適添加量である 50μg/kg 飼料に対し、25-OH-D3の至適添加量の0.5、1、2 倍量にあたる 25、50、100μg/kg 飼料（1.25～1.75、2.5～3.5、5.0～7.0μg/kg 体重/日）に対し、ビタミン D3を 5、25、 50μg/kg 飼料（0.25～0.35、1.25～1.75、2.5～3.5μg/kg 体重/日）の計 6 群を設定し、 各群に2 頭を割当てて 6 反復、35 日間の飼育試験を行った。 75 全群で平均体重、飼料要求率に有意な差は認められず同様な効果を示した。〔参考資 料2〕 - 3 -
【試験③】 育成～仕上げ期の豚（体重 24～110kg）48 頭を用い、豚での 25-OH-D3の至適添加 80 量である 50μg/kg 飼料に対し、25-OH-D3の至適添加量の 0.25、0.5、1 倍量にあたる 12.5、25、50μg/kg 飼料（0.43～0.68、0.80～1.35、1.7～2.7μg/kg 体重/日）に対し、 ビタミン D3を 0、12.5、25μg/kg 飼料（0、0.43～0.68、0.80～1.35μg/kg 体重/日）の 計6 群を設定し、各群に 8 頭を割当てて 84 日間の飼育試験を行った。 全群で平均体重、飼料要求率に有意な差は認められなかった。〔参考資料3〕 85 【試験④】
平均体重162～185kg の母豚（Large White、初産・経産）36 頭を用い、25-OH-D3 の至適添加量にあたる50μg/kg 飼料（0.78～1.56μg/kg 体重/日）に対し、ビタミン D3 を5、50μg/kg 飼料（0.08～0.16、0.78～1.56μg/kg 体重/日）及びビタミン D3 25μg＋ 90 25-OH -D3 25μg/kg 飼料（0.78～1.56μg/kg 体重/日）の計 4 群を設定し、2 反復の効果 試験を行った。 摂餌量、同腹子数や子豚の出産及び離乳時の体重では全群の間に有意な差は認められ なかった。〔参考資料4〕 95 ３－１－２ 鶏（ブロイラー） 【試験①】
36,000 羽のブロイラー（Arbor Acres × Arbor Acres 及び Peterson × Arbor Acres） を用いて、10 飼養試験を、5 試験ずつ 2 箇所の異なる施設で行った。ブロイラーでの 25-OH-D3の至適添加量を 80μg/kg 飼料と推定し、76*μg/kg 飼料（＝4.2～7.5μg/kg 体 100 重/日**）に対し、同用量のビタミンD3群を設定し46～52 日間投与して比較を行った。 25-OH-D3投与群の平均体重は、ビタミンD3投与群と比べ10 試験中 9 試験で有意に 上回り、その平均増加量は40g/羽であった。飼料要求率でも 25-OH-D3投与群がビタミ ン D3投与群と比べ、全試験で平均 0.026/羽（有意差あり）改善した。へい死率におい ては全 10 試験でビタミン D3及び 25-OH-D3投与による差は認められなかった。〔参考 105 文献6〕 *：米トンを通常のトンあたりに換算した値 ＊＊：日本飼養標準 家禽（2011 年版・中央畜産会）「ブロイラーの発育体重および飼料給与量」を参照し、 算出。以下ブロイラーの試験データで同様に活用した。 110 【試験②】 ふ化後1 日目のブロイラー（Ross）を用いて、各群 75 羽で 16 反復の試験を行った。 25-OH-D3の至適添加量を80μg/kg 飼料と推定し、その約 0.4、0.9、1.3 倍量にあたる 34.4、68.8、103.2μg/kg 飼料（2.1～3.7、4.2～7.4、6.3～11.2μg/kg 体重/日）に対し、 ビタミンD3 67.5μg/kg 飼料（4.1～7.3μg/kg 体重/日）を設定し、42 日間投与して比較 115 を行った。 約 68μg/kg 飼料投与での同用量の比較では、25-OH-D3投与群とビタミン D3投与群 - 4 -
の間で平均体重及び飼料要求率の差は認められなかった。25-OH-D3投与群間では、 103.2μg/kg 飼料投与群は、同 34.4μg/kg 飼料投与群及び 68.8μg/kg 飼料投与群に対し 平均体重では、それぞれ1.3％（29g/羽）、1.4％（30g/羽）の体重増加が見られた。〔参 120 考資料5〕 ３－１－３ 鶏（採卵鶏） 24 週齢の採卵鶏（Dekalb、産卵期前期）を用いて各群 10 羽で 9 反復の試験を行っ た。25-OH-D3の至適添加量を80μg/kg 飼料と推定し、その約 0.5、1 倍量にあたる 41.25、 125 82.5μg/kg 飼料（2.3～2.5、4.6～5.0μg/kg 体重/日*）に対し、ビタミンD3 69μg/kg 飼 料（3.8～4.2μg/kg 体重/日）を設定し、224 日間（産卵期中期）投与して比較を行った。 中間測定日（112 日目）において、至適添加量以下であれば、25-OH-D3投与両群間 で産卵率、卵重、体重、飼料要求率に差は見られなかった。ビタミン D3投与群と比較 した場合、飼料要求率において、25-OH-D3投与両群がビタミンD3投与群に対し改善が 130 認められたが、その他の指標では差はなかった。 中間測定日から試験終了時において、同様に至適添加量以下であれば、25-OH-D3投 与両群間での差は見られなかった。飼料要求率では25-OH-D3 82.5μg/kg 飼料投与群が ビタミン D3投与群に対し、改善が認められた。試験期間を通じて全群でへい死は見ら れなかった。〔参考資料6〕 135 ＊：日本飼養標準 家禽（2011 年版・中央畜産会）「卵用鶏育成期の発育体重および飼料摂取量」を参照し、 算出。以下採卵鶏の試験データで同様に活用した。 ４ 残留性に関する事項 140 ４－１ 豚 【試験①】
離乳後2 週目の 6 週齢の雌雄各 24 頭の子豚（German Landrace × Large White× Pietrain ）を 4 群に分け、25-OH-D3の至適添加量である50μg/kg 飼料に対し、その１、 5、10 倍量にあたる 50、250、500μg/kg 飼料（2.2～3.3、11.0～16.7、22.0～33.3μg/kg 145 体重/日）及びビタミン D3 50μg/kg 飼料（2.2～3.3μg/kg 体重/日）を設定し、42 日間 飼育した後、肉、肝臓等の25-OH-D3の濃度を分析した。 飼料への25-OH-D3の添加濃度に比例し、各組織中の25-OH-D3量も増加していく傾 向が見られた。また同用量の25-OH-D3と ビタミン D3投与群を比較した場合、明らか に25-OH-D3投与群が高い傾向が認められた（表1 参照）。〔参考資料 7〕 150 - 5 -
表1 豚の組織中の 25-OH-D3の残留値 組織中の25-OH-D3の残留値（ng/g） ビタミンD3 50μg/kg 飼料 25-OH-D3（μg/kg 飼料） 50 250 500 筋肉 定量限界未満 6.00±1.15 20.38±7.57 26.86±7.81 肝臓 定量限界未満 19.3±4.2 49.8±16.1 87.2±19.5 皮 25.1±4.0 30.0±9.1 88.2±34.6 151.5±56.6 定量限界 筋肉:5ng/g、肝臓:10 ng/g、皮:20 ng/g 【試験②】 155 28 日齢の平均体重 7.9±0.74kg の子豚（Large-White × Landrace）40 頭を 2 群に分 け、25-OH-D3の至適添加量である50μg/kg 飼料（2.2～3.3μg/kg 体重/日）及びビタミ ンD3 50μg/kg 飼料（2.2～3.3μg/kg 体重/日）の添加量で、86 日間飼育した後、各組織 中の25-OH -D3の濃度を分析した。 多くの組織で定量限界未満であったが、皮においてのみビタミンD3投与群が25-OH- 160 D3群に比べ有意に高い残留値を示した（表2 参照）。〔参考資料 8〕 表2 組織中の 25-OH-D３の残留値 組織中の25-OH-D3の残留値（ng/g） ビタミンD3 50μg/kg 飼料 25-OH-D3 50μg/kg 飼料 筋肉 定量限界未満 5.7±0.4 肝臓 定量限界未満 12.3±1.5 腎臓 定量限界未満 13.6±1.4 脾臓 定量限界未満 定量限界未満 腹部脂肪 定量限界未満 定量限界未満 皮下脂肪 定量限界未満 定量限界未満 皮 38.1±12.9 23.8±3.1 定量限界 筋肉:5 ng/g、肝臓・腎臓・脾臓:10 ng/g、脂肪・皮:20 ng/g 165 ４－２ 鶏（ブロイラー） ふ化後1 日目のブロイラー（Ross）にビタミン D3を125μg/kg 飼料（7.4～10.8μg/kg 体重/日）及び 25-OH-D3を100μg/kg 飼料（9.3～13.5μg/kg 体重/日）の添加量で 36 日 間飼育した後、肉、肝臓等の25-OH-D3の濃度を分析した。 全組織で定量限界未満であった（表3 参照）。〔参考資料 9〕 170 - 6 -
表3 鶏（ブロイラー）の組織中の 25-OH-D3の残留値 組織中の25-OH-D3 の残留値（ng/g） ビタミンD3 125 μg/kg 飼料 25-OH-D3 100 μg/kg 飼料 肝臓 定量限界未満 定量限界未満 腎臓 定量限界未満 定量限界未満 筋肉 定量限界未満 定量限界未満 脂肪 定量限界未満 定量限界未満 定量限界 肝臓:10 ng/g、腎臓:10 ng/g、筋肉:5ng/g、脂肪:20 ng/g ４－３ 鶏（採卵鶏） 175 24 週齢の採卵鶏（Dekalb、産卵前期）を用いて各群 10 羽で 9 反復の試験を行った。 25-OH-D3の至適添加量を80μg/kg 飼料と推定し、その約 0.5、1、5、10 倍量にあたる 41.25、82.5、412.5、825µg/kg 飼料（2.3～2.5、4.6～5.0、23～25、46～50μg/kg 体重 /日）に対し、ビタミン D3 69μg/kg 飼料（3.8～4.2μg/kg 体重/日）を設定し、224 日間 （産卵期中期）飼育後、鶏肉、肝臓及び卵等中の 25-OH-D3の濃度を分析した。（表 4 180 参照）。〔参考資料6〕 表4 鶏（採卵鶏）の組織中の 25-OH-D３の残留値 組織中の25-OH-D3の残留値（ng/g） ビタミンD3（µg/kg 飼料） 69 25-OH-D3（µg/kg 飼料） 41.25 82.5 412.5 825.0 卵 10.5±3.0 11.9±6.7 13.2±7.0 24.2±7.9 46.9±9.5 肝臓 7.6±0.9 7.5±1.9 9.2±2.0 25.6±6.0 46.5±18.5 胸肉 2.5±0.8 － 3.4±1.0 8.2±5.2 － 腿肉 3.7±0.7 － 4.6±0.7 14.5±5.9 － 皮+脂肪 10.7±1.9 － 13.5±2.2 44.6±6.2 － －：分析未実施 185 ５ 安全性に関する事項 ５－１ 毒性試験 ５－１－１ 一般毒性試験 ５－１－１－１ 単回投与毒性試験 190 【試験①】 25-OH-D3を50mg 及び 200mg/kg の用量で、9～12 週齢の雌 6 匹のラット （WIST(SPF)）に、強制経口投与し、投与後 14 日間に渡って一般症状の観察を行った。 50mg/kg 投与群では死亡例は認められず、200mg/kg 投与群では投与 5 日目に 1 例の - 7 -
死亡が認められた。〔参考資料10〕 195 ラット：強制経口投与 LD50＞200mg/kg （溶媒：コーン油） 【試験②】 マウス（Upj:TUC(ICR)SPF）雌雄各 5 匹に、25-OH-D3を0、6.3、100、320mg/kg の用量で、腹腔内に単回投与した。 200 3 日目で 320mg/kg 投与群は全頭死亡したが、100mg/kg 以下の投与群では死亡例が なく、結果、LD50 210mg/kg と算出した。〔参考資料 11〕 【試験③】 ラット（Upj:TUC(SD)SPF）雌 5 匹に、25-OH-D3を 0、10、100、320mg/kg の用 205 量で、単回経口投与した。 7 日目まで死亡例がなく、LD50＞320mg/kg とした。〔参考資料 11〕 【試験④】 ラット（Upj:TUC(SD)SPF）雌 5 匹に、25-OH-D3を0、6.3、100、320mg/kg の用 210 量で、腹腔内に単回投与した。 5 日目に 2 匹の死亡例が見られたが、100mg/kg 以下の投与群では死亡例がなく、LD50 ＞320mg/kg とした。〔参考資料 11〕 ５－１－１－２ 反復投与毒性試験（長期） 215 25-OH-D3 0、12、40 及び 120μg/kg/日を、1 群雌雄各 10 匹のラット（Upj： TUC(SD)SPF）に 180 日に渡り混餌経口投与した。結果は以下の通り。〔参考資料 12〕 A. 一般症状：投与に起因する異常は認められなかった。 B. 摂餌量：40 及び 120μg/kg/日投与群では、0 及び 12μg/kg/日投与群に比べて低下 した。 220 C. 体重：投与に起因する異常は認められなかった。 D. 血液学的検査：投与に起因する異常は認められず、全て正常値の範囲であった。 E. 眼検査：投与に起因する異常は認められなかった。 F. 臓器重量：投与に起因する異常は認められなかった。 G. 肉眼的、組織病理学的所見：表 5 参照 225 表5 肉眼的、組織病理的所見 投与量 0µg/kg/日 12µg/kg/日 40µg/kg/日 120µg/kg/日 腎石灰化 5（雌） 5 6 12 尿結石 腎砂 2（雄） 膀胱 2 腎盂 4（雄） 涙腺、唾液腺炎、子宮頚炎 + + + + - 8 -
以上の結果より、無毒性量：12μg/kg 体重/日 ５－１－２ 特殊毒性試験 230 ５－１－２－１ 繁殖試験 25-OH-D3として0、12、40μg/kg/日を、ラット（Upj：TUC(SD)SPF）1 群 10 匹の 雄に交配前60 日及び交配期間中、1 群 20 匹の雌に交配前 14 日、交配期間及び妊娠期 間中に強制経口投与した。対照群には溶媒であるコーン油を投与した。 12μg/kg/日投与群の雌雄の親ラットで、対照群と比べ体重が減少していたが有意差は 235 なかった。40μg/kg/日投与群では対照群と体重増加量は変わらなかった。12μg/kg/日投 与群の１例で 10 匹が死産だったため、25-OH-D3投与群の平均死産児数が対照群に比 べ高値を示したが、用量相関性が認められず、投与の影響とは見なされなかった。〔参 考資料13〕 240 ５－１－２－２ 発生毒性試験 【試験①】 25-OH-D3として0、12、40μg/kg/日を、1 群雌 12 匹のラット（Upj：TUC(SD)SPF） に妊娠6 日目から 15 日目まで強制経口投与した。対照群には溶媒であるコーン油を投 与した。 245 25-OH-D3投与群で、母ラットの体重がわずかに低かった。12μg/kg/日投与群で平均 同腹児数が対照群のそれと比べて少なかったが、40μg/kg/日投与群では差は認められな かった。40μg/kg/日投与群で 4 件の肋骨骨格異常例が報告されたが、1 例の胎児にのみ 集中して認められた。また12μg/kg/日投与群で、頭蓋骨の未発達と第５中手骨欠損が認 められたが、この胎児の体重はわずか 1.9g であった。投与に起因するものとは見なさ 250 れなかった。〔参考資料13〕 【試験②】 25-OH-D3として0、60μg/kg/日を、1 群雌 12 匹のラット（Upj：TUC(SD)SPF）に 妊娠6 日目から 15 日目まで強制経口投与した。対照群には溶媒であるコーン油を投与 255 した。 60μg/kg/日投与群において、対照群と比較し異常胎児の出現率は低いかあるいは変わ らないと考察した。認められた異常は珍しい例ではなく、これまでにも対照群で認めら れているものであった。60μg/kg/日投与群において、1 例のみだが、2.9g の小さな胎児 で泉門が閉鎖されておらず、腰椎中心の不完全な骨化が認められた。肋骨のカーブに異 260 常が見られた例が胎児2 例で見られたが、これらの胎児は上記の小さな胎児と同腹であ った。〔参考資料13〕 【試験③】 25-OH-D3として0、12、40、60μg/kg/日を、1 群雌 20 匹のラット（Upj：TUC(SD)SPF） 265 に妊娠15 日目から 3 週間の授乳期間まで強制経口投与した。対照群には溶媒であるコ - 9 -
ーン油を投与した。
対照群と比較して差は認められず、妊娠、分娩及び授乳時に、また胎児の生存率に投 与に起因する異常は認められなかった。〔参考資料13〕
270
【試験④】
25-OH-D3として0、5、25、50μg/kg/日を、1 群雌 15 匹のウサギ（lagomorpha, Dutch
Belted）に妊娠 6 日目から 18 日目まで強制経口投与した。対照群には溶媒であるコー ン油を投与した。 5μg/kg/日投与群では異常は認められなかったが、25、50μg/kg/日投与群では骨格の 275 異常が有意に認められた。〔参考資料13〕 ５－１－３ 生体内運命に関する試験 ヒナに14 日間ビタミン D3欠乏の飼料を与えた後、3H ラベルした 25-OH-D3又はビ タミン D3を飼料に添加して6 日間与えた。摂餌期間終了後、腸を採取して 5 つに切断 280 して放射能測定を行った。 摂取された 25-OH-D3量の 83.6±2.1％及びビタミン D3量の約66.5±3.3％が吸収され （Net absorption）、両者に有意な差が認められた（p<0.01）。1 日当たり、摂取された ビタミン D3は、その 20％が排泄され、一方 25-OH-D3はその 7％が排泄され、両者に 有意な差が認められた（p<0.01）。〔参考文献 7〕 285 ５－２ 対象家畜等を用いた飼養試験 ５－２－１ 豚 【試験①】
離乳後2 週目の 6 週齢の雌雄各 24 頭の子豚（German Landrace × Large White ×
290 Pietrain ）を 4 群に分け、25-OH-D3の至適添加量である50μg/kg 飼料に対し、その量 の1、5、10 倍量にあたる 50、250、500μg/kg 飼料（2.2～3.3、11.0～16.7、22.0～33.3μg/kg 体重/日）及びビタミン D3を 50μg/kg 飼料（2.2～3.3μg/kg 体重/日）の添加量で、42 日間飼育した（肥育期前期）。 全群で平均体重、飼料要求率に有意な差は認められず同様な効果を示した。血漿中の 295 25-OH-D3濃度は、ビタミンD3 50μg/kg 飼料投与群に対し、25-OH-D3群で3.9 倍、13.7 倍、21.8 倍と添加量に比例して有意に増加していったが、カルシウム濃度は 2.38～ 2.67mmol/L、リン濃度は 3.75～3.97 mmol/L で全群の間に有意な差は見られず、正常 な生理学的値の範囲内であった。剖検、組織病理学的所見及び血液学的性状において 25-OH-D3 50μg/kg 飼料投与群とビタミン D3 50μg/kg 飼料投与群の間に有意な差はな 300 く、また高用量群においても異常は認められなかった。〔参考資料7〕 【試験②】 平均体重 10.7kg の離乳期子豚 72 頭を用いて、25-OH-D3の至適添加量の0.5、1、2 倍量にあたる25、50、100μg/kg 飼料（1.25～1.75、2.5～3.5、5.0～7.0μg/kg 体重/日） 305 - 10 -
に対し、ビタミンD3を5、25、50μg/kg 飼料（0.25～0.35、1.25～1.75、2.5～3.5μg/kg 体重/日）の計 6 群を設定し、各群に 2 頭を割当てて 6 反復、35 日間の飼育試験を行っ た。 血漿中の25-OH-D3濃度は、25-OH-D3、ビタミンD3投与群とも飼料への添加量が増 加するに連れ上昇していったが、同じ添加濃度で比較した場合、25-OH-D3投与群の方 310 がビタミンD3投与群と比較して2.7～2.9 倍量と有意に高い値を示した。カルシウム濃 度は10.0～11.7mg/100ml で、リン濃度は 10.2～12.2mg/100ml であり、全群で正常な 生理学的値の範囲内であった。〔参考資料2〕 【試験③】 315 育成～仕上げ期の豚（体重 24～110kg）48 頭を用いて、25-OH-D3の至適添加量の 0.25、0.5、1 倍量にあたる 12.5、25、50μg/kg 飼料（0.43～0.68、0.80～1.35、1.7～ 2.7μg/kg 体重/日）に対し、ビタミン D3を0、12.5、25μg/kg 飼料（0、0.43～0.68、0.80 ～1.35μg/kg 体重/日）の計 6 群を設定し、各群に 8 頭を割当てて 84 日間の飼育試験を 行った。 320 血漿中の25-OH-D3濃度は、25-OH-D3、ビタミンD3投与群とも飼料への添加量が増 加するに連れ上昇していったが、同じ添加濃度で比較した場合、25-OH-D3投与群の方 がビタミンD3投与群と比較して1.9～2.0 倍量と有意に高い値を示した。カルシウム濃 度は9.75～10.47mg/100ml で、リン濃度は 8.18～10.44mg/100ml であり、全群で正常 な生理学的値の範囲内であった。〔参考資料3〕 325 【試験④】
平均体重162～185kg の母豚（Large White、初産・経産）36 頭を用いて、25-OH-D3 の至適添加量にあたる50μg/kg 飼料（0.78～1.56μg/kg 体重/日）に対し、ビタミン D3 を5、50μg/kg 飼料（0.08～0.16、0.78～1.56μg/kg 体重/日）及びビタミン D3 25μg＋ 330 25-OH-D3 25μg/kg 飼料（0.78～1.56μg/kg 体重/日）の計 4 群を設定し、2 反復の効果 試験を行った。 母豚血漿中の25-OH-D3濃度は、ビタミンD3 50μg/kg 飼料投与群に比べ、25-OH-D3 50μg/kg 飼料投与群で 1 サイクル目で 1.2～2.3 倍量、2 サイクル目で 1.5～2.6 倍量と 有意に高く推移したが、カルシウム濃度は1 サイクル目のビタミン D3 50μg/kg 飼料投 335 与群1 例で差が見られた以外、試験期間中全群で 2.40～2.84mmol/L の範囲で推移し、 リン濃度も同様に1 サイクル目のビタミン D3 5μg/kg 飼料投与群 1 例で差が見られた以 外試験期間中全群で1.82～2.43mmol/L の範囲で推移し、有意な差は認められなかった。 25-OH-D3及びビタミン D3+25-OH-D3投与群の母豚から生まれた子豚の血漿中から のみ 25-OH-D3が検出された（定量限界値 5ng/ml）が、リン及びカルシウム濃度は、 340 両サイクルの子豚全群で有意な差はなく、正常な生理学的値の範囲内であった。〔参考 資料4〕 - 11 -
５－２－２ 鶏（ブロイラー）
345
【試験①】
ふ化後1 日目のブロイラー（Arbor Acres ×Arbor Acres）雌雄各 28 羽/群×5 反復（計 1,120 羽）を用い、25-OH-D3の至適添加量 80μg/kg 飼料に対し、その約 1、3、10 倍 量にあたる76*、228*、760*μg/kg 飼料（4.2～7.5、12.7～22.4、42.4～74.7μg/kg 体重 /日）及びビタミン D3 76*μg/kg 飼料（4.2～7.5μg/kg 体重/日）で、一般的な飼育期間に 350 あたる49 日間飼養した。 ビタミン D3 76μg/kg 飼料投与群と比較して、25-OH-D3投与各群で 3.3～3.7％と有 意な体重増加が見られ、飼料効率も0.4～0.8％改善した。へい死率には各群で差がなか った。 血漿中の25-OH-D3濃度は、ビタミンD3 76μg 投与群に対し、25-OH-D3投与各群で 355 2.8 倍、8.5 倍、18.6 倍と添加量に比例して有意に増加していったが、カルシウム濃度 は10.4～10.9mg/dL の範囲で、全群で類似していた。〔参考文献 8〕 *：米トンを通常のトンあたりに換算した値 【試験②】 360 25-OH-D3の80μg/kg 飼料に対し、25-OH-D3及びビタミンD3を約1、10、50、100、 200 倍量にあたる 76*、760*、3,800*、7,600*、15,200*μg/kg 飼料（4.2～7.5、42～75、 212～374、424～747、848～1,495μg/ kg 体重/日）の添加量で、ふ化後 1 日目のブロ イラー（Ross × Arbor Acres）雌雄各 25 羽/群（計 50 羽/群）×7 反復（群で総計 3,500 羽）に、一般的な飼育期間にあたる49 日間与えた。 365 生育悪化及びへい死が増大したため、25-OH-D3の7,600 及び 15,200μg/kg 飼料投与 群においては22 日目に、同じく 3,800μg/kg 飼料投与群では 31 日目に試験を中止した。 ビタミンD3投与群においても3,800μg/kg飼料以上の投与群で有意な成長抑制が見られ た。 病理組織学検査では、ビタミンD3及び25-OH-D3 76μg/kg 飼料投与群で腎の石灰化 370 がごく僅かに認められたが、大部分は正常範囲内であった。25-OH-D3投与群では、至 適添加量の10 倍量にあたる 760μg/kg 飼料投与群で軽度の石灰化が 36％の割合で見ら れたが、ビタミンD3投与群では、至適添加量の50 倍量にあたる 3,800μg/kg 飼料投与 群において10％の割合であった（表 6 参照）。〔参考文献 8〕 *：米トンを通常のトンあたりに換算した値 375 - 12 -
表6 腎石灰化の発生頻度と程度 ５－２－３ 鶏（採卵鶏） 24 週齢の採卵鶏（Dekalb、産卵期前期）を用いて各群 10 羽で 9 反復の試験を行っ た。25-OH-D3の至適添加量の約0.5、1、5、10 倍量にあたる 41.25、82.5、412.5、825μg/kg 380 飼料（2.3～2.5、4.6～5.0、23～25、46～50μg/kg 体重/日）に対し、ビタミン D3 69μg/kg 飼料（3.8～4.2μg/kg 体重/日）を設定し、224 日間（産卵期中期）飼育した。 中間測定日（112 日目）、試験終了時（224 日目）において、25-OH-D3 825（10 倍） μg/kg 飼料投与群のみ他群に対し、産卵率（-7.0～-0.8％）、卵重(-7.2～-3.7％)、平均体 重(-7.3～-4.1％)、飼料要求率(-15.2～-5.5％)と有意に低い結果を示した。また 412.5（5 385 倍）μg/kg 飼料投与群では、中間日・終了時の産卵率及び飼料要求率が 25-OH-D3 41.25 及び82.5μg/kg 飼料投与群に対し、それぞれ-4.1～-1.0％、-8.7～-3.9％と有意に低かっ た。試験期間中、全群でへい死は見られなかった。投与7 日目及び 112 日目に実施した 病理組織学検査では、ビタミン D3群を含む全群で腎臓に石灰化が認められた。血液学 的性状においては全群で差は認められなかった。〔参考資料6〕 390 ６ その他（ヒトにおける知見） ６－１ 日本人の食事摂取基準 ビタミン D3の主な生理作用は、小腸及び腎臓でのカルシウムとリンの吸収促進作用 395 と骨形成作用で、欠かせない栄養素のひとつである。ビタミンD3は、肝臓で25-OH-D3 に代謝され、続いて腎臓で活性型である1α,25(OH)2D3になる。 多量のビタミン D3摂取を続けると、高カルシウム血症、腎障害、軟組織の石灰化障 害等が起こることが知られている。ビタミン D3摂取量の増加に伴い、血中 25-OH-D3 の濃度は上昇するが、血中25-OH-D3濃度が上昇しても、必ずしも過剰摂取による健康 400 障害が見出されない場合もある。そのため、ビタミンD の過剰摂取による健康障害は、 高カルシウム血症を指標とするのが適当であると考えられている。 我が国では、妊婦を含めた成人におけるビタミン D の耐容上限量（UL）は 50μg/ 日（1.0μg/kg 体重/日）とされている。〔参考文献 9〕 添加量 ビタミンD3群（µg/kg 飼料） 25-OH-D3群（µg/kg 飼料） 76 760 3,800 7,600 15,200 76 760 3,800 7,600 15,200 総羽数 28 28 29 28 59 28 28 66 42 59 微量 5 2 13 7 3 2 16 13 0 0 軽度 0 0 3 16 50 0 10 47 31 49 中等度 0 0 0 2 6 0 1 6 10 10 正常範囲内 23 26 13 3 0 26 1 0 0 0 - 13 -
６－２ 国民健康・栄養調査 405 平成21 年国民健康・栄養調査（平成 23 年 10 月公表）によれば、ビタミン D の摂取 量の平均値は、男性が 8.0μg/日（0.16μg/kg 体重/日）、女性が 7.0μg/日（0.14μg/kg 体 重/日）であった。〔参考文献 10〕 ６－３ 飼料添加物に起因する畜肉及び卵由来の 25-OH-D３の摂取量の推定 410 EFSA の 2009 年評価結果を参考に、我が国における 25-OH-D3の1 日摂取量を推定 した。摂取量は厚生労働省策定の平成21 年度国民健康・栄養調査報告をもとにした。 我が国における25-OH-D3のヒトにおける1 日推定摂取量は、1.00μg（0.02μg/kg 体 重/日）と推定された。 なお、2009 年の EFSA の評価によれば、25-OH-D3のヒトにおける 1 日推定摂取量 415 は、2.44μg と推定された。〔参考資料 14〕 ６－４ EFSA Journal ビタミン D の耐容上限量についての見解(2012)
欧州委員会は、The Panel on Dietetic Products, Nutrition and Allergies (NDA)に対 し、ビタミンD の安全性と耐容上限量の再評価を依頼した。 420 その結果、安全性に関する研究及び欧州14 ヶ国におけるビタミン D 摂取データから、 UL は妊婦及び授乳女性を含む成人に対し、50μg/日から 100μg/日（2μg/kg 体重/日） へ引き上げられた。〔参考文献11〕 ６－５ アメリカでの耐容上限量 425
アメリカのInstitute of Medicine （IOM）は、妊婦を含めた成人で 100μg/日（2μg/kg 体重/日）をビタミン D 耐容上限量としている。〔参考文献 12〕 ７ 審議結果 430 25-OH-D3の効果安全性について審議した結果、至適添加量（豚を対象とする飼料に あっては50µg/kg 飼料、鶏にあっては 80µg/kg 飼料）以下において、25-OH-D3が飼料 添加物として適切に使用される限りについては、25-OH-D3には飼料添加物としての効 果及び安全性があると判断された。 435 ８ 参照（参考文献及び参考資料） 参考文献 １ 岡野登志夫．2000．ビタミン D と疾患－基礎と臨床からの考察－．株式会社医薬 ジャーナル社 14-15, 22-28.
２ Federal Register. 2007. PART 584-food substances affirmed as generally recognized as safe in feed and drinking water of animals. Vol.72, No.51/ Friday, March 16, 2007/Rules and Regulations.
３ EC (European Commission), 2006. The Commission of the European
Communities. Commission Regulation (EC) No 1443/2006 of 29 September 2006. ４ EFSA (European Food Safety Authority), 2009. Safety and efficacy of
25-hydroxycholecalciferol as a feed additive for poultry and pigs. The EFSA Journal (2009) 969, 1-32.
５ EFSA (European Food Safety Authority), 2005. Opinion of the Scientific Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed on a request from the Commission on the evaluation of safety and efficacy of “Hy・D” (calcifediol), based on 25-hydroxylcholecalciferol/25-hydroxy-pre-cholecalciferol, as feed additive in accordance with Council Directive 70/524/EEC. The EFSA Journal (2005) 224, 1-35.
６ Yarger JG, Saunders CA, McNaughton JL, Quarles CL, Hollis BW, Gray RW. 1995. Comparison of Dietary 25-Hydroxycholecalciferol and Cholecalciferol in Broiler Chickens. Poultry Science 74:1159-1167.
７ Bar A, Sharvit M, Noff D, Edelstein S, Hurwitz S. 1980. Absorption and excretion of cholecalciferol and of 25-hydroxycholecalciferol and metabolites in birds. The Journal of Nutrition. 110(10):1930-4.
８ Yarger JG, Quarles CL, Hollis BW, Gray RW. 1995. Safety of
25-hydroxycholecalciferol as a source of cholecalciferol in poultry rations. Poultry Science 74(9):1437-46.
９ 厚生労働省．2015．日本人の食事摂取基準（2015 年版）．170-175 10 厚生労働省．2012．平成 21 年国民健康・栄養調査報告．第１部 56-62 11 EFSA (European Food Safety Authority), 2012. Scientific Opinion on the
Tolerable Upper Intake Level of vitamin D. The EFSA Journal (2012) 10(7):2813 12 IOM(Institute of Medicine). 2010. Dietary reference intakes for calcium and
vitamin D.
参考資料（申請者資料 社外秘）
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3) as source of vitamin D3
for weaner piglets-experiment S3-03 VN. (Report No.2500146)
２ Comparative evaluation of 25-hydroxycholecalciferol (ROVIMIX Hy.DⓇ) and
conventional vitamin D3 in piglets.(Report No.2500405)
３ Comparative evaluation of 25-hydroxycholecalciferol (ROVIMIX Hy.DⓇ) and
conventional vitamin D3 in growing-finishing pigs. (Report No.2500406)
４ Homeostasis of two different sources of vitamin D in sows. (Report No.2500549) ５ To study the possibility of substituting 25-hydroxycalciferol (25-OH-D3) for
vitamin D3 in the feed of broilers. (Study PB-85,Trouw (Toledo))
６ Target animal safety/toxicity of ISOGEN’s HyD in laying hens fed mash feed without medication. (PARC TRIAL NUMBER 97-ISO-02-L).
７ Tolerance evaluation of 25-hydroxycholecalciferol in weaner piglets. (Report No.2500552)
８ Evaluation of the effects of the long term dietary supplementation with 25-hydroxycholecalciferol (Rovimix Hy･DⓇ) on the zootechnical performance
and on the tissue concentration of 25-hydroxycholecalciferol of the pig. (Report No.2500543)
９ Effects of supplementation with vitamin D3 and 25-hydroxycholecalciferol (ROVIMIXⓇ Hy.DⓇ) on growth performance, bone characteristics and tissue
concentrations of 25-hydroxy cholecalciferol in broiler chickens. (Report No.2500547)
10 Acute oral toxicity study in rats.（RCC Study Number 844765） 11 Single dose studies.(U-32,070E)
12 Six months oral toxicity in rats.(U-32,070E) 13 Reproduction studies. (U-32,070E)
14 我が国における 25-ヒドロキシコレカルシフェロール（25-OH-D3）の一日摂取量
推定
飼料及び飼料添加物の成分規格等に関する省令（昭和五十一年農林省令第三十五号）の改正案 別表第２の８ 各飼料添加物の成分規格及び製造の方法等の基準
25-ヒドロキシコレカルシフェロール
25- Hydroxycholecalciferol
ア 製造用原体
(ｱ) 成分規格 含量 本品は、定量するとき、25-ヒドロキシコレカルシフェロール（C27H44O2・H2O）94.0％ 以上を含む。 物理的・化学的性質 ① 本品は、白色の結晶である。 ② 本品は、空気又は光により変化する。 確認試験 ① 定量法により調製した試料溶液及び標準液 20µL につき、定量法の操作条件で液体ク ロマトグラフ法により試験を行うとき、試料溶液及び標準液から得た 25-ヒドロキシ コレカルシフェロールのピークに係る保持時間は一致する。 ② 本品及び 25-ヒドロキシコレカルシフェロール標準品につき、それぞれ赤外吸収ス ペクトル測定法の臭化カリウム錠剤法により測定し、スペクトルを比較するとき、両 者の吸収は、同一波数のところに認められ、これらの吸収の相対強度は等しい。 純度試験 ① エリスロシン* 本品約 1.0 g を 0.01g の桁まで量り、その数値を記録し、10mL の 全量フラスコに入れ、メタノールを加えて溶かし、更にメタノールを標線まで加えて 10mL とし、試料溶液とする。この液につき、メタノールを対照として波長 530nm にお ける吸光度Ａ1を測定する。別に、メタノール 10mL について、試料溶液と同様に操作 し、吸光度Ａ0を測定する。次式によりエリスロシンの含量を求めるとき、その量は、 ５µg/g 以下でなければならない。 ＷT : 本品の採取量（g） ε ： エリスロシンの 530nm におけるモル吸光係数 110,000（L/mol・cm） * ：イオン化したエリスロシン ② 類縁物質 定量法により調製した標準原液５mL を全量ピペットを用いて量り、100mL の全量フラスコに入れ、メタノールを標線まで加えて 100mL とし、純度試験用標準原 液とする。純度試験用標準原液をメンブランフィルター（0.45µm）でろ過し、純度試 験用標準液とする。定量法により調製した試料原液及び純度試験用標準液 20µL につき、 次の条件で液体クロマトグラフ法により試験を行うとき、得られたクロマトグラムを （Ａ1－Ａ 0）／ε×833.9×10 6 ＷT エリスロシンの含量（µg/g） ＝資 料 ７ － ３
- 1 -用い、試料原液のクロマトグラムに現れる各ステロールのピークを本品の参照クロマ トグラムにより同定し、そのピーク面積ＢTを求める。この値と純度試験用標準液のク ロマトグラムから求めた 25-ヒドロキシコレカルシフェロールのピーク面積ＢSから、 試料中の 25-ヒドロキシコレカルシフェロールの類縁物質（この類縁物質とは、25-ヒ ドロキシコレカルシフェロールの製造に由来する 25-ヒドロキシコレカルシフェロー ル以外の各ステロールをいう。）の含量を、次式により計算するとき、それぞれ１％ 以下でなければならない。 本品の参照クロマトグラム 個々の類縁物質の含量（％）＝ ＷT ： 本品の採取量（mg） ＷS ： 25-ヒドロキシコレカルシフェロール標準品の採取量（mg） ＢT ： 試料溶液の各ステロールのピーク面積 ＢS ： 標準液の 25-ヒドロキシコレカルシフェロールのピーク面積 ｐ ： 25-ヒドロキシコレカルシフェロール標準品の純度 Ｆ ： 吸光係数 類 縁 物 質 名 吸光係数 25-ヒドロキシイソタキステロール 0.8300 25-ヒドロキシイソビタミンＤ３ 0.8300 25-ヒドロキシコレカルシフェロール 1.0000 25-ヒドロキシタキステロール 0.9109 25-ヒドロキシ５，６-トランスビタミンＤ３ 0.8986 25-ヒドロキシプロビタミンＤ３ 1.7677 プレ-25-ヒドロキシコレカルシフェロール 2.3863 ｐ× ＷS ×Ｆ×２ ＷT ＢS ＢT × 25 -ヒドロ キシタ キステ ロール プレ -25 -ヒドロ キシ コ レカル シフェ ロール 25 -ヒドロ キシ５ ，６ -トラン スビタ ミンＤ 3 25 -ヒドロ キシ イソ タキ ステロ ール 25 -ヒドロ キシ プ ロビタ ミンＤ 3 25 -ヒドロ キシ イ ソビタ ミンＤ 3 25 -ヒドロ キシ コ レカル シフェ ロール 検出時間（分） 吸光度 - 2 -
未知のステロール* 1.000 * ：25-ヒドロキシコレカルシフェロールと同様な吸収スペクトルを示すピ ーク 操作条件 検出器：フォトダイオードアレイ検出器（測定波長：230～330nm） （類縁物質の定量は、波長 270nm で測定） カラム：内径 4.6mm、長さ 250mm のステンレス管に粒径５µm 以下の液体クロマト グラフ用オクタデシルシリル化シリカゲルを充塡する。 カラム温度：28℃付近の一定温度 移動相：メタノール・アセトニトリル・水混液（55：22：23） 流量：毎分約 1.0mL 測定時間：120 分 カラムの選定：純度試験用標準原液 10mL を 50～55℃で２時間加温し、プレ-25-ヒドロキシコレカルシフェロールを生成させ、メンブランフィルター （0.45µm）でろ過する。このろ液 20µL につき、上記の条件で操作すると き、25-ヒドロキシコレカルシフェロール、プレ-25-ヒドロキシコレカル シフェロールの順に溶出し、その分離度が 4.0 以上のものを用いる。 ③ 鉛 本品 0.5g（0.45～0.54g）を量り、鉛試験法（原子吸光光度法第１法）により 鉛の試験を行うとき、その量は 20µg/g 以下でなければならない。 ④ アルミニウム 本品 0.2g（0.15～0.24g）を量り、白金製又は石英製のるつぼに入 れ、硫酸少量を加えて潤し、徐々に加熱してできる限り低温でほとんど灰化した後、 放冷し、更に硫酸１mL を加え、徐々に加熱して 450～550℃で灰化するまで強熱する。 残留物に少量の硝酸（１→150）を加えて溶かし、50mL の全量フラスコに入れ、水を 標線まで加えて 50mL とし、試料溶液とする。別に、アルミニウム標準液１mL を全量 ピペットを用いて量り、100mL の全量フラスコに入れ、水を標線まで加えて 100mL と する。この溶液１mL を全量ピペットを用いて量り、10mL の全量フラスコに入れ、水を 標線まで加えて 10mL とする。更にこの液４mL を全量ピペットを用いて量り、50mL の 全量フラスコに入れ、少量の硝酸（１→150）を加えた後、水を標線まで加えて 50mL とし、標準液とする。試料溶液及び標準液につき、原子吸光光度法（フレームレス方 式（電気加熱方式））により次の条件で吸光度を測定するとき、試料溶液の吸光度は、 標準液の吸光度以下でなければならない（20µg/g 以下）。 光源ランプ：アルミニウム中空陰極ランプ 分析線波長：309.3nm 乾燥温度：140℃ 灰化温度：900℃ 原子化温度：2,600℃ 水分 5.0％以下（直接滴定） 定量法 本品約 0.20g を 0.001g の桁まで量り、その数値を記録し、200mL の全量フラスコ に入れ、メタノールを加えて溶かし、更にメタノールを標線まで加えて 200mL とし、試 - 3 -
料原液とする。この原液５mL を全量ピペットを用いて量り、50mL の全量フラスコに入れ、 メタノールを標線まで加えて 50mL とし、メンブランフィルター（0.45µm）を用いてろ過 し、ろ液を試料溶液とする。別に、25-ヒドロキシコレカルシフェロール標準品約 0.050g を 0.0001g の桁まで量り、その数値を記録し、50mL の全量フラスコに入れ、メタノール を加えて溶かし、更にメタノールを標線まで加えて 50mL とする。この溶液５mL を全量 ピペットを用いて量り、50mL の全量フラスコに入れ、メタノールを標線まで加えて 50mL とし、標準原液とする。標準原液をメンブランフィルター（0.45µm）を用いてろ過し、 標準液とする。試料溶液及び標準液 20µL につき、次の条件で液体クロマトグラフ法によ り試験を行う。得られたクロマトグラムから 25-ヒドロキシコレカルシフェロールのピ ーク面積を求める。 25-ヒドロキシコレカルシフェロールの量（％）＝ ＷT ： 本品の採取量（mg） ＷS ： 25-ヒドロキシコレカルシフェロール標準品の採取量（mg） ＡT ： 試料溶液の 25-ヒドロキシコレカルシフェロールのピーク面積 ＡS ： 標準液の 25-ヒドロキシコレカルシフェロールのピーク面積 ｐ ： 25-ヒドロキシコレカルシフェロール標準品の純度 操作条件 検出器：紫外吸光光度計（測定波長：270nm） カラム：内径 4.6mm、長さ 150mm のステンレス管に粒径５µm の液体クロマトグラフ 用オクタデシルシリル化シリカゲルを充塡する。 カラム温度：28℃付近の一定温度 移動相：メタノール・アセトニトリル・水混液（55：22：23） 流量：毎分約 1.0mL (ｲ) 製造の方法の基準 Saccharomyces cerevisiaeの５，７，24-コレスタトリエノール生産組換え体を好気的 に培養し、培養を終了した後、培養液を加熱処理し、５，７，24-コレスタトリエノールを 分離する。その後紫外線照射等による化学的工程を経て、製造すること。 (ｳ) 保存の方法の基準 遮光した密封容器に入れ、空気を窒素で置換し、冷所に保存すること。 ×ｐ×400 ＡS ＷT × ＡT ＷS - 4 -
イ 製 剤
(ｱ) 成分規格 本品は、25-ヒドロキシコレカルシフェロール製造用原体に、賦形物質を混和した粉末で ある。 含量 本品は、定量するとき、表示量の 90～120％に相当する 25-ヒドロキシコレカルシフ ェロール（C27H44O2・H2O）を含む。 確認試験 ① 定量法により調製した試料溶液及び標準液 100µL につき、定量法の操作条件で液体 クロマトグラフ法により試験を行うとき、試料溶液及び標準液から得た 25-ヒドロキ シコレカルシフェロールのピークに係る保持時間は一致する。 ② 定量法により調製した試料原液及び標準原液 10µL ずつを薄層クロマトグラフ用シリ カゲル（蛍光剤入り）を用いて調製した薄層板にスポットする。次に、ｎ-ヘキサン・ 酢酸エチル混液（１：１）を展開溶媒として、約 12cm 展開した後、薄層板を風乾し、 紫外線（主波長 254nm）を照射するとき、試料原液及び標準原液から得た 25-ヒドロキ シコレカルシフェロールのスポットの Rf 値は等しい。なお、本品にエトキシキンを酸 化防止剤等として使用している場合、25-ヒドロキシコレカルシフェロールのスポット と別の位置にエトキシキンのスポットが現れる。 乾燥減量 8.0％以下（１g，105℃，４時間） 定量法 本品約 0.35g を 0.001g の桁まで量り、その数値を記録し、100mL の全量フラスコ に入れ、ジメチルスルホキシド 15mL を加え、粉末が見えなくなるまで超音波処理を行う。 液が半透明になったら、酢酸エチルを標線まで加えて 100mL とし、液が落ちつくまで５ 分間静置して、これを試料原液とする。この原液の上澄液３mL を全量ピペットを用いて量 り、100mL の全量フラスコに入れ、イソプロパノール・酢酸エチル・イソオクタン混液 （１：30：69）を標線まで加えて 100mL とし、メンブランフィルター（0.45µm）を用い てろ過し、試料溶液とする。別に、25-ヒドロキシコレカルシフェロール標準品約 0.020g を 0.0001g の桁まで量り、その数値を記録し、200mL の全量フラスコに入れ、メタノー ル 15 mL を加え、20 分間振り混ぜて溶かし、酢酸エチルを標線まで加えて 200mL とする。 これを標準原液とする。この原液３mL を全量ピペットを用いて量り、200mL の全量フラ スコに入れ、イソプロパノール・酢酸エチル・イソオクタン混液（１：30：69）を標線 まで加えて 200mL とし、メンブランフィルター（0.45µm）を用いてろ過し、ろ液を標準 液とする。また、別に、標準液 10mL を 40℃で一晩又は室温で３～４日間放置し、プレ -25-ヒドロキシコレカルシフェロールを生成させ、メンブランフィルター（0.45µm）を 用いてろ過し、ろ液をプレ-25-ヒドロキシコレカルシフェロールの保持時間の確認及び カラムの選定のための分離溶液とする。試料溶液、標準液及び分離溶液 100µL につき、 次の条件で液体クロマトグラフ法により試験を行う。なお、試料溶液中の 25-ヒドロキ シコレカルシフェロール及びプレ-25-ヒドロキシコレカルシフェロールの確認は、標準 液及び分離溶液の保持時間が一致すること又は標準液及び分離溶液を添加してピークの 幅が広がらないことにより行う。 - 5 -25-ヒドロキシコレカルシフェロール（C27H44O2・H2O）の含量（％） ＝ ＷT ： 本品の採取量（mg） ＷS ： 25-ヒドロキシコレカルシフェロール標準品の採取量（mg） ＡT1 ： 試料溶液の 25-ヒドロキシコレカルシフェロールのピーク面積 ＡT2 ： 試料溶液のプレ-25-ヒドロキシコレカルシフェロールのピーク面積 ＡS ： 標準液の 25-ヒドロキシコレカルシフェロールのピーク面積 操作条件 検出器：紫外吸光光度計（測定波長：260nm） カラム：内径 4.6mm、長さ 150mm のステンレス管に粒径５µm の液体クロマトグラフ用 オクタデシルシリル化シリカゲルを充塡する。 カラム温度：室温 移動相：イソプロパノール・酢酸エチル・イソオクタン混液（１：10：89） 流量：毎分 1.5mL カラムの選定：分離溶液 100µL につき、上記の条件で操作するとき、25-ヒドロキシコ レカルシフェロール、プレ-25-ヒドロキシコレカルシフェロールの順に溶出 し、その分離度が 1.5 以上のものを用いる。 (ｲ) 保存の方法の基準 遮光した気密容器に保存すること。 ×25 ＡS ＷT × ＡT1＋ＡT2×2.21 ＷS - 6 -
