VEGF-C siRNA 発現ベクターではマウス乳癌転移を抑制
したが、VEGF-D siRNA ではその作用は発揮されなかった
柴田雅朗
1）・柴田映子
2）・森本純司
3）・斯波真理子
2） 1）大阪保健医療大学大学院 保健医療学研究科 解剖学・病理組織学研究室 2）国立循環器病研究センター研究所 病態代謝部 3）大阪医科大学 実験動物センター 連絡先： 大阪保健医療大学 〒530-0043 大阪市北区天満1丁目9番27号 要 旨【目的】VEGF-C や VEGF-D は VEGFR-3 受容体 を介して、リンパ管新生をもたらすことが知られ ており、ヒトではこれら両分子と乳癌のリンパ節 転移との間に関連性が報告されている。しかしな がら、その一方で、VEGF-Dでは関与しないとの 報告もある。そこでこれら分子の発現をsiRNA によりノックダウンさせることでマウス乳癌転移 に対する抑制作用を検討した。【方法】乳癌細胞 株の BJMC3879Luc2をBALB/c マウス雌に移植 し、週１回、腫瘍内に siRNA 発現ベクター（対 照 群 psiSCR, psiVEGF-C ないしは psiVEGF-D） をエレクトロポレーションにより遺伝子導入し、 実験終了の７週まで実施した。【結果】腫瘍体積 では実験開始の３週より６週まで psiVEGF-C 群 で、対照群に比較して、有意な低下が観察された。 転移ではリンパ節および肺に限らず、総ての臓 器での転移において、psiVEGF-C 群で有意な抑 制が示された。腫瘍内の微小血管密度およびリ ンパ管侵襲では psiVEGF-C 群で有意な低下が観 察された。一方、psiVEGF-D 群では、腫瘍体積、 リンパ節転移や腫瘍内リンパ管侵襲で低下傾向 を示すのみで統計学的な有意差は示されなかっ た。【結論】マウスVEGF-Cに対するsiRNA 発現 ベクターは、乳癌転移に対して、抑制効果を発 揮した。しかしながら、psiVEGF-D では明らか な転移の抑制効果は発揮されず、転移抑制作用 はあっても弱いものと推察された。 はじめに 日本の国立がんセンター・がん対策情報セン ターによれば、2010 年では乳癌の罹患数は全て の癌のうち１位で、2012 年の統計報告では乳癌 による死亡率は第 5 位である1）。現在のところ、 日本では、乳癌は年間に罹患数約 4 万人、死亡数 約1万人といわれており、2020 年までの我が国の 女性乳癌患者の罹患数は5 万人になると試算され ている。乳癌患者の死因の殆どは肺、リンパ節な どへの転移によるものであり、癌転移を克服する 事こそが延命効果につながると考えられる。癌細 胞はリンパ管を介したリンパ行性転移、血管を介 した血行性転移あるいは播種性転移がある。癌 細胞の浸潤や転移を司るシグナルを遮断すること が出来れば、転移の抑制につながり、延命をもた らすものと考えられる。従って、乳癌の転移抑制 に対する低毒性の治療法の開発に期待は大きい。 VEGF ファミリーは 血 管 新 生 因 子 で あり、 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E に加えて胎盤成長因子（PIGF）がある。中でも VEGF-A は癌など多くの病的血管新生に関与し、 疾患を増悪させる。VEGF-C および VEGF-D は ともに強力なリンパ管新生因子であり、様々な 正常組織で発現が認められている。しかしなが ら、乳癌を含む様々な悪性腫瘍においても、腫 瘍細胞自身が VEGF-C ならびに VEGF-Dを過剰 に発現していることが報告されている2 ）3 ）。乳 癌患者では、VEGF-C や VEGF-D の過剰発現と 予後不良やリンパ節転移には強い相関が示され
ている3 ）, 4 ）。また、実験動物を用いた研究にお いても、これら因子の過剰発現がリンパ節転移 に対して促進的に作用することが報告されてお り5 ）-8 ）、これらの事 実は、VEGF-C や VEGF-D が転移阻止に対する治療的戦略のターゲットに なり得ることを示唆している。現実に著者らは VEGF-C siRNA の発現ベクターを用いて、実験 的乳癌の転移を抑制した9 ）。その一方で、ヒト 乳癌において、VEGF-Dとリンパ節転移には関 連性がないとの報告もある10 ）。 RNA 干渉を用いた遺伝子ノックダウンは、 small interfering RNA（siRNA）を用いることに より哺乳類細胞にも適応可能であることが示さ れ、遺伝子解析の一般的ツールとして広く用いら れるようになった。また、最近では合成 siRNA が治療薬として有用であることを示しており、遺 伝子配列から治療薬合成が可能であるという期 待感を高めている。本研究では、リンパ行性転移 の阻止を狙って、VEGF-C あるいは VEGF-Dに 対するsiRNAをそれぞれ発現ベクターに組み込 み、乳癌転移の抑制効果を追究した。なお、更 なる抗腫瘍効果の増強を目指して、以前の研究 で著者らの用いたVEGF-C siRNA 配列とは違っ た配列で試みた。なお、この研究成果の詳細は Original article11）に掲載されている。 材料と方法 １．乳癌細胞株 マウス乳癌細胞株 BJMC3879Luc2（ルシフェ ラーゼ遺伝子を安定的に組み込んだもの）を用い た。本細胞株を同系マウスに移植するとリンパ節 や肺に高率に転移を示し12 ）、ヒト乳癌と極めて 類似した転移スペクトラムを示すモデルである。 ２．有効な siRNA 配列の決定 マ ウ ス VEGF-C（VEGF-C1 ～ C4 ）あ る い は VEGF-D（VEGF-D1 ～ D4 ）に 対 するそれ ぞ れ ４ 種 類 の siRNA 配 列 を Qiagen 社 の 有 す る ア ルゴリズムを用いてデザインした。次いで、 BJMC3879Luc2 乳癌細胞にカチオン性脂質の遺 伝子導入試薬（HiPerFect、Qiagen 社）を用いて、 それぞれ遺伝子導入した。対照としては、ヒト にもマウスにも相補性を示さないスクランブル siRNA 配列を用いた。遺伝子導入の 24 時間後 にリアルタイム RT-PCR を用いて（LightCycler; Roche 社）、VEGF-C な ら び に VEGF-D の 発 現 レベルを解析（ΔΔCT 法）した。その結果、約 70％近いノックダウン効率を示した VEGF-C１ と VEGF-D1 の塩基配列を選択し、siRNA の発 現ベクター（Takara Bio 社）に組み込み、実験に 用いた。
３．In vivo siRNA 遺伝子治療
6 週齡のBALB/c 系雌マウス（日本 SLC）の鼠 径乳腺部皮下にBJMC3879Luc2 細胞を移植し、 腫瘍径が約0.3～0.5㎝になった時点で、VEGF-C siRNA 発 現 ベ ク タ ー（psiVEGF-C）、VEGF-D siRNA 発現ベクター（psiVEGF-D）あるいは対 照としてスクランブル配列を有したベクター （psiSCR）を週1回の割合で７週間、腫瘍内に注 射し（腫瘍の大きさに応じて50～75μｇ）、遺伝 子導入した（CUY650-10、ネッパジーン社）。遺 伝子導入は100V、20msec/1パルス、8 パルス反 復の条件で行った。毎週、体重と乳腺腫瘍のサ イズを個体別に測定した。乳腺腫瘍はデジタル 式キャリパスで短径と長径を計測し、その体積を 長径×（短径）2×0.4の算出式で求めた13 ）。実験 開始の７週経過中には、マウス１匹当たり3㎎の D-ルシフェリン（和光純薬工業）を腹腔内投与し、 イソフルレン吸入麻酔下にて、Photon Imager （Biospace 社）を用いて、生体発光イメージング を行った。得られた発光シグナルをPhotovision software（Biospace 社）で解析した。実験開始の ７週経過後には、全生存動物を屠殺剖検し、乳 腺腫瘍を摘出し、10% 緩衝ホルマリン溶液にて固 定した。肺およびリンパ節（腋窩部、大腿部）を 採取し、更に肉眼病変部と異常の見られたリンパ 節についても採取し、病理組織学的に検索した。 ４．腫瘍内リンパ管侵襲および微小血管密度の 定量 リンパ管内皮のマーカーであるpodoplanin を免疫組織学的に染色し（抗 podoplanin 抗体 ; AngioBio 社）、腫瘍内のリンパ管を観察し、癌 細胞の侵襲を受けた腫瘍内リンパ管の数を算出 した14 ）。また、血管内皮のマーカーであるCD31 を免疫組織学的に染色し（抗 CD31 抗体 ; Lab Vision 社）、陽性を示した腫瘍内の微小血管密度
を算定した15 ）。 ５．統計学的解析 定量的データにおける２群間の平均値の差の 解析には Student のt 検定を行った。発生頻度の 解析にはFisherの正確確率検定を用いた。 結 果 In vivo siRNA 遺伝子治療 〈腫瘍サイズ〉腫瘍体積は、psiVEGF-C および psiVEGF-D 群 に お い て、 対 照 群（psiSCR）と 比較して、遺伝子導入の３週後より抑制が観 察され、６週まで観察された（図１）。しかし、 psiVEGF-D 群では、実験期間を通して抑制傾向 のみで有意差は示されなかった。 〈 生 体 発 光 イメー ジ ン グ 〉psiVEGF-C および psiVEGF-D 群では、対照群と比較して、移植し た乳癌の大きさは小さい傾向にあり、また、転移 の拡がりもこの両者の治療群で抑制傾向にあっ たが、特に psiVEGF-C 群では明らかであった。 〈 病理組 織学的検索 〉リンパ節転移は、対照 の psiSCR 群 で は 全 例 に 転 移 を 観 察 し た が、 psiVEGF-C 群では 60％に転移を認め、マウス１ 匹当たりのリンパ節転移個数で有意な抑制が観 察され た（図 2A）。肺 では、psiVEGF-C 群 で、 対照群と比較して、マウス１匹当たりの肺の転移 巣（ 250μｍ以上の転移巣）の数で有意な抑制が 図１ 柴田ほか 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 0 1 2 3 4 5 6 7 腫 瘍 体 積 (m m 3) 実験週 psiSCR psiVEGF-C psiVEGF-D
**
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**
**
図 1 腫 瘍 体 積 は、psiVEGF-C 群 お よ び psiVEGF-D 群において、対照群の psiSCR と比較して、実験期間を通して抑制が示さ れた。psiVEGF-C 群では、実験開始の３～ ６週まで統計学的な有意差が観察されたが （**P ＜ 0.01 ）、psiVEGF-D 群 で は 抑 制 傾 向 のみで有意差は認められなかった。 A B C 図２ 柴田ほか 0 20 40 60 80 100psiSCR psiVEGF-C psiVEGF-D
マ ウ ス １ 匹 当 た り の 平 均 の 肺 転 移 巣 （250 mm 以 上 ） の 数
*
0 3 6 9 12 15 18psiSCR psiVEGF-C psiVEGF-D
マ ウ ス １ 匹 当 た り の 平 均 の リ ン パ 節 転 移 数
*
0 5 10 15 20 25psiSCR psiVEGF-C psiVEGF-D
マ ウ ス １ 匹 当 た り の 平 均 の 総 転 移 数
*
図２ A: マウス１匹当たりの平均のリンパ 節転移数。対照群（psiSCR）と比較して、 psiVEGF-C 群では有意な低下が示されたが （*P ＜ 0.05 ）、psiVEGF-D 群では抑制傾向の みで有意差は認められなかった。B: マウス １匹当たりの平均の肺転移巣（肺転移巣の サイズが 250 μｍ以上）の数。対照群と比較 して、psiVEGF-C 群では有意な低下が示さ れたが（*P ＜ 0.05 ）、psiVEGF-D 群では抑制 傾向のみで有意差は観察されなかった。C: マウス１匹当たりの平均の総転移数。対照 群と比較して、psiVEGF-C 群では有意な低 下が観察されたが（*P ＜ 0.05 ）、psiVEGF-D 群では抑制傾向のみであった。観察された（図 2B）。なお、psiVEGF-D 群では リンパ節および肺転移ともに、抑制傾向を示す のみであった（図 2A, B）。転移はリンパ節や肺 以外にも、腎臓、副腎、卵巣、子宮にも転移が 観察され、マウス１匹当たりの総転移数でみると、 やはり、psiVEGF-C 群で有意な抑制が観察され たが、psiVEGF-D 群では明らかな抑制は示され なかった（図 2C）。 〈微小血管密度および腫瘍内のリンパ管侵襲〉 抗 CD31 抗体を用いて、乳腺腫瘍組織内の新 生血管を免疫組織学的に染色し、腫瘍内の微 小血管密度を求めた結果、対照群と比較して、 psiVEGF-C 群で有意な低下が観察された（図 3A）。また、抗 podoplanin 抗体を用いて、乳腺 腫瘍内のリンパ管を免疫組織学的に染色・観察 したところ、リンパ管の内腔に癌細胞を頻繁に 観察した（図 3B）。このような癌細胞の侵襲を受 けたリンパ管の数を定量解析した結果、対照群 と比較して、全ての siRNA 治療群で低下が観察 されたが、psiVEGF-D 群では統計学的な有意差 は示されなかった。 考 察 本研究では、VEGF-CとVEGF-Dのそれぞれ に対するsiRNA 発現ベクターを用い、高転移 性のマウス乳癌モデルに対して遺伝子導入を行 い、乳癌の転移抑制効果を検討した。その結果、 psiVEGF-C 群では腫瘍増殖（腫瘍体積）の有意な 抑制、リンパ節および肺への転移抑制が示され、 さらにこれらの臓器に限らず、広範囲の臓器の転 移を抑制した。psiVEGF-Dではある程度の腫瘍 増殖に対する抑制傾向は見られたが、転移抑制 効果は示されなかった。 VEGF-C や VEGF-D の 発 現 は、 乳 癌 を 含 む 様々なヒト2 ）3 ）や実験動物8 ）16 ）の腫瘍において、 リンパ節転移と強く関わっている。マウス乳癌 モデルにおいても、siRNAによりVEGF-C 発現 を阻害すると9 ）17 ）、あるいは抗 VEGF-D 抗体を 投与すると8 ）、リンパ節転移や肺転移が抑制さ れることが示されている。また、VEGF-R3は VEGF-C および VEGF-Dの受容体であるが、可 溶性 VEGF-R3でこれらの分子間の相互作用を阻 害すると、やはりリンパ節転移は抑制されること が報告されている18 ）。しかしながら、本実験で は psiVEGF-Cでは著しい転移抑制作用を発揮し たが、psiVEGF-Dではある程度の抗腫瘍効果は 観察されたものの、明らかな転移抑制作用は示 されなかった。VEGF-Cとは対照的に、VEGF-D では判然としない研究結果が散見される。少な くとも１つの乳癌の臨床研究において、VEGF-D とリンパ節転移の関連性を否定している10 ）。ま た、乳癌において、VEGF-A および VEGF-C が 乳癌の予後に有用であるとする一方、VEGF-D では予後因子にならないとする報告もある19 ）。ま た、ごく最近の研究では、腫瘍細胞が分泌する VEGF-Cのみが転移前のセンチネルリンパ節にお けるリンパ管新生を誘導すると報告している20 ）。 図３ 柴田ほか A B 0 5 10 15 20 25
psiSCR psiVEGF-C psiVEGF-D
リ ン パ 管 侵 襲 を 受 け た 腫 瘍 内 の リ ン パ 管 の 平 均 個 数
*
0 5 10 15 20 25 30psiSCR psiVEGF-C psiVEGF-D
腫 瘍 内 の 微 小 血 管 密 度
*
図 3 A：乳癌組織内の微小血管密度。対照 群（psiSCR）と 比 較 し て、psiVEGF-C 群 では有意な低下が示されたが（*P ＜ 0.05 ）、 psiVEGF-D 群では明らかな差異は認めら れ な か っ た。B： 乳 癌 組 織 内 の リ ン パ 管 侵襲を受けたリンパ管の平均個数。対照 群（psiSCR）と 比 較 し て、psiVEGF-C 群 では有意な低下が示されたが（*P ＜ 0.05 ）、 psiVEGF-D 群では抑制傾向のみで有意差は 認められなかった。本研究において、癌細胞によるリンパ管侵襲を 受けたその数は、対照群と比較して、psiVEGF-C 群で有意な低下が観察され、これは癌細胞が腫 瘍内リンパ管に侵入する段階を抑制していること を示唆している。しかしながら、psiVEGF-D 群 では抑制傾向は示されるものの、有意差は示さ れなかった。また、腫瘍内の血管新生において も、psiVEGF-C 群で有意な低下が観察された。 VEGF-Cはリンパ管新生因子であるが、実際に血 管新生を誘導する21）という報告がある。その作 用機序は VEGF-C が VEGF-R2（VEGF-Aに対す る受容体）を活性化するためと考えられる22 ）23 ）。 psiVEGF-D 群では腫瘍内の血管新生の抑制作用 は示されなかった。このように psiVEGF-Dでは リンパ管新生に対する抑制効果が弱く、かつ血 管新生に対して抑制作用を有しないことが、明ら かな転移抑制に繋がらなかった要因の一つと考 えられる。 以上、VEGF-Cを標的とした siRNA 発現ベク ターはリンパ節や肺を含む広範囲の癌腫の転移 を強く抑制し、この事実は延命効果につながり、 臨床的に極めて意義のある所見であると考える。 しかしながら、psiVEGF-Dでは明らかな転移の 抑制効果は発揮されず、転移抑制作用はあって も弱いものと推察された。 謝辞ほか 本研究は、文科省科学研究費基盤Ｃ（２）（課題 番号17591360 ）の助成により実施された。 文 献 1. 国立がんセンターがん対策情報センター : 日本の最新がん統計まとめ（ 2012 年） http://ganjoho.jp/public/statistics/pub/ statistics01.html
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