ELISPOT 法による結核の診断および治療経過の 評価法としての可能性
横浜市立大学大学院医学研究科病態免疫制御内科学
村上 修司 岳野 光洋 小林 正芳 工藤 誠 綿貫 祐司 金子 猛 石ヶ坪良明
（平成 20 年 6 月 10 日受付）
（平成 21 年 3 月 2 日受理）
Key words : Mycobacterium Tuberculosis, Tuberculin skin test（TST）, Enzyme-linked immunospot（ELISPOT）
要 旨
ELISPOT 法により結核菌特異的 IFN-γ を検出する方法は免疫学的結核診断法として期待されている．わ れわれは ELISPOT 法による結核診断の有用性と，治療奏効症例における抗原特異的反応の経過を検討した．
対象は健康若年者，臨床的に結核感染を診断された患者で，ELISPOT 法により各々刺激抗原 PPD，ESAT-6，
CFP-10 特異的 IFN-γ 産生細胞数を測定した．その結果，① ELISPOT 法により検出された PPD 特異的 IFN- γ 産生細胞数およびツベルクリン反応の結果は有意に相関した．② 94％ の結核患者で ESAT-6 もしくは CFP-10 のいずれかが陽性であった．③良好な治療経過を示した結核患者では経過中に ESAT-6 特異的 IFN- γ 産生細胞数は減少した．
以上より，ELISPOT 法は有効な結核感染の免疫学的診断方法であり，抗結核療法の奏功の有無を評価で きる手法としても期待された．
〔感染症誌 83：229〜235，2009〕
序 文
結核は全世界で新規登録患者が年間 880 万人にのぼ り，いまだに世界の人々の健康を脅かす最大の感染症 である
１）．2006 年の日本における結核新規登録患者数 は人口 10 万人対 20.6 と減少傾向にあるものの，先進 諸国の中では依然として高い状況にある
２）．
標準的な結核の診断は問診や理学所見に続いて胸部 X 線写真および，抗酸菌塗抹，培養，核酸増幅法によ る Mycobacterium tuberculosis（MTB）を検出するこ とによる．結核菌塗抹検査は重要であるが，喀痰塗抹 陽性肺結核罹患率は人口 10 万対 8.2（肺結核患者の 50.3％）と，その感度が低いため診断に苦慮する患者 も多い
２）．塗抹陽性率は，喀痰培養陽性肺結核の 40〜
70％ であるとの報告もある
３）．肺外結核では MTB の 証明はさらに困難である．
補助診断法としてのツベルクリン反応（ツ反）は，
診断感度は優れているものの，その特異度については 議論のあるところである．ツ反で用いられている puri- fied protein derivative（PPD）は，Bacillus Calmette- Gu rin（BCG）や非結核性抗酸菌の抗原と高い類似 性を持ち，BCG もしくは非結核性抗酸菌感染による ツ反の陽性を結核感染と鑑別することが極めて困難な 場合も多い
４）．さらにわが国では BCG を接種してお りツ反の陽性が BCG によるものか，結核感染による ものかの判定は困難である．
しかし，近年 BCG もしくは非結核性抗酸菌と交叉 反応を示さない結核菌特異的抗原である early secre- tory antigenic target-6（ESAT-6）と culture filtrate protein-10（CFP-10）を抗原として抗原特異的 T 細胞 から放出される interferon（IFN）― γ を測定する免疫 学的診断法として QuantiFERON TB-2G（Cellesits 社，
以下 QFT と略）と T-SPOT.TB（Oxford Immunotec）
が開発された
５）〜８）．2 つの方法は共に肺結核の診断に おいて高い特異度があると報告され，すでに臨床応用 されている．日本でも QFT は保険収載されているが，
原 著
別刷請求先：（〒236―0004）横浜市金沢区福浦 3―9 横浜市立大学大学院医学研究科病態免疫制御内
科学 石ヶ坪良明
未だカットオフ値については議論の余地がある．最近 の 報 告 で は 免 疫 抑 制 患 者 や 高 齢 者 に お い て は T- SPOT.TB の感度が優れているとされている
６）８）９）．本 論文では T-SPOT.TB で使用されている ELISPOT 法 により研究室レベルで T-SPOT.TB を再現し，臨床的 に結核と診断された患者に応用し，その有用性を確認 した．また T-SPOT.TB での推奨されている Cut-off 値の妥当性と日本における至適 Cut-off 値を検討した．
対象と方法
1．対象
2005 年 4 月から 2007 年 3 月までの間に，横浜市立 大学附属病院および神奈川県立呼吸器病センターに て，細菌学的に結核の診断がなされた 35 例（女性 11 例，男性 24 例，平均年齢 59.1±16.5 歳）の結核感染 症の患者および健康対照群として横浜市立大学の 43 名の健康な学生とを対象とした．また至適 Cut-off 値 の検討においては 52 例の結核の治療歴の無い非結核 中高年齢者（平均年齢 53.8±10.8 歳）を対象とした．
本研究は横浜市立大学附属病院の倫理委員会で承認を 受け，これらの対象者から文書で同意を得た．
2．ツベルクリン反応
ツベルクリン反応は PPD（Purified protein deriva- tive）（日本ビーシージー，東京）液 0.1mL を前腕屈 側部に皮内注射し，注射後 48 時間に局所の反応によ り判定を行った．判定は結核予防法施行規則第 2 条
（2005 年に廃止）に従い，発赤長径が 0〜9mm を陰性
（−），10mm 以上を陽性とし，陽性の中で発赤のみの ものを弱陽性（＋），硬結を伴うものを中等度陽性
（＋＋），二重発赤や水疱，潰瘍，出血などを伴うもの を強陽性（＋＋＋）とした
１０）．
3．ELISPOT 法
Mycobacterium tuberculosis（MTB）特異的蛋白であ る ESAT-6，CFP-10 および非特異的蛋白である PPD を抗原とし，対象患者より得られた末梢血単核細胞
（PBMC）中の抗原特異的 T 細胞から産生される IFN-γ を ELISPOT 法により検出した
１１）１２）．以下，方法につ いて略述する．検体はヘパリン管を用いて採血後，6 時間以内にフィコール遠心法による PBMC の分離を 行い保存用チューブに分注した後，測定まで−80℃
にて凍結保存した．当院で入院時の抗酸菌塗沫検査で 陽性で，なおかつ 2 度目の採血の同意が得られた 9 名 の患者については，抗酸菌塗沫陽性時と陰性時にそれ ぞれ採血した．また，1 例の治療抵抗症例において 2 度目の採血を行った．その他の症例では 1 回のみの採 血を行った．凍結保存された検体を解凍後，円底ラウ ンドチューブ内で 10％ ウシ胎児血清（FCS）を含む RPMI 1640 培養液で一定細胞数（10
5cell ! well）に調 節し PPD（5µg! mL），ESAT-6（5µg! mL）および CFP-
10（5µg! mL）を添加し 37℃，5％ 炭酸ガス加湿下で 2 時 間 培 養．そ の 後 2.5 µ g ! mL の 抗 ヒ ト IFN- γ 抗 体
（MABTECH AB，Sweden）を コ ー テ ィ ン グ し た polyvinylidene fluoride（PVDF）膜等で底を覆った 96 穴培養プレート（Millipore，Bedford，IP）に移し変 え，さらに 37℃，5％ 炭酸ガス加湿下で 16 時間培養 する．洗浄により細胞除去した後，0.67 µ g ! mL のビ オチン化 IFN-γ 抗体（MABTECH AB）を添加．さ らに洗浄後，ALP 標識ストレプトアビジン（Vector，
Burlingame，CA）を添加．結核感染者のリンパ球か ら分泌された IFN- γ は分泌細胞周囲の PVDF 膜上の 抗ヒト IFN-γ 抗体と結合し，酵素基質（BCIP! NBT
（Kirkegaard and Perry，Gaithersburg，MD））によ り抗原特異的 T 細胞より産生された IFN-γ を可視化 する．IFN- γ 産生細胞数は ELISPOT リーダー（Carl Zeiss，Aalen-Oberkochen，Germany）お よ び KS ELISPOT ソフトウエアにより解析され，結核感染を 診断した．
4．統計処理
有意差検定には Mann-Whitney U 検定および t 検 定を用いた．P 値が 0.05 未満を有意とした．Receiver operating characteristic（ROC）曲線を用い，ESAT-6 および CFP-10 特異的 IFN-γ 陽性細胞数の結核感染の 診断における Cut-off 値，Cut-off 値における感度・特 異度，曲線によって下方に囲まれる面積 area under the curve（AUC）を算出し，ELISPOT 法の有用性 について検討した．
結 果
1．患者背景
対象となった結核患者 35 人中男性が 24 人，女性が 11 人と男性が多かった．平均年齢は 59.1±16.5 歳で あった．入院時の血清 Alb（g! dL）は 3.4±0.7 であっ た．リ ン パ 球 数（! mL）は 1,230±701 で，CD4 陽 性 リンパ球数（ ! mL）は 474±380 で低下している者が 多かった．HIV 感染症でフォローアップ中の患者は 2 例であったが，入院時に CD4 陽性リンパ数に低下が 認められた患者に対して HIV 抗体検査施行し，さら に 2 例の HIV 陽性が確認され，合わせた 4 例が HIV 陽性であった（Table 1）．対象となった非結核中高年 齢者の平均年齢は 53.8±10.8 歳で，結核患者の平均年 齢と有意な差を認めなかった．
2．健 常 人 お よ び 結 核 患 者 に お け る PPD 特 異 的 IFN- γ 産生細胞数
健常人 43 人に対して行われたツベルクリン反応で，
4 人が陰性，弱陽性が 5 人，中等度陽性が 13 人，強
陽性が 21 人と判定された．一方 ELISPOT 法により
検出された PPD 特異的 IFN- γ 産生細胞数は，ツ反陰
性者，弱陽性者，中等度陽性者，強陽性者でそれぞれ，
Fig. 1 Relationship between tuberculin skin test(TST)resultsand frequency ofpurified protein derivative (PPD) specific interferon- gamma (IFN-γ) secreting cells in peripheral mononuclearcells(PBMC).The frequency of IFN-γ secreting cells in PBMC stimulated with PPD was determined by the enzyme- linked immunospot assay (ELISPOT). The number of antigen-specific IFN-γ secreting cells was calculated by subtracting back- ground counts. Relationship between TST magnitude and numberofPPD-specificIFN- γsecreting cellsin bacillide Calmette-Guérin (BCG)healthy vaccinated individuals(n＝ 43) and patientswith tuberculosis(TB)(n＝ 35). Healthy individuals were further classified into 4 categories by the Japan national guideline:negative (－ ):＜ 10 mm oferythema (n＝ 4),weakly positive (＋ ):＞ 10 mm ofery- thema (n＝ 5),moderately positive (＋ ＋ ):＞ 10 mm oferythema with iduration (n＝ 13), strongly positive (＋ ＋ ＋ ): ＞ 10 mm of ery- thema with double rednessand bleb (n＝ 21).
＊＝ p＜ 0.0001,＊＊＝ p＜ 0.001,＊＊＊＝ p＜ 0.01 determined by the Mann-Whitney U test.
Fig. 2 Receiveroperating characteristic(ROC) curves of early secretory antigen target 6 (ESAT-6)and culture filtrate protein 10 (CFP- 10) specific interferon-gamma (IFN-γ) secret- ing cellsdetermined by the ELISPOT forTB detection.
Table 1 Profiles of participants with Tuberculosis
No.(% oftotal) 35 Total
59.1±16.5 Mean age±SD (years)
Gender
(68.6) 24 Male
(31.4) 11 Female
Pre-existing condition
(31.4) 11 Age＞ 70
(20) 7 Cancer
(20) 7 Diabetes
(11.4) 4 HIV infection
(2.9) 1 Hemodialysis
10
5PBMC 対 2.6±1.8 spot，5.7±1.6 spot，10.4±6.5 spot，15.1±10.7 spot とツ反の判定と一致して増加を 認めた（Fig. 1）．さらに，結核患者における PPD 特 異的 IFN-γ 産生細胞数は明らかに，ツ反強陽性健常人 よりも高値であった（平均 45 vs 15 spot ! 10
5PBMC，
p＝0.0059）．しかし，ツ反による判定と同じく PPD 特異的 IFN-γ 産生細胞数では BCG 接種による反応と 結核感染による反応を明確に区別することは困難で あった．
3．ELISPOT 法の感度と特異度
結核患者における ESAT-6 特異的 IFN-γ 産生細胞 数は平均 21.7±35.2 spot! 10
5PBMC で，CFP-10 特異 的 IFN-γ 産生細胞数は平均 32.6±43.0 spot! 10
5PBMC と，ESAT-6 特異的細胞数よりも CFP-10 特異的細胞 数の方が高値であった．非結核中高年齢者の平均陽性 細胞数は ESAT-6，CFP-10 でそれぞれ 1.4，2.4 spot!
10
5PBMC であった．ELISPOT 法による結核感染患
者と非結核高中齢者を鑑別するため，至適 Cut-off 値
を ROC 曲線により解析した．ROC 曲線より得られた
AUC は，ESAT-6，CFP-10 で そ れ ぞ れ 0.888，0.857
であった（Fig. 2）．それぞれの Cut-off 値は，ESAT-6
特異的 IFN-γ 産生細胞数が 5 spot! 10
5PBMC とした
時，感度 77.1％ で特異度 88.5％ となり，CFP-10 特異
的 IFN- γ 産生細胞数が 8 spot ! 10
5PBMC とした時，感
度 71.4％ で特異度 92.2％ であった．またいずれか一
方の陽性を検査陽性とした場合は，ESAT-6 特異的
IFN-γ 産生細胞数が 5 spot! 10
5PBMC，CFP-10 特異
的 IFN- γ 産生細胞数が 10 spot ! 10
5PBMC が至適 Cut-
off 値となり，感度は 94％（33! 35），特異度は 85％（44!
Fig. 3 Frequency ofESAT-6 and CFP-10-specificinterferon-gamma (IFN-γ)secreting cellsdetermined by ELISPOT in PBMC from students,patientswith active tuberculosislesionsand middle-aged individuals withoutTB.
Fig. 4 Frequency of Mycobacterium tuberculosis-antigen-specific IFN-γ secreting cells before and after treatmentin 9 patientswith TB
52）であった．非結核中高年齢者において 15％ で陽 性者が認められた．T-SPOT.TB における推奨 Cut-off 値は ESAT-6，CFP-10 ともに 5 spot ! 2.5×10
5PBMC となっている．この Cut-off 値とした時の陽性 率 は 100％（35! 35）であったが，非結核中高年齢者での陰 性率は 55％（28! 52）と低値であった（Fig. 3）．細菌 学的に結核と診断された患者のうち，2 例において偽 陰性の結果であった．1 例目は 92 歳のリウマチ性多 発筋痛症を基礎疾患に持ちステロイド内服薬による治 療を受けていた．CD4 陽性リンパ球数が 196（! mL）
と低下し，血清 Alb は 3.3（g! dL）とやや低下が認め られた．2 例目は 70 歳のシェーグレン症候群を基礎 疾患に持ち，CD4 陽性リンパ球数が 389（! mL）と低 下していたが，血清 Alb は 4.0（g! dL）で低下を認め なかった．一方，健常若年者では ESAT-6，CFP-10 特異的細胞数は 0.4，0.9 spot ! 10
5PBMC でああり，
我々が設定した Cut-off 値において陽性者は認められ
なかった．
4．結核治療と抗原特異的 IFN-γ 産生細胞数の推移 当院に入院した結核患者のうち初回採血時に喀痰検 査で抗酸菌塗沫陽性が確認され，治療奏効後の採血の 同意が得られた 9 例を対象に，治療早期および治療奏 功 後 に 結 核 特 異 抗 原 を 用 い た ELISPOT 法 に よ り IFN- γ 産生細胞数の動向について検討した（Fig. 4）．
治療開始後から初回採血日までの期間は 0〜21（平均 9.2±6.6）日，初回採血時から 2 度目の採血までの期 間は 20〜138（平均 54.9±31.9）日であっ た．PPD，
ESAT-6 および CFP-10 に対する IFN-γ 産生細胞数を 比較すると，ESAT-6 において初回採血時に比較して 治療後の抗原特異的 IFN-γ 産生細胞数の低下を認めた
（平均 20.1±15.6 vs 7.5±8.5 spot! 10
5PBMC，p＝
0.022）．PPD および CFP-10 においても統計学的な有
意差は認められなかったが，治療前後の平均値は低下
傾向が認められた（各々平均 42.3 vs 22.5，54.4 vs 20.9
Fig. 5 CRP and circulating lymphocyte countbe fore and aftertreatmentin 9 patientswith TB.
spot! 10
5PBMC）（各々 p＝0.068，p＝0.072）．臨床検 査項目については，CRP やリンパ球数は治療開始時 と治療奏効時では統計学的な差を認めなかった（各々 平均 4.2±5.8 vs 1.38±1.2mg ! dL，844±420 vs 1019±
424 ! µ L）（各 々 p＝0.18，p＝0.39）（Fig. 5）．一 方 で，
非薬剤耐性結核ではあるが 61 日目での抗酸菌塗抹検 査 3＋と治療抵抗性症例においては，治療開始時の PPD，ESAT-6，CFP-10 抗 原 特 異 的 IFN-γ 産 生 細 胞 数よりも，61 日目での抗原特異的 IFN- γ 産生細胞数 が全ての抗原において増加した（各々 53 vs 100，4 vs 10，16 vs 78 spot! 10
5PBMC）．また，治療開始後 890 日を経過し抗結核治療を継続していた多剤耐性結核患 者（isoniazid ; R，rifampicin ; R，streptomycin ; R，
ethambutol ; R，ethionamide ; R，levofloxacin ; R）に おいては，喀痰検査での抗酸菌塗沫は陰性であったが，
ELISPOT 法では PPD，および CFP-10 特 異 的 IFN-γ 産 生 細 胞 数 は 高 値 で（各 々 41 spot，35 spot! 10
5PBMC），ESAT-6 特異的 IFN- γ 産生細胞数は 6 spot ! 10
5PBMC であった．
考 察
結核の免疫学的診断法としてはツベルクリン反応が 最も一般的だが，日本では BCG 接種が施行されてお り，PPD と BCG の抗原性が類似しているため，ツ反 の特異度には問題がある
４）．またツベルクリンの注射 や皮膚反応の測定技術に差があると，結果の差につな がる可能性がある
１３）．
ツ反と異なり，QFT および T-SPOT.TB は BCG 接 種や非結核性抗酸菌に影響を受けることなく，結核感 染を高い感度で検出できる免疫学的方法として期待さ れている
６）８）．なかでも T-SPOT.TB は 抗 原 特 異 的 T 細胞より産生される IFN-γ 量が微量であっても，また IFN- γ 産生細胞が少数であっても検出可能なため，そ の感度は QFT より高いとする報告が多く，細胞性免 疫が低下傾向にあり，QFT で診断困難な状態（免疫 抑制剤使用者や AIDS 患者等）での結核感染診断に期 待されている
６）１４）１５）．この T-SPOT.TB は，英国 Oxford Immunotec により開発され主にヨーロッパ各国で使
用されているが，現在日本では診断試薬として認可さ れていないが，文献的に結核感染の診断に関する感度 は 96％，特異度は 100％ と報告されている
８）．今回わ れわれは，T-SPOT.TB で用いられている ELISPOT 法により，その有用性及び，推奨されている Cut-off 値の日本における妥当性と至適 Cut-off 値，結核治療 による反応性の変化を検討した．
ELISPOT 法による陽性結果のみでは活動性結核と 潜在性結核を鑑別できず，理学所見や検査所見と合せ て診断する必要がある．潜在性結核者が多いと予想さ れる日本においては，T-SPOT.TB で推奨されている Cut-off 値では陽性になる非活動性結核高齢者が多く みられる可能性があり，活動性結核患者を鑑別するの が困難でると考えられる．そのため，推奨よりも Cut- off 値を高く設定し，独自の Cut-off 値が必要であると 考えられる．対象とした 35 例の結核患者には HIV 感 染患者 4（例），悪性腫瘍 7（例），糖尿病 7（例），透 析患者 1（例）と免疫抑制状態にある患者も多く含ま れていたが，われわれの行った ELISPOT 法による Cut-off 値での結核の診断の感度は 94％ で，報告され ている感度と同等の良好な結果を確認できた．末梢血 CD4 100! µL 未満の 2 例を含む，結核合併 HIV 感染 患者でも 4 例全例で陽性であった．一方，今回の検討 において結核患者 2 例が偽陰性となった．本症例での 結核抗原特異的反応の低下の原因は特定できなかっ た．本アッセイ系では BCG 接種の影響を除外するた め，および非結核性抗酸菌症との交差反応を回避する ために ESTA-6 と CFP-10 ペプチドを用いているの で，被験者の免疫状態だけでなく HLA phenotype の 影響を受けることも報告されている
１６）．また，我々が 設定した Cut-off 値において，健康若年者の陽性者は 認められず陰性率は 100％ であった．T-SPOT.TB で 特異度が 100％ と報告されているのと同様の結果で あった
６）８）．T-SPOT.TB による特異度は 100％ である ことから，非結核中高年者に認められた 15％ の陽性 者は潜在性結核の可能性を考慮する必要がある．
健常人における PPD 特異的 IFN-γ 産生細胞数は予 想されたとおり，ツ反の判定結果と相関してその細胞 数の増加を認めた．また，結核患者では PPD 特異的 IFN-γ 産生細胞数は優位に高値であったものの，Cut- off 値を決めることは困難であった．このことはツ反 によって BCG 接種者と結核感染者を明確に区別でき ないことと同様の結果で，PPD による結核の特異的 診断は ELISPOT 法でも困難であった．
また，治療経過の評価法としての有用性を評価する
ため，治療開始 1 カ月未満に初回採血がされ，細菌学
的に結核と診断された 9 人で治療による抗原特異的
IFN-γ 産生細胞数の推移を検討した．培養が陰性で
あった時点における ESAT-6 特異的 IFN-γ 産生細胞 数は，陽性の時の細胞数と比較して明らかに低下が見 られた．PPD，CFP-10 においても，統計学的有意差 は認められなかったが，同様の傾向が認められた．臨 床検査所見ではリンパ球数には有意差は見られなかっ たものの，治療奏効時においてわずかに増加傾向が見 られた．治療経過により IFN- γ 産生細胞数の減少傾向 が認められたことよりリンパ球数の増加は ELISPOT 法に影響をあたえないと考えられる．
Gambia で行われた治療開始時と開始後 1 年後での 結核抗原特異的 IFN- γ を比較した試験においても，多 くの症例において明らかに IFN-γ 産生細胞数が減少し たと報告されている
１７）．逆に，今回の治療抵抗性を示 す症例においては，抗原特異的 IFN-γ 産生細胞数が治 療開始時よりも増加するという結果が認められた．
これらの報告や自験例の結果から抗原特異的 IFN- γ 産生細胞数が治療効果の指標となる可能性がある．ち なみに，治療後，890 日を経過しても臨床的に改善が 乏しい症例の抗原特異的 IFN-γ 産生細胞数は，高値の まま推移しており，ELISPOT 法の結果は，結核診断 のみならず，治療効果の判定にも有用であると考える．
以上，結核特異抗原を用いた ELISPOT 法の有用性 について報告した．すなわち，結核特異抗原を用いた ELISPOT 法は結核感染の診断においてツ反と比較す ると感度，特異度ともに優る．特に，免疫不全症例で は，QuantiFERONTB-2G よりも感度において優れて いるとの報告もある
６）８）．さらに，本法は結核診断のみ ならず，薬剤の治療効果を評価する手段の一つとして 重要で，薬剤耐性菌出現のひとつの指標となる可能性 もある．今後症例数を重ねて検討していく必要性があ ると思われる．日本にも T-SPOT.TB の早期導入が期 待されるところである．
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