株抗腫瘍活性物質性状

(1)

V ^g五gJo 77 g′gα 如 ^{r t ノ㍑}gα K N‑2 株^の抗腫瘍活性物質^の性状^に ^つ ^い ^て

金沢大学医学部歯科^口腔外科学講座 ( 主任^: ^山本悦秀教授)

馬場利人

( 平成⁴年⁴月1 6 日受付)

Veillo n ella p^a^{r v u}la ( V^. p^{a r v u}la) K N‑² ^株^の^{超音波処}^{理上}清液 (^{s u}pe r n ata nt of s o nic ated c ells,S S) 中^に存在す^る抗腰瘍活性物質^を^{サル}^コ ^ー ^マ^{1 8 0}(^S^{a r c o m} ^a^{1 80},S^‑1 8 0) 細胞^に対する細胸増殖抑制惰性および殺細胞活性を指標に精製し, その物理化学的性状^に^つ^い^て検討した^. まず,S S を硫酸^アンモ^ニウム塩析L た結果,2 0% 飽和から70% 飽和の画分^に活性物質が塩析された^. ^{この}両分^に対^し^フ^ェ ^ニ ^ー ^{ルセ}^ファ ^ロ ^ース C し4 B カラムを用いた^ハイド^ロフォ ^ービックク^ロ ^マトグラフ_ィ ^ーを行^っ^た^. ^リ

ン酸緩衝液^に^{よる}溶出画分^である^フラクショソ番号(fr a ctio n n u mbe r,fr)2 8 ^‑38 に強^い細胞増殖抑制活性が認められた^. この

画分を分画分子量^{1 0 0}^の^セ^ル^ロ ^ー ^ス ^エ ^ス^{テルチ} ^ュ ^ー ^ブ^ス ^ペ^ク^ト^ラ/^ポ^ア ^{C E} ^で^{1 0}^倍^に^濃縮^した^後, 分^子量1,0 00 から3 0 0,0 0 0の分針^こ優れた^ス ^ー ^パ ^ー ^ロ ^ー ^ス1 2によるゲ^ル濾過を行った^. そ^の結果, 分子量約1,3 0 0^のfr 3 9,fr 4 0 に1 0 0% ^の細胞増殖抑制率,

fr 39 に7 0% 以上の殺細胞率が認められた^.fr3 9 両分を部分精製抗腫瘍物質とし^て, そ^の物理化学的性状^について検討した^. この抗腫瘍活性物質^は^, ^{セル}^ロ ^ー ^ス ^チ^ュ ^ー^ブ^に対^{してほ}透過性^であ^っ^{たが}, セルロ ^ースエステルチュ ^ーブスペクトラ/^ポ^ア

C E に対してほ非透過性であった^. また, 1 0 0 ℃の加熱^に対して細胞増殖抑制括性および殺細胞活性は共^に安定であ^った^. トリプ^シ^ンおよびプ^ロテ_ィナ ^ーゼⅠこに対^{しては}抵抗性^{を示した}^. 核酸画分の細胞増殖抑制活性および殺細胞活性は極めて低かっ

た^. ^ク^ロ ^ロ ^{ホル}^ム , 酢酸^エ^チ^ル, ブタノ ^ールに対して難溶解性であったが, アセト^ンに対し^てほ易溶解性^であった^. ^フ ^ロ ^ー ^サイトメトリ ^ーにより S‑^{1 8 0} 細胞^の細胞^周期^に対する影響を検討したと^ころ, S 期および G2(+ M ) 期^に細胞^の集積が認められ

た^. 以上の結果は, V , 如^{r u 〟}Jd K N‑²^株^の^{抗腫瘍性物質}^は^約¹^,^{3 0 0}^の^{分子量}^を^有^し^{∴蛋白質}^や^{核酸以外}^の^{物質}^で^あ^り^, ^か^つ^{脂質}

を含んでいな^{いこ}とを示唆している^. また, 本物質は D N A 合成阻害活性を有していることを示している^.

Key ^{w o r}ds a nti^‑tu m Or a Ctiv lt y, g^{r O}^W th inhibito ry â^ctl V lt y^, ^{C e}ll killing ^{a c}tivi_{t y}, pâ^rtial pû^rification, V eillo n ella pâ ^{r v u}la

細菌^における抗腫瘍活性, 制がん作用^に^つ^いてほよ今日まで数多く^の報告^{がみられる}^. ^そ^の多く^は好気性菌^に関する報告で

あり^{l 購}⁾, 嫌気性菌^に関する研究は, 嫌気性^C^{o r}ッ^乃e占αC孟grg祝 ∽,

Clo strid iu m など比較的少な^い^{1 6 )}^､^{2 5 )}. 近年, Ta m ai ら^{2 6 )}^､^{2 8 )}ほ口

腔内常在^のグラム陰性嫌気性梓菌であるダ㍑∫0あd C丈♂r∫以 m 耽壷血椚甘誹打抜血両 ^に抗腫瘍活性がある^ことを報告した^. これらの研究を契機^{として}, 口腔内より分離^{された}種^々^の嫌気性菌について抗腫瘍備性が検討され, グラム陽性嫌気性球菌である P 坤加O C C㍑∫ m αg乃以∫^{2 9 )}, グラム陽性嫌気性樟菌^である ⊥d CねわαCg 肋∫ Cα∫g∫^{3 0 )}, グラム陰性嫌気性球菌^である Vg肋乃eJJα^{3 1 卜 3 3)} 等が抗腫瘍活性を有する^ことが明らか^にされ

た^.

Ve肋乃gJJα についてほ, 松原^{3 3 )}は口腔内炎症性疾患である歯肉膿瘍から分離同定した Vg肋れeJJα如^γU^祝Jd｢^V^.♪^{d r U 祝}J^αノ菌株

虹ついて検討し, 菌体抽出液が, 抗腫瘍活性を有する^ことを動物実験および培養細胞を用^いて明らか^にした^.

本研究でほ, V. 如^{r リ}^㍑Jαの菌体抽出液中^に含まれる抗腫瘍滴性物質^の本体^を明らか^にす^べく, 本物質を精製すると共^にその

物理化学的性状について検討^{した}^.

材料および方法

Ⅰ. ア. p^{α r P 〟}h 菌体からの SS の調製

1 ^. 使用菌株および培養法

金沢大学医学部歯科^口腔外科学講座保存菌株^である V ^. 函m 川ね K N‑² 株を実験^に使用した^. 本菌株^は^口腔内炎症疾患

である歯肉膿瘍から^の分離菌株^である^. 凍結保存された本菌株を松原^{3 3 二}^■^の方法^に従^い本培養を行^っ^た^.

2 ^. 菌体^の超音波処理上清液(s upe r n a t^ant of _{s o n}ic a t ed

c e11s, S S ) の調製

S S の調製ほ松原^の方法³³■㌧によった ^. 培養菌液を遠心 ( 6^,⁵00^rpm ,2 0分) し, 得られた沈漬(菌体)^に1/1 5 M リン酸緩

衝生理食塩水 (pho sphate‑^b^u^ff^{e r e}^d ^{s a}^li^{n e}^,P B S ) を加え, 超音波破砕器 M odel U R‑^{2 0 0}^p^{(2 0 K H}^z^{) ( ト}^ミ ^ー^精^工^,^{東京}⁾^に^て^菌体^を破壊^し, 遠心後, 得^{られた上}清液^{を S S} ^{とした}^.

] ^. 腫瘍細胞の培養および増養細胞における増殖抑制活性の測定

1 ^. 実験動物

5週齢^のI C R 系^マウ^ス( 体重2 4^〜2 6g) (日本^チャ ^ールズ ^･リ

A bbr eviatio n s : A28 0, abs o rba n c e at 28 0 n m ; CI A A, Chlo r ofo r m ^‑is oamyl alc ohol_; D F M , D ulbe c c o

′

s m odified Eagle^,s m ediu m s up ple m e nted with l O % fetal bovin e s e r u m ; F C M , flo w cy t^{o m e}try ; F^. n u cle atu m,

F_{u s o}ba ct_{e r}iu m _{n u c}le atu m ; F P L C, fast p^{r o}tein li_quid chro m atog^r^aph_y;fr,fraction nu m ber; M W , m Olec ular

(2)

5 4 8

バ ^ー

, 厚木)を実験^に供^{した}^. なお, 動物飼育室で環境馴化^のために_, あらかじめ 1 週間飼育した^.

2 . 腫瘍細胸^の培養および培養細胞^の調製

実験に使用する^{サル}^コ ^ー ^マ1 8 0(^S^{a r c o m} ^a^{1 8 0}^,^S‑^{1 8 0}^{) 細胞}^は^,

マウ^ス腹腔内^{で 7 日}日ごとに継代培養しているものを使用^した^{3 4}}^.'_{腫瘍細胞}の培養^に^{ほ 1 0}% 牛胎児^血清 (G ibc o, Gr a nd Isla nd, U S A) 加ダ^ル^ベッコ ^ー変法イ ^ーグ^ル培地 (日水製薬, 東

京) (^Dû^lb^{e c c o}^'^s ^m ô^difiê^{d E}âgle

'

s m ediu m s up ple m e nted with l O % fetal bo vin e s e r u m ,D F M) を用^い^た^. 腫瘍細胞 ( 腹水) ^は培養^{7 日目}^に使用直前^に無菌的^に採取した^. 採取後∴踵瘍細胞を P B S で洗浄^し白^血球算定基準^{3 5 )} ^に^{したが}^っ^て ^ビ^{ルケルチ} ^エ

ルク塑^の血球算定板を用^い細胞数を算定し, D F M を加え, 4.0

×1 0⁵個/^m^l^の細胞浮遊液^を調製し実験忙供した^. 細胞^の培養ほ開放系 (37 ℃, 掛臥 ^{5 % C O}²) ^で行った.

3 . 細胞増殖抑制効果および殺細胞効果^の測定

阻織培養用9 6穴^マ ^イ ^ク^ロ ^テ^ス ^t ^プ^レ ^M ^ト^{3 0 7 2} (^B^{e c}^t^{o n} D ick ins o n a nd Co m pa ny,L in c oln Pa rk,U S A) ^の各穴^に細胞浮

遊液 (²^.⁵ ^×^{1 0}⁵個/^m^l)^{1 6 0}〃l を注入後, 各濃度^に調製した試料あるいほ P B S の4 0/^ノ1 を加えた^. ただし∴試料^{および}対照^{とし} てのP B S は, D F M で各濃度^に調整した^. 3 日間培養後^に各穴より 0^.1ml 採取し, 0^.2% ^{斗リ}^バ ^ソ^ブ^ル ^ー ⁰^.¹ ^m^I ^で染色^を行っ

た後, 血球計算板を用^い倒立顕徴鏡下で総細胞数, 生細胞数,

死細胞数を測定^{した}^. 細胞増殖抑制率^{および}殺細胞率を下記^の計算式^により算出した^. ^{この}際, 3 日間培養後^の総細胞数^{から} 培養開始時^の総細胞数を減じた値を増殖細胞数とした^.

細胞増殖抑制率 ( % ) ⁼

対照培養^の増殖細胞数 ^一試料添加培養^の増殖細胞数対照培養^の増殖細胞教

殺細胞数 ( % ) ⁼総細胞数^一生細胞数総細胞数

×1 00

×1 0 0

細胞増殖抑制率^についてほ2 0% 以上を陽性とした^.

Ⅲ^. 抗腫瘍活性物質^の精製 1 ^. 硫酸^ア ^ン^モ ^ニウ^ム塩析

水冷下^で, S S l OOml に対し2 0% 飽和度^になるよう^に粉末状

の硫酸^ア ^ン^モ ^ニ^ウ^ム( 和光純薬^, 大阪) を撹拝しながら徐^々^に加えた. そ^の際^,pH の調整を希^アンモ ^ニア水^にて行^った^. 3 0分間携拝した後,遠心(1 乙0 0 0rpm ,1 5分) し, その遠^{心上}清液^に硫酸

アンモ ^ニウムを飽和度7 0% ^になるように揖押しながら徐^々^に加えた^. 同様^に^{3 0}分捜拝後, 4 ℃ で2 4時間静置した^. そ^の後, 遠心し一その沈漆を P B S にて溶解した^.

2 . カラムク^ロ ^マトグ^ラフィ ^ー

1) ^ハイド^ロ ^フォ ^ービックク^ロ ^マトグラフ _ィ ^ー

フユニ ^ールセフ_ァ ^ロ ^ース C L^‑4 B (P he nyl^‑Sepha r o s e C I:4 B) (^{P h}^{a r m} ^{a c}ⁱ^a ^{F i}^{n e} ^{C h}^{e m}ⁱ^{c a}^l^s^,^Up ps ala, Sw ede n) カラム (2.6^× 1 4^.5c m) を 1 M 硫酸^ア ^ン ^モ^ニウ^ム加0^.1 5 M リン酸緩衝液 (pH 7.2) (pho sphate buffe r, P B) で平衡化後, 2 0^〜70% 硫酸^ア

ンモ ^ニウ^ム飽和両分試料^{1 0 0}^ml を添加^{した}^. ^{カラム}^{を上}記緩衝液で洗浄後, 1 ^‑ O M 硫酸^{アンモ}^ニウ^ム加P B の直線濃度勾配法^{による}溶出を行^い, 引続き^{P B} ^で溶出後, 0 ^〜 5 0 % ^エ^{チレ}

ングリ^コ ^ー ^ル加P B の直線濃度勾配法で溶出を行^った^, 分取畳

は 1 0mI とした^. 2) ゲル濾過

1) ^で得られた試料^は後^に述^べ^る方法^に^{より}濃縮した後, 高速液体^ク ^ロ ^マトグラフ _ィ ^ー (f^{a s}t pr otein li_quid _chr o matogr a^･ phy, F P L C) (^{P h}^{a r m} ^{a c}ⁱ^a ^{F i}^{n e} ^{C h}^{e m}ⁱ^{c a}^l^s) 装置に組^み込れた

ス ^ーパ ^ーロ ^ース1 2(P ha r m a cia F in e C he mic als) ^{カラム}(1^.Ox 3 0.Oc m) を用いてゲル濾過を行った^･ P B S でカラムを平衡化後^, 濃縮試料を添加^し, P B S にて溶出^を行^い, 0.5ml宛分取した^. 分子量(m ole c ula rw eight,M W) ^マ ^ー ^カ^ーとして^フェリテン

(^{M W} ^{4 50},0 0 0), カタラ ^ーゼ(^{M W} ^{2 4 0}^,^{0 0 0}), キモトリプシンA (M W 2 5,0 0 0), チト ^ク ^ロ ^ー ^ム C (^{M W} ^{1 2},5 0 0) (^Co mbithek Bo ehringe r, M a n nheim , Ge r ma ny), ビタミン B1 2(M W l,355) ( 和光純薬) を使用^{した}^.

3) 試料^の濃縮

ス ^ーパ ^ーロ ^ース1 2カラムでゲ^ル濾過^を行う前^に, ハイドロ

フ_ォ ^ービックク^ロ ^マトグラフィ ^ーによって得られた画分を,分画分子量^{1 0 0}^の ^セ^ル ^ロ ^ー ^ス ^エ ^ス ^テ^ル ^チ ^ュ ^ー ^ブ^ス ^ペ ^ク^ト^ラ/^ポ^ア

C E (Sp^{e c}tru m , Lo s Ang^els, U S A) ^に注入 ∴結集^し, これをポリ^エ ^{チレ}ングリ^コ ^ール2 0,0 0 0 で覆う^ことにより1 0倍^に脱れ濃縮した^.

Ⅳ^. 部分精製抗腫瘍活性物質の物理化学的性状 1 . 透析^チ^ュ ^ー^ブ透過性

セルロ ^ースチュ

ーブ(^{V i}^s^{k i}ⁿg,Ne w Yo rk, U S A) ^{および}^セ^ル

ロ ^ース ^エステ^{ルチ}^ュ ^ーブスペクトラ/^ポ^ア ^{C E} ^に試料2ml を注

入し, 4 ℃下^{で4 8}時間, 5,0 0 0mlの P B S に対して透析^{した}^.透析後, チュ

ーブ内液^について _, その細胞増殖抑制活性を前述の

方法^に従^い測定^した^. 2 ^. 熱安定性試験

熱安定性^を調^べるため^に, 試料1 0 0〟l を 5 6 ℃にて 5 , 10,

3 0, 6 0,1 2 0分間, および川0 ℃^{にて}1 , 2 , 5 ,1 0,1 5分間加熱した. 非加熱, 加熱^の試料あるいは対照として^の P B S 40〃1 を S^‑柑0 細胞培養液^{1 6 0}〟1 に加^え, 培養^{3 日}後^に生細胞数,総細胞数を測定し, それらの細胞増殖抑制率^{および}殺細胞率^を求^めた.

3 ^. トリプ^シ^ン感受性試験

試料^{2 0}/川^こ1 , 0.1 ,0^.0 1m g/^m^l^の^{各濃度}^{のトリ}^プ^シ ^ン ^タ

イプ Ⅲ ( S igm a,St.Lo uis,U S A)^{1 0}F^Ll を加^{え 3 7 ℃},60 分間イ^ンキエペ ^‑ ションを行^った^. その後, それぞれ 1 , 0 ･1,

0^.01 m g/ ^血 ^の濃度^{のト}^{リプ}^シ ^ン^イ^ン ^ヒ^ビ^タ ^ー ^タ^{イプ Ⅰ}^‑ ^S (Sigm a) 1 0〟l を加えた^. ^{この} トリプ^シ ^ン処理^に^{よる}細胞増殖抑

制活性^の変化^{を S} ^‑^{1 8 0} 細胞を用^い前述^の方法^に従^い測定^した^.

4 ^. プ^ロテ _ィナ ^ーゼ K 感受性試験

試料^{8 7}^.⁵〃1 に5 , 5 0, 50 0 〃 g/^m^I ^の^{濃度}^の^プ^ロ^テ^ィ^ナ^ー^セ

K (M e r ck, Da r mstadt, Ge r m a ny) 溶液 2 ^.5〟l と 0 ^･1 M Tris‑^{H Cl} 緩衝液(pH 7.8)^{1 0}pl を加え, 3 7 ℃, 6 0分間イ^ン^キ^エ

ペ ^ーショソを行^った^. そ^の後,1 00 ℃,1 0分間加熱す^る^こ^と^に^よりプ^ロティナ ^ーゼ K を失活させた^. ^{この}プ^ロティナ ^ーゼK 処理による細胞増殖抑制活性^の変化^を前述^の方法^に従^い測定^した^.

5 . 核酸分画

w eigh ^{t ;} ^{P B}^, ^p^h^{o s}^p^hâ^tê^‑^bû^ff^{e r}^; ^{P B S} ^, ^p^h^{o s}^p^hâ^tê^‑^bû^ff^{e r e}^d ^{s a}^li^{n e}^; ^S^‑^{1 80}^, ^Sâ^r^{c o m a} ^{1 8 0}^; ^S ^･ ^P^yÔ^gê^{n C S}^･ Strep^t^{o c}ô^c^c^{u s} pyôgêⁿ^{e s};S S , S up^{e r n a}ta nt Of s o nicatêd ^{c e}lls; V ^･ Pâ^r^{v u}la , Veillo n ella parv ula

株 抗腫瘍 活 性物質 性状

株抗腫瘍活性物質性状