博 士 （ 農 学 ） 島 周 平
学 位 論 文 題 名
イネにおけるトレハロース生合成と ストレス応答に関する分子生物学的研究
学位論文内容の要旨
トレハロースは広範囲の生物 種に存在しており，貯蔵糖や血糖あるいはストレス保護 物質として 機能している．高等植物におい ては近年その存在が決定的となったが，蓄積量が極微量 であること から，微生物や動物における機 能とは異なっていると考えられている．本研究では，イ ネにおける 卜 レ ハ ロ ー ス 生 合 成 の 生 理 学 的 機 能 を ， 特 に ス ト レ ス 応 答 と の 関 係 に 着 目 し て 調 査 し た ， 卜レハロースの生合成経路は，次に示す2段階反応で行われる．まず，trehalose‑6‑phosphate synthase (TPS)によってUDP‑グノレコースとグル′コース‑6‑リン酸からトレハロース−6−リン酸(Tre6P)が生 成され，trehalose‑6‑phosphatephosphatase (TPP)によりTre6Pが脱リン酸化され，トレハロースが合 成される．植物のトレハロース 生合成系遺伝子は微生物や動物のそれと異なり多重遺伝 子族を形成 して い る． イネ ゲノ ム上には，9種類のTPS，10種類のTPPが推定されている．本研究ではまず，リ アル タ イムPCRを利 用し た全 トレ ハ ロー ス生 合成 およ び代 謝関 連遺 伝子 の栄養増殖期における環 境 ス ト レ ス 応 答 に つ い て 解 析 し た ． ま た ， 発 生 ・ 生 長 段 階 に お け る 発 現 も 解 析 し た ． 幼 苗 期に おけ るス トレス応答を解析したところ，Os TPPIのストレス処理直後における強い一過 的応 答 が顕 著だ った ．TPPで は発 現 レベ ルか ら〇sTPPI， のTPP2，Os TPP4，Os TPP6が，TPSでは Os TPS1，Os TPS4，Os TPS8が主に機能していると考えられる．低温，塩，乾燥ストレス全てに大きく 応 答 する も のや ，特 定の スト レス にの み応 答す るな ど様 々で あっ た ．発 現レ ベル が比 較的 強い Os TPPI，Os TPS1は根および茎 葉組織で全てのストレスに強い誘導性を示した．Os TPP6は茎葉組織 での み 発現 誘導 を示 し， 反対 にOs TPS4は根 組織でのみ強い誘導性を 示した．Os TPP4はどのスト レスにも発現誘導を示さなかっ た．このように，幼苗期におけるス卜レス応答でも各遺 伝子の発現 様式は異なっていることが明らかになった．
トレハロース加水分解酵素を コードするトレハラーゼ遺伝子のストレス応答を調べる と，低温で はほとんど応答しないが，塩， 乾燥ストレスに強く応答した．水ポテンシャルの低下や 浸透圧スト レスに対しトレハラーゼ遺伝子が強く応答すると考えられる．
開 花 後の 穎花 では ，全TPS，TPPの発 現は 低レ ベルであったが，花粉形成の進行に伴い，葯組織 にお け るOs TPP1の 発現量の上昇が見られ た，また，トレハラーゼ遺伝子の発現が花粉成熟段階の 葯組織において一時的に誘導さ れた．これらの結果から，花粉形成におけるトレハロー ス生合成系 の厳密な制御機構の存在が示唆 された．本研究により，植物の生活環のほぼ全てのステ ージにおい てトレハロースの生合成と分解 が厳密に制御されていることを初めて明らかにすること ができた．
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ま た ， 同 時 に ト レ ハ ロ ー ス の 生 長 調 節 物 質 と し て の 多 面 的 機 能 が 示 唆 さ れ た ． 幼 苗 期 にお い て 主要 に 発 現す るTPP酵 素 であ るOsTPPlおよ びOsTPP2に 着 目 し， そ の 生化 学的 性質を 解析した ．それ ぞれ大腸 菌内で組 換えタ ンパク質を合成し，インタクトな組換えタンパク質 を精 製 し た ．活 性 測 定の 結 果 ，組 換えOsTPPl，OsTPP2はTre6P脱リ ン酸活性 を有す ることが 示唆 され た ． さ らに 酵 素 学的 解 析 を行 った ところ ，OsTPPl，OsTPP2は 両酵素と も微生 物由来のTPPと 比べ，Tre6Pに対 し基質 特異性が 高く， 著しく低 い協値を 示した ．また， 熱に対しては不安定であ った．OsTPPl:GFP，OsTPP2:GFP融 合タンノ くク質を 用しヽた細胞内局在解析より，OsTPPl、OsTPP2 は細 胞 質に 局在する ことが 示唆され た，至適pHが両酵 素ともほ ぼ中性 であった ことは この結果 を 支持し た．イネ のTPP酵素がよ り低い基 質濃度 に適応し ，安定 性が低い ことは ，植物におけるトレ ハロー ス生合成 は微生 物とは異 なり，微 量に生 成され，厳密な制御を受けていることを反映してい ると結論した．
イ ネ のTPPの中にお いて，Os TPP1はス トレス に応答し ，最も 主要に発 現する ．その生 理学的機 能を解 析するこ とを目 的として ，ユビキ チンプ ロモータ ーの下 流にOs TPP1を連結させたコンスト ラクトでイネを形質転換した． Os TI P1過剰発現体における可溶糖の解析の結果，Os TPP1過剰発現 体では トレハロ ース含 量が野生 株の約3〜6倍に増 加していた．またこの時グルコース及びフルクト ースが 野生株と 比較し て約3〜15倍蓄積していることを明らかにした．Os TPPl.過剰発現体において は， 葉 身 お よび 穂 軸 の伸 長 が 観察 され た．22kオリゴDNAマイ クロア レイを用 いて，Os TPPI過剰 発現 体 の 網 羅的 発 現 解析 を 行 った とこ ろ，光 合成に関 わる光化 学系i‑nおよび その関 連遺伝子 ， RubisCO大 小サブユ ニット の発現が 総じて 減少して いるこ とを見出 した．こ のような光合成関連遺 伝子 の 発 現 抑制 は ，OsTPPlの 過 剰発 現によ るTre6Pの 減少に 起因する 可能性が 高い， また，光 合 成能の 低下を補 うよう に，のロ P1過剰 発現体に おいて葉身の伸長が観察された．のTPP1過剰発現 体は 高 濃 度 のABAに対 し 強 い生 育 阻 害を 示 し た． し か し， 野 生 株 と比 較 し てのTPPI過 剰 発現体 に お け るABA応 答 遺 伝 子 のABA応 答 性 は 低 く な っ て お り ，Os TPP1はABAシ グ ナ ル を抑 制 す る 働きを 有するこ とが示 唆された ．また， 形質転 換体を用 いて低 温耐性試 験を行い，Os TPPI過剰発 現体 は 低温 耐性が低 下して いること が明らか になっ た．逆にOs TPP1のTos17レ トロポゾ ン挿入変 異株 で は 野 生株 よ り 低温 耐 性 が向 上し た．OsTPPlは 低温スト レス下 で，ABAシグナ ルを抑制 する ことに より，そ の下流 にある低 温応答関 連遺伝 子の発現を抑制することで，低温耐性獲得に負の効 果をもたらすという作業仮説を提案した，
水 耕 栽 培し た イ ネ幼 苗 を 用い て ， トレ ハ ロ ース 誘 導 性遺 伝 子を22kオリゴDNAマ イクロア レイ を用 い て網 羅的に同 定した ．これら の中には ，ERF，JAmyb，WRKY等の転 写因子 ，PRタンパ ク質，
サリチ ル酸およ びジャ スモン酸 生合成酵 素等の 病害応答関連遺伝子が大多数を占めた．誘導された 遺伝子 を選択し ，ノー ザン解析 でさらに トレハ ロース誘導性を解析した．転写因子群には一過的誘 導の 傾 向が 見られ，PRタンパ ク質は処 理後徐 々に発現 誘導され る傾向 がみられ た．ト レハロー ス 以外の 主要な単 糖，二 糖で処理 した場合 は，上 記の遺伝子の発現誘導はほぼ検出されなかった．ト レハ ロ ース による抵 抗性誘 導の有無 をいもち 病菌の 噴霧接種 および 葉面接種 による 病班形成 を指 標に 評 価 し た． そ の 結果 ，5 mMト レハロー スで5日間処 理した イネにお いては病 斑数の 減少，病 班進 展 抑 制 が観 察 さ れた ． イ ネに おい て，ト レハロー スをPAMPsとして 認識する 機構が 存在する と推 定 され た．さら に，OsTPPl過 剰発現株 のいも ち病菌に 対する 抵抗性を 調べた ところ， 病害抵
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抗性が向上していることから，病害応答に拮抗的に働くABAシグナルがOsTPPlによって抑えら れ，病害抵抗性が向上したと示唆された．
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学位論文審査の要旨
主査 教授 松井博和 副査 教授 横田 篤 副査 准教 授 伊藤浩 之
副査 主任 研究員今 井亮三（ 北海道農 業研究センター）
学 位 論 文 題 名
イネにおけるトレノヽロース生合成と スト レス応答に関する分子生物学的研究
本 論 文 は ， 図31， 表11， 引 用 文 献81を 含 み ，6章 か ら な る総 べ ージ130の 和文 論 文で あ る ． 別 に 参 考 論 文1編 が 添 え ら れ て い る 。
トレハ ロースは 広範囲の 生物種に存 在してお り，貯蔵 糖や血糖 あるいはストレス保護物 質とし て機能し ている． 高等植物に おいては 蓄積量が 極微量で あること から，微生物や動 物にお ける機能 とは異な っていると 考えられ ている． 本研究で は，イネ におけるトレハロ ー ス 生 合 成 の 生 理 学 的 機 能 を 特 に ス ト レ ス 応 答 と の 関 係 に 着 目 し て 調 査 し た ． ト レ ハ ロ ー ス の合 成 は2段階 反 応 で行 わ れる ． す なわ ち ，trehalose―6−phosphate synthase (TPS)によってUDP−グルコースとグルコース―6−リン酸からトレハロース―6―リン 酸(Tre6P)が 生成さ れ，trehalose−6―phosphate phosphatase (TPP)によりTre6Pが 脱リ ン酸化 されトレ ハロース が生じる． 植物のト レハロー ス生合成 系遺伝子 は多重遺伝子族を 形成し ，イネゲ ノム上に は9種類のTPS，10種類のTPPの存在が推定されている．本研究では まず， リアルタ イムPCRを利 用した全ト レハロース生合成およぴ代謝関連遺伝子の栄養増殖 期にお ける環境 ストレス 応答につい て解析し た．また ，発生・ 生長段階 における発現も解 析した．
幼 苗 期 のス トレス応 答を解析 したとこ ろ，Os TPP1のス トレス処 理直後にお ける強い 一 過 性の 応 答が 顕著だ った．TPPで は発現レ ベルからOs TPP1，Os TPP20s TPP6が，TPSで は Os TPS1，Os TPS4, Os TPS8が主に機能していると考えられた，低温，塩，乾燥ストレス全て に強く 応答する もの，特 定のストレ スにのみ 応答する など様々 であった ．発現レベルの高 い ぬTPP1， ぬTPS1は根 と 茎 葉組 織 で全 て のスト レスに強 い誘導性 を，ぬTPP6は茎 葉組織 ぬTPS4は根組織のみで発現誘導性を示した．
トレハ ラーゼ遺 伝子のス トレス応答 を調べる と，低温 ではほと んど応答しないが，塩，
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乾燥 ストレス に強く応 答した． 水ポテン シャルの低 下や浸透 圧ストレ スに対しトレハラー ゼ遺伝子が強く応答すると考えられる，
開花 後の穎花 では，全TPS，TPPの発現 は低レベ ルであった が，花粉 形成の進行に伴い，
葯組 織におけ るOs TPP1の発現 量の上昇 が認めら れた．また，トレハラーゼ遺伝子の発現が 花粉 成熟段階 の葯組織 において 一時的に 誘導された ．これら の結果か ら，花粉形成におけ るト レハロー ス生合成 系の厳密 な制御機 構の存在が 示唆され ，植物の 生活環のほぼ全ての ステ ージにお いてトレ ハロース の生合成 と分解が厳 密に制御 されてい ることを初めて明ら かした，
幼苗 期 に おい て 主に 発 現 するTPP酵素 で あ るOsTPPlお よぴOsTPP2に 着 目 し， その生化 学的 性質を解 析した． それぞれ について 大腸菌を用 いて組換 え酵素を 合成し精製した．組 換 えOsTPPl，OsTPP2はTre6P脱リン 酸活性を 持っこと を確認し た．両酵 素は，微 生物由来 のTPPと比 べTre6Pに 対し 基 質 特異 性 が高 く ， 低い屬 値を示し た．熱に 対しては比 較的不 安定であった．
ぬTPP1の 生 理 学的 機 能を 解 析 する た めに ， ユビ キチンプ ロモータ ーの下流に ぬTPP1を 連結 させたコ ンストラ クトでイ ネを形質 転換した． 過剰発現 体におけ る可溶糖の解析の結 果，トレハロース含量が野生株の約3丶一丶6倍に，グルコースおよびフルクトースが約3丶一‑15 倍 蓄 積し て い るこ と が明 ら か にな っ た．22kオ リゴDNAマイ ク ロ アレ イ でOs TPP1過剰 発 現 体 の 網 羅 的 発 現 解 析を 行 っ たと こ ろ ，光 化 学系i‑nお よぴ そ の関 連 遺 伝子RubisCO大 小サ ブュニッ トの発現 が総じて 減少して いることを 見出した ．光合成 関連遺伝子の発現抑 制 は ，OsTPPlの 過剰発 現によるTre6Pの減少に 起因する 可能性が 高い．ま た，光合成 能の 低下 を補うよ うにOs TPP1過剰 発現体に おいて葉 身の伸長が観察された．野生株と比較して ぬTPP1過 剰発 現 体に お け るABA応 答 遺伝 子 のABA応答性 は低下し ，Os TPP1はABAシグ ナル を抑 制する働 きがある と示唆された．さらにぬTPP1過剰発現体は低温耐性が低下していた，
逆 にOsぴ 朋 のTos17レト ロポゾン 挿入変異 株では野 生株より 低温耐性 が向上した ．OsTPPl は 低 温ス ト レ ス下 でABAシグ ナルを抑 制するこ とにより ，その下 流にある低 温応答関 連遺 伝子 の発現を 抑制する ことで， 低温耐性 獲得に負の 効果をも たらすと いう作業仮説を提案 した ，さらに ，Os TPPI過剰発 現株のい もち病菌 に対する抵抗性を調べたところ，病害抵抗 性 が 向上 し て いる ことか ら，病害 応答に拮 抗的に働 くABAシグナ ルがOsTPPlによっ て抑え られ，病害抵抗性が向上したと示唆された，
水耕 栽 培 のイ ネ 幼苗 を 用 いて ， トレ ハ ロ ース 誘導性 遺伝子を22kオリゴDNAマイ クロア レ イ で網 羅 的 に同 定 した ．ERF，JAmyb，WRKY等 の転写因 子，PRタン パク質， サリチル酸 およ びジャス モン酸生 合成酵素 等の病害 応答関連遺 伝子が大 多数を占 めた．誘導された遺 伝子 のノーザ ン解析に よルトレ ハロース 誘導性を調 査した． 転写因子 群には一過性の誘導 傾向 があり，PRタンパク 質は処理 後徐々に 発現誘導さ れる傾向 がみられ た．トレハロース 以外 の主要な 単糖，二 糖処理で は上記の 遺伝子の発 現誘導は 検出され なかった，トレハロ ース による抵 抗性誘導 の有無を いもち病 菌の噴霧接 種および 葉面接種 による病班形成を指 標 に 評価 し た 結果 ，5 mMトレ ハロース で5日間処 理したイ ネにおい ては病斑数 の減少， 病 班 進 展抑 制 が 観察 された ．イネに おいて， トレハロ ースをPAMPsと して認識す る機構が 存
在すると推定された．
よ って 審査 員一同は、島周平が博士（農学）の学位を受けるに十分な資格を有すると認 めた 。
