原 著
ヒト血小板凝集及び凝集問害に対するプロスタグランジンの作用機序
小 島 正 紀
小野薬品工 業 側 医 薬 情報部青 山 美 佳 ， 森
夏 子 ， 岸 野 泰 雄
徳島大学医学部栄養学科実践栄養学教室（主任：岸野泰雄教授） （平成6年11 月 1日受付）E
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2 小 島 正 紀 ， 青 山 美 佳 ， 森 夏 子 ， 岸 野 泰 雄
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The resentp study detniop out the importance tfo eh concomitant ecneserp rfo orscepte f
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r het aggregation and sti niotiibhni ni eht tleetalp plasma membrane.
〔vγiece ed Novemb er 1, 1994 〕
Key words : pndinrostagla and 1E PGD2, teleatlp aggregation -ecer p t o r , cilccy AMP, larutcurtsartlu sysialan プロスタグラン ジン I 2 (PGI 2）は血管内皮細胞よ り産生されるアラキドン酸の不安定な代謝産物であり， 血小板凝集に対して強力な阻害作用をしめす (M on -c a d a ら， 6791 ）が，一方，PGH 2, トロンボキサンA 2 (TXA J は反対の作用，すなわち血小板凝集を示す (Bhagwat ら，5891 ）.このことは，生体内における血 液循環での恒常性の維持に役立 っているものと思われ る. PGI 2の抗凝固作用は脳梗塞とか心筋梗塞の予防， 治療に有益であり， PGI 2類似物質の研究が望まれる． P G I 2 の機能は血小板表面のレセプターを介して発揮 され（erfhacS ら， 9791 ), PGI 2類似物質もヒト血小 板のレセ プターに対して PGI 2に似た作用を示すこと が報告されている（Katsuyama ら， 4991 ）.既に著者 ら （小島，1991 ; Ojima , T,oiruhko 2991 ）はヒト血小 板凝集と凝集間害レセプターを構造活性相関の面から 検討し， PGs のうちPGI 2, PGD 2, PGE 1などは血小 板の凝集阻害のレセプターに結合する構造があるばか りでなく，凝集のレセプ ターにも結合する構造を有し ていることを報告した．この理論を立証する 一助とし て，今回 PGE1, PGD2 を用いて，血小板凝集阻害 ば かりでなく，血小板を凝集する作用があるかどうかを 検討し，形態学的変化と比較した．また， PGE1 とか
PGI 2は レセプターを介してcilcyc AMP (cAMP ）を 増加させ，凝集阻害をおこすと考えられているため， a d e n y l esalcyc の阻害剤である 2’，5＇ディデオキ シー アデノ シン （DDA ）を加え， PGs のレセプターを介す るcAMP の増加を抑制した条件下で，血小板がどのよ うな超徴構造的変化を示すか走査型電子顕微鏡を用い て観察した． 実験材料並びに方法 試 薬 PGE1 , PGD 2は小野薬品工業 （大阪） より入手した． DDA はPharmacia ,alasppU( ,en)wedS ポリーLーリ ジンはSigma (St . ,siuoL USA ）より入手した. PGE 1, PGD2 は12mM になるよ うにエタノールで‘溶解し， 生 理食塩水 （生食水〉で希釈した. DDA は生食水で希釈 しTこ．ポリ L リジ ンtまetahpsohp deref-bfu enilas に 溶解した． 血小板の調整 薬剤を1カ月間服用していない健常者から採血した 血液9容に8.3 % クエン酸 ソーダ1容を加え混合した． 多血小板血祭浮遊液 （PRP ）は005,1 m,pr 01 分間の 遠心分離により得た．乏血小板血祭（PPP ）は000,3 r p m , 03 分間の遠心分離より得た．血小板数は25× 1 0 4 / μI になるよ うに PRP を PPP で希釈調整した (O,aimj ,atijuF 6791 .) cAMP の測定 PG による血小板cAMP の測定 は， PRP, 5.0 ml に生食水またはDDA, 50.0 ml を加え73℃，5分間イ ンキュベートした後， PGE1 または PGD 2を50.0 ml 加え02 分間，イ ンキュベー卜した. DDA の最終濃度 は5.0 mM, PGE1 とPGD2 の最終濃度は O.lμM, l.OμM 及 びlOμM で行なった. cAMP の測定はラ ジオイム ノアッセイ DCC 法で行な った （孫ら， 5891 ). EDTA 処理した PRP 中に存在する cAMP をサク シ ニル化し，サク シニル化された cAMP をs r12 サクシ ニル cAMP チロ シンメチルエステル抗血清 とで競合 させた．競合反応の結果，抗体に結合しなかった I勺 サクシニル cAMP をあらかじめデキストランでコー ティングした活性炭に吸着 さぜて除き， 上清の放射活 性の測定からPRP 中のcAMP 量 を算出した （孫ら， 1 9 8 5 ). 走査型電子顕微鏡 検索材料は上記の実験で得た資料を下記の処理を行 ない観察した．すなわち，それぞれPRP , 1 ml を氷
量を6.5 倍と.27 倍に増加させた. cAMP の産生は， 1 0 μ M PGE ，に50. m M DDA を併用することによ っ て，4 % 阻害されたが， l7 O μMPGD ，に0 .5mMDDA を併用すると， 1 %阻害された（ Tab8 le 1) . 形態学的 に生食水（対照），01 μ M PGE" 01 μ M PGD ，又は 05. mMDDA を単独で、7 ℃3 ， 20 分間インキュベートする と対照と同様．血小板の大部分はほぼ球形で，表面は 比較的平滑であり，時には僅かな隆起や陥凹をもつも のがみられた．極く少数の血小板には2～3の短い突 起を認めた（F.sgi 1～4). 10 μ M PGE ，に0.5mM DDA を併用すると，ほとんどの血小板は対照群でみ られた突起がさらに伸長し，あるものは細長い偽足様 の突起となり，隣接する血小板の突起または平滑な表 面に接着し，互いに接近して凝集した（F.gi 5）.こ の ように突起を出し合い，凝集し始めると血小板は扇平 状または木の葉状に変形するものが多くみられた． 一 部に陥凹部のみられるものもあったが，多くの血小板 は変形するために表面構造は不定形となった. lOμM PGD ，に0.5mM DDA の併用でも血小板の凝集が観 察された〔F i.g 6). 37 ℃， 5 分間のインキュベーショ ンでもPGE ，とDOA 併用およびPGD ，とDOA 併用 においても， 血小板偽足の発達と血小板凝集が前者と 冷した1% グノレタノレアノレデヒド固定液（0 .1 M リン酸 緩衝液， pH 74 〕20ml. に，滴下しつつ振渥した．同 一固定液中にある PRP を時々携搾し， 1 時間後に 4 ℃で保存 した．固定した PRP を室温で00,51 rpm, 10 分間遠心し，血小板ベレッ トを 300 μI の同一固定液 でそれぞれ懸濁させた．懸濁液を1.0 %ポリ L －リジ ンであらかじめコートしたガラス小片（約5mm 角） 上に1～2滴載せた．5分後ガラス小片上に付着した 血小絞をリン酸緩衝液で1 時間洗浄し， 1% 緩衝四酸 化オスミウムによる後回定を4 ℃で 1 時間行なった． さらに，アセトンによる脱水，酢酸イソアミノレによる 置換，液体二酸化炭素により臨界点乾燥機 （目立， HCP-2 型）で乾燥させた後，金パラジウムでコーテ イングを行い，走査型電子顕微鏡（目立， 00-8S ）で観 察した． 果 ヒト血小板において，PGE ，とPGD ，との7 ℃3 ， 02 分間のインキュベーションで，それぞれについて0.1 μM, lμM 及びlOμM の濃度でみると，各濃度に比
例してcAMP 量は増加した. lOμM PGE ，および01 μ M PGD ，は生食水 （対照）に比し，それぞれcAMP 結 E f f e c t
s PGE" fo PGD , and DDA on cAMP leev l human ni p l a t e l e t s Table 1 n S a l i n e PGE , O.lμM PGE, lμM PGE, 01 μ M PGD 2 O.lμM PGD2 lμM PGD2 lOμM DDA 0.5mM PGE , lOμM , PGD2 lOμM, F h u q d 内 J 4 ・ q u 『 υ a a y 内 JqtunJ cAMP (pmol/ml 〕 1 2 . 0 ± 68.0 1 5 .±0 35.1 2 5 . 7±12 . 2 6 7 .0± 793. 略 事 権 2 5 . 0 ± 86.5
・
5 3 . 0 土151.・
8 6 . 8 ±24.3 ＊・ 13.3± 33.0 1 7 .3士. 716・
1 6 . 3 ± 02.1 日 Treatment DDA 0.5mM DDA 0.5mM A l l stluser era dtenesrep sa mean ±S. ..ElacitsitatS ana y slsi (sla i ne susrev PGs DDAro ) was made by Sntdetu .’ts Iset
4 小 島 正 紀 ， 青 山 美 佳 ， 森 夏 子 ， 岸 野 泰 雄
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. 1 One tfo eh human steletalp deteart hitw enilas rof m02s.etuin The m a j o r i t
y fo them show ylevitaler smooth .ecafrus Some steletalp have trohs sessecrop and lacinoc nosisreped on teh ecafurs . Bar: 1 μロ1
F i g
. 2 One tfo eh human steletalp detaert thwi 01 μ M PGE1 rof m02.seutni The yritjoam fo ehtsteletalp have smooth ,ecafrus and some show c o n i c a l onissepred on teh .ecafrus Bar: 1 μ m
F i g
. 3 One tfo eh human steletalp detaert ithw 01 μM PGD2 rof 02s.etnuim Though most fo eht steletalp have smooth ,ecafrus some steletalp show llams noitaevle and lacinoc noisserped nirieht plasma mem-b r a n e . Bar: 1 μ m F i g
. 4 One tfo eh human steletalp detaetr hwit .O 5 m M DDA enoal rof 02 m i n u t e s . alcnioC snosisreped rea nees on teh ecfarus tfo eh.teletalp B a r : 1 μ m
6 小 島 正 紀 ， 青 山 美 佳 ， 森 夏 子 ， 岸 野 泰 雄
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. 5 Human steletalp deteart hwti 01 μM PGE1 and 5.0 m M DDA trethego f o r m02 esinut . Slraeve iadopodpseu froaidopoli era .nees lacierhpS p l a t e l e t s era tacntoc thwi each retho hwti eht .sdopoduesp alcnioC d e p r e s s i o n s era osla nees on teh ecafrus tfo eh.steletalp Bar: 1 μ m F i g
. 6 Human steletalp detaert hitw 01 μM PGD 2 and 5.0 m M DDA terhtgeo f o r 02 .steunim Many sdpodouesp gnitanigiro from eht teletalp s u r f a c e era .nees lacirehpS steletalp era tactonc hitw hace retho hitw t h e .sdopoudsep Some steletalp era ralugerri ni.epahs Bar: 1 μ m
同様に観察された． 考 察 著者らはすでに PGE1, PGD2 等の血小板凝集およ びその間害作用に関するコンブオメーションについて 構造活性相関の方法により求め，その鋳型のレセプタ ーの特徴を報告してきた （小島， 1199 : Ojima, Toku ・ h i r o , 9921 ）.その PG 分子のコンフォメーションは， 従来知られているような PG 分子の結晶構造における PG 分子同志の分子間水素結合の形（Speak, 7197 . DeTitta ら， 1980 : Stezowski ら， 1398 ）をとってお らず，大部分は PG 分子の α側鎖のカルボン酸と5 員 環やω側鎖にある O H 基との間で分子内水素結合を しているものであった．最近，溶液状態でのコンブオ メーションは，結晶構造の分子間水素結合のものとは 異なっており，たとえば， PGI2 誘導体のカルパサイク リンでは α側鎖の C1 位カルボン酸と5 員環の C11 位 OH 基と， TXA2 誘導体の U-46619 では
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位 O H 基及び C15 位 O H 基 と，さらに PGE2 では C1 位カルボン酸と C11 位 O H 基及び C51 位 OH 基とが分子内水素結合をしている． PGE2 及び PGD2 は PGI2 と TXA2 のコンブォメーションを合わせもっていることが Fourier 変換赤外分光 分析により明らかにされた（Takasuka ら， 1499 ）.そ れらは著者らがすでに予想していたコンブオメーショ ンと一致している（小島， 1919 ; Ojima, Tokuhiro, 1 9 9 2 ). 血小板凝阻害レセプターは P2,GI PGE1, PGD 2，ア デノシン，イソプロテレノール等が結合することによ って活性化され，続いて adenyl secycla を刺激する GTP 結合蛋白（Gs 蛋白〉が活性化され，その結果， Gs 蛋白は adenyl secycla を活性化し， cAMP の増加 によって血小板凝集を阻害すると考えられている (Schafer ら， 1997 : Ashby, 1989 : Hourani, Cusack, 1
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1 ）. 一 方 ， 血 小 板 凝 集 レ セ プ タ ー は TXA 2, PGH2 ，アドレナリン， pteletal gtnivaitca rtofac (PAF), adenosine diphosphate (ADP ）等が結合す ることによって活性化され，活性化した凝集レセプタ ーは adenyl eyclasc を阻害する GTP 結合蛋白（Gi 蛋 白）を活性化し， Gi 蛋白は adenyl asecycl を間害し，
cAMP を低下させ，結果として血小板を凝集させるこ
とになる（ Hourani, Cusack, .)9191 PGE1 とアドレ
ナリンーβーアゴニストとの比較で，分子上の原子荷電 と側鎖に共通点が多いために， PGE1 はアドレナリン 一βーアゴニストと同じように cAMP を増加させ，同じ ような薬理作用を示すことがすでに Hoyland, Kier 0971 ）により報告されている． また血小板凝集には血小板アクトミオシンが重要な 役割をしていることが指摘されている（日高ら， 1 9 8 0 ；小島ら， 1297 ）. そのために Beckett (1963 ）が 報告した構造活性相関から求めたアセチノレコリン平滑 筋収縮レセプターのモデルを参考にして，著者らは同 じ方法で血小板凝集剤である TXA2, PGH 2のコンフ ォメーションから，血小板凝集レセプターについて模 式的に推察し，すでに報告した（小島， 1991 : Ojima, Tokuhiro, 2199 ）.著者ら（ Ojima, ,atijuF 9761 ）の行 なった凝集問害実験で、は， PGE1 はlμM 以上の濃度 でヒト血小板の ADP ，トロンピン，コラーゲン等によ る凝集を完全に阻害した. Ashby 1989( ）は PGI2 の 血小板凝集阻害作用は強力であると述べ， cAMP の動 的変化でみると低濃度（003. μ M）の PGI2 は cAMP を増加させ，短時間C2 分間〉では cAMP の低下はみ られない． しかし高濃度（30 μ M）の PGI 2 では， cAMP の上昇は軽度になり，さらにこの cAMP の上 昇は上昇後短時間で低下する. PGE1 が cAMP を上 昇させるためには PGI2 に比して高濃度（0.3 μ M 以 上〉が必要である．また PGE1 では高濃度でも低濃度 でも上昇後 cAMP は短時間で低下してくる．また高濃
度の PGI2 では， PGE1 にみられる cAMP 濃度の時間 的 変 化 と 近 似 し て く る ． こ の 現 象 を ふ ま え Ashby ( 1 9 8 9 ）はレセプタ一 一G 蛋白 adenyl secycla の一連 の生化学的反応から PGE1 と PGI2 は血小板凝集阻害 のレセプター及び血小板凝集のレセプターにも結合し， その際 PGE1 と PGI2 は凝集阻害のレセプターに同程 度に結合しているものの，血小板凝集レセプターには PGE1 の方が PGI 2 よりも強く結合していると報告し ている．最近， Ashby のグループ （Kunapuli ら， 1)994 は，赤血白血病細胞で adenyl secycla を回害するヒト TXA2 レセプターと相向性を多くもっている EPs レ セプター（PGE レセプターの1 種〉の存在を明らかに
し，そのレセプターには PGE1, PGE2 および PGI2 誘 導体の istoropl が結合していると報告している．赤血 白血病細胞の receptor dnagiloidar binding assay に よって， PGI2 には親和性の高いレセプターと親和性の 低 い レ セ プ タ ー の 2種 類 が あ り ， 前 者 が adenyl c y c l a s e を刺激するレセプターであり，後者が adenyl c y c l a s e を阻害するレセプターであると Murray ら ( 1 9 8 9 ）は報告している．構造上からも溶液状態では， PGI2 と TXA2 のコンフォメーションは異なっており，
8 小 島 正 紀 ， 青 山 美 佳 ， 森 夏 子 ， 岸 野 泰 雄 PGE 2 は両者のコンブオメーションをとれる物質にな っていることが明らかにされている（Takasuka ら， 1 9 9 4 ）.著者らも以前に同じ結論を報告した（小島， 1 9 9 1 ; Ojima, Tokuhiro, .)2919 以上の様な考察から， PGE1 が血小板凝集阻害レセ プターばかりでなく血小板凝集レセプターにも結合す る構造をもっている物質であると仮定するならば， PGE1 には血小板凝集阻害作用ばかりでなく血小板凝 集作用も見られてよいものと考えられる．それらの考 え方に基づいて，従来知られているPGE1 の血小板凝 集阻害作用のみならず血小板凝集作用をも生じうる 可能性のあることを今回の実験で確かめた．そのため に，反応時間はPGE1 がcAMP を上昇させ，ピーク に達した後cAMP が低下してくる状態での0 分を中2 心に設定し検索した. PGE1 添加後0 分の時点で対照2
群の cAMP 量は.21 0 pmol/ml であるが， O.lμM PGE1 添加群， 1 μ M PGE1 添加群， lOμM PGE1 添
加群はそれぞれの濃度に比例して cAMP 量を増加さ
せ， 01 μ M PGE1 群では.76 0 pmol/ml にまで増加し た （Table .)1 しかし，これら lOμM PGE1 にadenyl c y c l a s e 阻害剤である DDA (0.5mM ）を併用した場 合には01 μ M PGE1 添加群に比べてcAMP 量の増加 が有意に抑制された (Table .)1 それと平行して， PGE1 単独群では血小板凝集が観察されないが， DDA 添加でadenyl elascyc を阻害した際に血小板凝集が 生じうるかどうかを，走査型電子顕微鏡によって比較 検討した．その結果， lOμM PGE1 群， 0.5mMDDA 群ではいずれも対照群と同様，血小板凝集はみられず， 個々の血小板はほぼ正常でその表面は平滑であり，ご く少数の血小板の表面に2～3 の短い突起が認められ たにすぎなかった（F.gsi ,1,2 4）.それに反し， lOμM PGE1 に50. m M DDA を併用すると，個々の血小板 表面に数個の細長い偽足突起が伸びると同時に，隣接 する他の血小板とも突起同志または血小板表面とも接 触又は接着し，その際には血小板は変形し，表面構造 も不整となった（F.gi 5）.このように血小板凝集の機 構として，血小板膜上のレセプターにはじまり， a d e n y l elascyc による cAMP 産生など細胞内反応に 変換する過程，続いて細胞内アクトミオシン系を中心 とした収縮蛋白質の生化学的変化が生じる．その際， 形質膜直下に輪状に走るこれら収縮タンパク質の配列 が中央部に向かつて収縮し，その一部が偽足突起に入 り込み血小板の形態の変化としてあらわれる （服部， 1 9 7 0 ）.これは原則的には ADP による凝集に類似して いる （White, 9681 ）.さらに時間が経過すると，これ らの偽足突起が互いに密着し，偽足内のアクトミオシ ンの収縮によって血小板同志の凝集塊が密着して強固 なものとなる（C,kelar 9196 ）.今回用いた血小板凝集 に関与する薬剤が血小板の表面に形態的変化をもたら したことは注目される．凝集前にみられる血小板表面 の陥凹部について Behuke ),7691( rarreid-FeaiDv ( 1 9 6 4 ）は細胞内の小胞体系と連結する cerfasu n-oc n e c t i n g system の開口部と解釈し，これを通じて外界 の血竣成分が入り込むことも可能であると述べている． 偽足が伸びはじめると，この陥凹部は認められなくな った． このことはitorHat ら996(1 ）によっても報告 されている．また， megal 王ticcyryoa leukemia 細胞は PGE1 単独によって細胞内 Ca 濃度が増加し，細胞表 面に突起が出現するとし、う報告もあり， PGE1 によっ て活性化されるレセプターが血小板形成の初期から存 在していると想像される（Nagano ら，.)3991 PGD 2 は PGE1 の.91 倍の凝集を阻害する能力があ り （小島， 1991 ; O,amij Tokuhiro, 2991 ), PGD 2 単 独では形態学的にも血小板の凝集はみられない （.giF 3 ) . しかし，さらに0.5mM DDA を併用すると血小 板の偽足突起の進展とともに，血小板凝集が認められ た（F.gi 6）.これらの凝集所見は 20 分間のインキュベ ーションでなくても， 5 分間のインキュベーションに おいても既に観察された. PGE1, PGD2 の血小板凝集 阻害に関して，それぞれのレセプターを介する見解は すでに Hourani, Cusack )1991( 及び aferSch ら ( 1 9 7 9 ）により報告されているが，今回の実験のように PGE1 または PGD2 に DDA を併用することで， cAMP 産生を阻止し，血小板凝集をみたという報告は ない．今回PGE1, PGD 2 に DDA を併用することで血 小板の凝集をみたのは， PGE1 またはPGD2 が血小板 凝集間害のレセプターに結合しでも adeny I cselayc 回害剤のDDA があるためにcAMP は産生されず， 血小板凝集阻害の反応へと進行せずに血小板凝集レセ プターに結合した反応のみが進行したためで、あると考 えられる． 一方， PGE1 またはPGD2 の単独投与では 血小板凝集と凝集間害のレセプターに結合するが，そ の両者のレセプターからの反応が進行し， cAMP は抑 制と増加の反応の合計として産生される. DDA 併用 の場合と異なり cAMP 量は増加するために（Table 1 ) ，血小板凝集はおこらず凝集阻害（Ojima, ,atijuF 1 9 7 6 ）になったと考えられる． ヒスタミンH1 や H 2, アデノシン A1 やA2 作用あるいはアドレナリン α， β作用などのように，オータコイドや低分子生体内物 質は相反する薬理作用をl 分子で持 っていることが多
い （高柳，小池， 8691 ）.低分子の PGE1 とPGD 2 も 相反する薬理作用をI分子でもっていると考えられる． 今回の結果は PGE1 が既に明らかにされている血小 板凝集阻害ばかりでなく，すでに報告されているよう に（小島， 1991 ; Oa,imj ,oriuhkoT 2919 ,) PGE1 分 子の中に， 1つは血小板の凝集阻害レセプターに結合 できる構造と，もう Iつは血小板凝集レセプターに結 合できる構造の2つが入っていることを一部証明した ことになる．また，この結果はAshby 9891( ）のcAMP についての解析や Murray ら9891( ） のrotpceer l i g a n d ngindbi yssaa の解析及び Takasuka ら ( 1 9 9 4 ）のコンブォメーションの光学解析とも 一致し た． 結 論 PGE1 およびPGD2 は1 分子中に血小板凝集回害の レセプターに結合する構造と血小板凝集のレセプター に結合する構造とがあり，また，構造活性相関性から， a d e n y l sealycc 間害剤DDA を併用することによって 血小板凝集がおこるという推定にたち，その影響を観 察した．その結果， PGE1 およびPGD2 は血小板凝集 阻害ばかりでなく，血小板凝集の作用をも有している 物質であることを確認した． 文 献 4 0 1 6 Da,eirrr-Feidva
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