加東市内に局所的に自生するササユリ（Lilium japonicum Thunb.）の系譜的関係を解析するためのＳＴＳマーカーの開発

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(1)加東市内に局所的に自生するササユリ（〃肋㎜ノ砂。〃ω㎜Thunb）の. 系譜的関係を解析するためのSTSマーカーの開発教科・領域教育学専攻自然系（理科）コース. M 0 8 1 9 2 E. 山本博史研究室で保存されていた加東市内に自生する. 1．序論ササユリ（Z〃。㎜ノ幼。〃jω㎜Thmb．）はユリ. ササユリの遺伝子をテンプレートにし、RAPD. 属の日本固有種で、現在、全国的に自生固体数. 法を行った。得られた300から600bpのバンド. は減少している。そのため、各都道府県の内7. のうち、特異的なバンドもしくは切り出しやす. 県が、ササユリを絶滅危惧I A類、絶滅危惧I. そうなバンドを抽出・精製した。精製したDNA. B頚あるいは絶滅危惧II類に指定している。さ. をT・vectorpMD20にライゲーションし、大腸. らに2県は、準絶滅危倶類に指定している。加. 菌（JM109株）に形質転換した。そして、それを. 東市（杜地区）でも、昔は自生のササユリが多く. アンピシリン、IPTG，X・ga1を含むLB培地に. みられたが、現在ではほとんど見られない。兵. 播種後、37℃で一晩培養した。得られたコロニ. 庫県立「やしろの森公園」では、開園当時（2000. ーをブルー・ホワイトセレクションで選別し、. 年）数個体しかササユリが確認されていなかっ. 候補のコロニーからプラスミドを抽出した。. た。ところが、7年後に436個体も自生ササユ. シーケンスには、ダイクーミネータ・サイク. リが確認されている。そこで，本研究室は加東. ルシーケンス法で行った。精製したプラスミド. 市内に自生するササユリがどのようにして広が. をテンプレートとしBig Dye（v1．I）を用いて. っていったのか、その分布の変動を調べること. PCRを行った。PCR産物を3130シェネティ. を目的とした。市川（2007）は、加東市内に自生. ックアナライザー仏pp1ied Biosystems杜）を. するササユリと他府県産の個体合わせて65個. 用いてで配列を調べた。. 体を対象にRAPD（RandomAmp11丘ed. 3、結果および考察. Po1ymo叩hic DNA）法（Wi1iamら、1990）を用. 得られた配列からRAPD法で用いたプライ. いてどの程度遺伝子の交流があるのかなど系譜. マーの配列を検出した。そして、そのプライマ. 的関係の分析を試みた。その結果、採取した地. ーから3’端側へ8塩基伸ばした20塩基をプラ. 域全体で遺伝子の交流が行われていると報告し. イマーの候補とした。設計したプライマーが，. た。だが、RAPD法は、再現性や信頼性が低い. PCR反応で特異的に任意配列を増幅させるこ. など欠点があげられる。そこで、RAPD法の結. とができるかは，使用するプライマーのアニー. 果をもとに本研究は、再現性が高く、より多く. リング温度に依存する．今回，設計したプライ. の遺伝情報を得るためにRAPD法で得られた. マーは，組み合わせごとにGCとATを含む割. バンドを同定標識（STS；Sequence Tagged. 合が異なる．そこで、今回の組み合わせに合っ. Sites）化し、遺伝的解析に有効なプライマーの. た温度設定をする必要があった。アニーリング. 開発を試みた。. 温度の基準となるTm値の推定には，最近接塩. 2．材料及び操作方法. 基対法（Nearest Neighbor method），Wa11ace. 一370一.

(2) 法，GC％法の3つの方法がある．今回設計した. が行われていることが推測できた。さらに、池. プライマーの組み合わせは，いずれの計算方法. 之内と馬瀬は、ヘテロ型の遺伝子を示すプライ. でもTm値に差が生じた．一番大きな温度差は，. マーセットは、1つだけだった。この結果から. 最近接塩基対法で16℃であった．そこで，比較. この2ヶ所は、徐々に外部との交流が減少し閉. 的温度差の小さいGC％法で計算したところ各. 鎖的な交配へと移行していると思われる。. プライマーの組み合わせのうち，低い温度を必. 一方、鴨川の郷では、多くのヘテロ型の遺伝. 要とするプライマーのTm値が52．2から. 子が検出され、最も遺伝子の交流が盛んな地域. 58．3℃と55℃前後の温度を示していた．この結. と考えられた。. 果から全てのプライマーに対してアニーリング. 今回の研究で設計したプライマーを用いて. 温度を55℃と設定した．. PCRし、電気泳動した結果バンドの濃淡や. 設計したプライマーの有効性を確認するため. 100bp付近でのバンドの増幅が検出された。こ. にやしろの森公園、上久米、上鴨川6種類をテ. の増幅産物は、非特異的な増幅によるものと思. ンプレートにしてPCRと電気泳動を行った。. われる。そこで、これらを解決するために各プ. その結果、12種類のプライマーセットでバンド. ライマーセットにおけるアニーリング温度や反. の有無が確認された。その結果，プライマー6. 応時間の再検討が必要と思われる。さらに、よ. セットでバンドが見られた。そこで、バンドの. り正確に遺伝子の交流を調査するために現在設. 増幅が確認できなかったプライマー、テーリン. 計したプライマーの組み合わせを変えて多くの. グが見られたプライマーをそれぞれプライマー. 遺伝情報を得ることが、有効と思われる。また、. 設計を再度行った。. 別の視点から遺伝子の交流を調査するために. この結果、本研究で作成した12セットのプ. SSR（Simp1e Sequence Repeats）マーカーの開. ライマーセットは加東市内で自生するササユリ. 発も有効と思われる。. の遺伝的交流を知るツールとして有効であると. 今回実験で用いた個体数は20個体である。. 判断した。. 地域的に見てみると各地域2個体でしか設計し. さらに、今回設計したプライマーを用いてや. たプライマーを用いてPCR、電気泳動を行って. しろの森公園、上久米、池之内、上鴨川、下鴨. いない。そのため、今回の結果が地域性を示し. 川、馬瀬、鴨川の郷のそれぞれ1個体以上を使. ているということは言えない。そこで、これか. い合計20個体の遺伝子の解析を行った結果、. ら、本研究室で保存しているササユリのサンプ. やしろの森公園という同地域内でも中央の谷、. ル約100個体を調べる必要がある。. 西の谷、東の谷でそれぞれ異なる結果を得た（図. 2）。中央の谷では、ほとんどホモ型の遺伝子し. か確認できず閉鎖的に交配が行われていると推測された。一方、西の谷と東の谷では、同じプライマーでヘテロ型を示す個体が検出された。. このことから同じ地域から花粉や種子がそれぞれの地域へ侵入した可能性が考えられた。. 図設計したプライマーでPCRを行ったサンプルの. また、下鴨川と上鴨川は、どのプライマーセ. 電気泳動像 a：ヘテロ型遺伝子 b：ホモ型. ットを用いてもホモ型の遺伝子しか示さなかっ. 主任指導教員渥美茂明. た。このことからこの2ヶ所は、閉鎖的に交配. 指導教員渥美茂明. 一371一.

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