Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College, Available from http://ir.tdc.ac.jp/
Title
№１１：Counterselectable markerless mutagenesis に
よるS. mutans glk 遺伝子の失活
Author(s)
佐藤, 裕; 東, 俊文
Journal
歯科学報, 114(3): 288-288
URL
http://hdl.handle.net/10130/3330
Right
目的：遺伝子失活変異株の構築は抗生物質耐性遺伝 子を標的遺伝子内に挿入するのが一般的である。プ ラスミドにクローニングまたは PCR 法で，標的遺 伝子中央に抗生物質耐性遺伝子を挿入した DNA 断 片を構築後，これで対象菌株を形質転換し，抗生物 質耐性コロニーとして標的遺伝子失活変異株を得 る。しかし，この方法では１つの菌株で失活できる 遺伝子の数は使える抗生物質の数に依存するので， 多くとも３乃至４というのが現状である。そこで近 年失活遺伝子の数に制限がない方法が考案されつつ あり，その１つである本法による glk 遺伝子失活変 異株構築を試みた。 方法：本法は２０１１年に Merritt らにより報告された もので，２回の形質転換を行う。第１段階は従来法 と同様であり，glk 上流断片（glk５）とエリスロマ イシン（Em）耐性遺伝子，変異したフェニルアラ ニン（Phe）tRNA 合成酵素遺伝子および glk 下流 断片（glk３）を結合した断片を用いた。この形質転 換体は Em 耐性且つ Phe アナログである p-Chloro-Phe 感受性（p-Cl-p-Chloro-Phes ）となる。そして第２の形質 転換において glk５-glk３断片を用い，Ems , p-Cl-Pher コロニーを得ることで markerless の glk 失活変異株 を得た。また細胞破砕抽出液の Glk 活性は NADPH の３４０nm の吸光度を指標として測定した。 結果および考察：本菌はデンプンを直接利用するこ とが出来ない。しかし，唾液アミラーゼによる加水 分解に応じて本菌に利用されるようになり，マル トースはグルコースと同程度の速度で利用される。 従って本菌は口腔内では見かけ上デンプンを代謝す る。し か し，S. mutans に よ る デ ン プ ン 及 び マ ル トース代謝機構は未だ不明の点がいくつかある。そ の１つとして演者らはこの必須遺伝子産物としてグ ルカノトランスフェラーゼを昨年報告した。S. mu-tans細胞内ではこの酵素作用でグルコースが生成す るので，この代謝にはグルコキナーゼ（glk 遺伝子 産物）が必須である。そこでこの glk 失活に本法の 適用を試み，同変異株を得た。同変異株では Glk 活 性（Glucose+ATP→G６P）が 親 株 の１／１００に 減 少 し，この遺伝子産物のほかに Glk 活性を示す酵素は 存在しないと思われた。にもかかわらず，glk 変異 株は親株の８０％弱ほどの増殖速度を有していた。 従って ATP 以外のリン酸供与体の存在が推定され た。 目的：胎生期咀嚼筋は側頭筋原基から分化し，個々 の筋肉へと発達していく。近年，胎生期咀嚼筋の収 縮が口腔領域における骨の成長に影響を与えること が分かってきた。しかし胎生期咀嚼筋とメッケル軟 骨，さらに下顎骨との関係を研究した報告は少なく 不明な点が残されている。そこで今回は，下顎骨内 側に位置する内側翼突筋に焦点をあて，筋−骨接 合部に集積する desmin と間葉細胞の安定に重要な vimentin を検索した。 方法：試料 と し て，胎 生１２．５∼１５．５日 の ICR 系 マ ウスを用いた。形態学的観察のため H-E 染色を， desmin と vimentin の局在を検索するため，免疫組 織化学的染色を行った。また，レーザーマイクロダ イゼクションにより内側翼突筋を選択的に採取し， これらタンパクの遺伝子発現についても検索を行っ た。 成績：内側翼突筋の desmin の発現量は，胎生１２．５ ∼１５．５日にかけて増加していった。胎生１２．５日に は，内側翼突筋とメッケル軟骨の接触部に desmin は集積していた。胎生１３．５日になるとメッケル軟骨 以外に，将来下顎骨と接触する位置に desmin の集 積を認めた。胎生１４．５日では内側翼突筋は複数の筋 束に分かれ，筋中央に desmin は集積するように なった。この傾向は胎生１５．５日においても同様の結 果であった。一方 vimentin は胎生１２．５∼１５．５日ま でその発現量は変わらなかった。また，免疫組織化 学的染色の結果は RT-PCR の結果と一致していた。 考察：内側翼突筋は胎生１４．５日において複数の筋束 を有するようになった。この時期は未分化な下顎骨 が発生してくる時期と一致しており，内側翼突筋と 下顎骨が相互に作用し発達していくことが考えられ た。また，咀嚼運動の開始以前である胎生１２．５日か ら筋−骨接合部に desmin が集積することもわかっ た。このことから，早期筋収縮によるメカニカルス トレス以外に desmin が集積する要因があるのでは ないかと考えられた。さらに胎生１４．５日においてか らは筋中央にも desmin の強い集積が認められた。 したがって desmin を観察することにより複数の筋 束が出現する時期を明確にできることがわかった。 一方，vimentin は胎生１２．５日から胎生１５．５日まで 発現量に変化はなかった。したがって vimentin が 内側翼突筋発生初期より常に発現し，この筋が発達 発育するにあたって細胞の安定を維持し続けている と考えられた（動物実験承認番号２６０１０６）。
№１１：Counterselectable markerless mutagenesis による S. mutans glk 遺伝子の失活
佐藤 裕１），東 俊文１）２）（東歯大・生化）１）（東歯大・口腔科学研究センター）２）
