道央地区一般検査研修会資料 知っておきたい! 尿蛋白定量検査 和光純薬工業 ( 株 ) 谷本和仁 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.

２０１０.１０.１４

和光純薬工業（株）

谷本和仁

知っておきたい！

尿蛋白定量検査

道央地区一般検査研修会資料

腎臓の働き

・尿として老廃物を出す

・電解質のイオンのバランスを保つ

・血圧の調整を行う

・造血ホルモン（エリスロポエチン）を分泌する

・活性型ビタミンＤ3を作る

⇒骨の生成に必要

腎臓の構造と働き

糸球体：濾過

尿の一般正常検査（１）

放置によりアンモニア臭

膀胱炎：腐臭

ケトン体↑：果実様臭気

一種の芳香性

尿臭気

尿酸塩、炭酸塩、リン酸塩、Ca塩、

細菌尿

排尿直後は透明

尿混濁

黄褐色：ﾋﾞﾘﾙﾋﾞﾝ尿、ｳﾛﾋﾞﾘﾝ尿

赤色：血尿

麦わら黄色～淡黄褐色

尿色調

2000mL

：多尿

500mL

：乏尿

100mL

：無尿

1000～1500mL

尿量

備考

健常人

項目

尿の一般正常検査（２）

電解質(Na

+

､Cl

-

)と尿素のﾓﾙ数に支配

50～1300mOsm/kg

通常は

500～800mOsm/kg

尿浸透圧

尿中固形分の含量を示す

1.035を超えることはない

⇒ 腎の濃縮力の限界

1.005～1.030

尿比重

動物性食品 ⇒ 酸性

植物性食品 ⇒ アルカリ性

細菌尿 ⇒ アルカリ性

一般に酸度の高い尿は色が濃く、

低い尿は色が淡い

弱酸性 pH６程度

（摂取した食物でpH4.5～

7.5）

ｐＨ

備考

健常人

項目

尿成分の代表的検査（１）

0.4～1.2g/日

酵素法

尿酸

6.5～13.0g/日(尿素量14～28g/日)

酵素法

尿素窒素

0.5～1.5g/日

酵素法、Jaffé法

クレアチニン

2～20mg/dL, 40～85mg/日

酵素法

グルコース

11～253μg/L

免疫法(Latex他)

β

２

-ﾐｸﾛｸﾞﾛﾌﾞﾘﾝ

蓄尿 23.8mg/L以下(18.6mg/g Cr以下)

早朝尿16.5mg/L以下(10.8mg/g Cr以下)

随時尿29.3mg/L以下(24.6mg/g Cr以下)

免疫法

微量ｱﾙﾌﾞﾐﾝ

20～120mg／日

比濁法､

色素比色法

蛋白

健常人の排泄量

原理（例）

項目

尿成分の代表的検査（２）

70～250mEq/日

イオン電極(ISE)

Na

25～100mEq/日

〃

K

70～250mEq/日

〃

Cl

20～120mg/日

酵素法､

色素結合法

Ca

0.1～0.2g/日

酵素法、

ｷｼﾘｼﾞﾙﾌﾞﾙｰ法

Mg

0.5～1g/日

酵素法、

ﾓﾘﾌﾞﾃﾞﾝ酸UV法

無機リン

健常人の排泄量

原理（例）

項目

尿成分の代表的検査（３）

S-Amy：P-Amy≒4：6

ACCR（ｱﾐﾗｰｾﾞ尿中ｸﾘｱﾗﾝｽとｸﾚｱﾁﾆﾝｸﾘ

ｱﾗﾝｽ比）:2.3±0.5（1.4～4.0%）

各種基質法

アミラーゼ

随時尿 1～4.2U/日

男性 1.9～8.7U/日

女性 1.3～4.5U/日

各種基質法

NAG

(N-ｱｾﾁﾙ-β-D-ｸﾞ

ﾙｺｻﾐﾆﾀﾞｰｾﾞ

100μg/L以下

ラテックス凝集法、

金コロイド比色法

シスタチンC

健常人の排泄量

原理（例）

項目

その他

尿沈査、妊娠検査、尿路結石検査、乱用薬物検査

クレアチニン補正とは

尿中成分濃度は尿の濃縮や希釈により異なる

運度など汗をたくさんかいた →

濃縮

水やビールをいっぱい飲んだ

→

希釈

なんらかの補正が必要

クレアチニンは筋肉中に存在するクレアチンの代謝物で

尿中に排泄されるクレアチニンの絶対量は水分や食事に

関係なくほぼ一定である

尿中成分濃度の補正にクレアチニンが使われる

クレアチニン補正の効果

健常人随時尿中アミラーゼ活性の日差変動

一見日差変動の激しいアミラーゼ活性もクレアチニン補正を

すると、安定していることがわかる。

0

100

200

300

1

2

3

4

5

6

7

8

9

測定日

ク

レ

ア

チ

ニ

ン

濃

度

0

200

400

600

ア

ミ

ラ

ー

ゼ

活

性

クレアチニン濃度 (mg/dL)

アミラーゼ 随時尿中 (U/L)

アミラーゼ Cre補正 (U/g･Cr)

補正式：アミラーゼ(U/L)÷クレアチニン(g/L) → U/g･ｸﾚｱﾁﾆﾝ

尿タンパク測定の臨床的意義

血液中の

タンパク

は、腎臓の糸球体でろ過される。(原尿。)糸球体はふるい状に

なっており、分子量の小さいタンパクは、原尿に排出されるが、尿細管で再吸収さ

れるため、通常尿中ではほとんど検出されない。

蛋白尿の分類

蛋 生 ・

機 能 性 蛋 白 尿

： 激 し い 運 動 後 、 入 浴 後 、 興 奮 後 、 妊 娠 時

白 理 ・

体 位 性 蛋 白 尿

： 起 立 性 、 体 を 弓 な り に 反 ら せ た と き

尿 的

・

腎 前 性 蛋 白 尿

：

病

全 身 性 疾 患 ： 発 熱 、 静 脈 う っ 血 、 心 不 全 な ど

的

特 殊 蛋 白 尿 ： ミ オ グ ロ ビ ン 尿 、 ヘ モ グ ロ ビ ン 尿 、

蛋

ベ ン ス ジ ョ ー ン ズ 蛋 白 尿 な ど

白

・

腎 性 蛋 白 尿

：

尿

糸 球 体 腎 炎 、 ネ フ ロ ー ゼ 症 候 群 、 腎 腫 瘍 な ど

・

腎 後 性 蛋 白 尿

：

尿 管 、 膀 胱 、 尿 道 、 結 石 、 炎 症 、 腫 瘍 な ど

→いずれも良性

体位性蛋白尿

安静時には蛋白尿は陰性だが、

起立

や

体を弓なり

に

反らせたときに腎臓を圧迫して出る蛋白尿

身長が急速に伸びる時期に多く見られる

尿蛋白の判定は早朝尿で行うべき

学童検診の一次検尿では

2.5%

の陽性率

→二次検尿で

0.2%

、腎臓病と診断されるのは

0.01%

*1)

*1)平成13年神奈川県学校・腎疾患管理研究会医師部会

第30回研究会講演（竹中道子）資料より

尿中蛋白測定方法

測定

対象

Kingsbury-Clark法

3%スルホサリチル酸溶液

尿

尿 1ml+試薬 3ml

蛋白種による濁度差大

比濁法

(K-C法)

髄液 →室温10分放置

(ｱﾙﾌﾞﾐﾝはｸﾞﾛﾌﾞﾘﾝの2～4

→吸光度測定(660nm)

倍の濁度を示す),薬剤,

温度の影響大

Meulemans法

3%ｽﾙﾎｻﾘﾁﾙ酸-7%硫酸Na溶液

試料lml+試薬4ml

蛋白種による濁度差

ベンゾニウム

①NaOH･EDTA･4Na溶液,

→室温10分放置

あり,温度の影響あり,ｳｼ

クロライド法

②0.2%ﾍﾞﾝｿﾞﾆｳﾑｸﾛﾗｲﾄﾞ溶液

→吸光度測定

ｱﾙﾌﾞﾐﾝは標準物質として

(尿：600nm, 髄液 450nm)

使用不可

ﾋﾟﾛｶﾞﾛｰﾙﾚｯﾄﾞ･

市販キット

尿

試料50μl(または20μl)

蛋白種による呈色差小,

ﾓﾘﾌﾞﾃﾞﾝ錯体発色法

(Micro TP-Test Wako,

髄液 ＋発色試液 3ml

検量線200mg/dl(試料50

色素に

和光純薬)

→室温20分放置

μl)まで直線,ｾﾙや器具類

よる

→吸光度測定(600nm)

への汚染がほとんどない

比色法

ﾌﾞﾛﾓﾋﾟﾛｶﾞﾛｰﾙﾚｯﾄﾞ

市販キット

(専用機ｵｰｼｮﾝﾏｽﾀｰ,

蛋白種による呈色差小,

(色素

ｲﾝｼﾞｳﾑ錯体発色法

(ﾏｽﾀｰﾃｽﾄPRO,ｱｰｸﾚｲ)

ｱｰｸﾚｲ)167検体/時

ｾﾙや器具類への汚染が

結合法)

ほとんどない

Coomassie Brilliant

CBB G250:100mg, 95%ｴﾀﾉｰﾙ:

試料 0.lml十試薬 5ml

操作法簡単,高感度,蛋白

Blue G250法

50ml, 85%ﾘﾝ酸:100mlを

→室温10分放置

種による呈色差小,色素に

(CBB G250法または

精製水で1Lにする市販ｷｯﾄ

→吸光度測定(595nm)

よる器具類の汚染あり

CBB法)

(ﾄﾈｲﾝTP-Ⅱ,大塚ｱｯｾｲ)

測定法

試薬

測定操作概略

特徴

蛋白尿の分類と疾患

１．腎前性蛋白尿

(血清アルブミンより小さな蛋白成分）

①肝臓由来低分子蛋白（α1、α2糖蛋白）・・・慢性感染症、悪性腫瘍

②M蛋白（BJP、H鎖フラグメント）・・・骨髄種

③組織破壊（ヘモグロビン、ミオグロビン）・・・生体内溶血、筋組織破壊

２．糸球体性蛋白尿（血清蛋白）→糸球体基底膜に損傷

①炎症性病変

②病的物質の沈着・・・アミロイド腎、糖尿病性糸球体、ＩｇA腎症

③糸球体内の血流うっ帯・・・腎静脈血栓症、うっ血性心不全

④体位性蛋白尿

３．尿細管性蛋白尿（組織蛋白、β2MG、α1MG、ﾘｿﾞﾁｰﾑ、ﾚﾁﾉｰﾙ結合ｸﾞﾛﾌﾞﾘﾝ）

・・・カドミウム中毒、低カリウム血症による腎障害、骨髄腫腎、先天

性異常（Fanconi症候群、Lowe症候群、Wilson病、アミノ酸尿症）

生理的蛋白尿

４．破綻性蛋白尿

尿路系を囲む脈管系（血管、リンパ管）の破綻

平成21年度日臨技サーベイより

尿タンパク測定の現状

測定法

施設数

割合

ピロガロールレッド法

1675

86%

ピロカテコールバイオレット法

109

5.6%

ブロモピロガロールレッド法

27

1.4%

ベンゾニウムクロライド法

50

2.6%

CBB－Ｇ２５０法

57

2.9%

その他

32

1.6%

合計

1950

CBB－

Ｇ２５０法

2.9%

その他

1.6%

ベンゾニウ

ムクロライド

法

2 .6%

ブロモピロ

ガロール

レッド法

1.4%

ピロカテ

コールバイ

オレット法

5.6%

ピロガ

ロール

レッド法

86%

ＰＲ法測定原理

O

OH

OH

O

O

H

SO

₃

H

ピロガロールレッド

（ＰＲ）

－Ｍｏ(Ⅳ)

ＰＲ－Ｍｏ－蛋白結合体

ピロガロールレッド・モリブデン錯体発色法

ピロガロールレッド(PR)はモリブデン酸と結合し、赤色錯体を形成する。

この錯体は、酸性条件下でタンパクと結合すると、極大吸収波長が長波長

側にシフトし青紫色を呈する。この青紫色の吸光度を測定することにより試

料中のタンパク濃度を求める。

(660nm)

＋蛋白

①アルブミンとγ-グロブリンの反応性が異なる

→検体のA/G比が変わると測定値が変わる

②低値直線性のもぐり

→正常域の測定値が低値になる

①アルブミンとグロブリンの反応性を

同一化（１：１）

→検体のA/G比に依らず、測定値が一定

②低値直線性の改善

→正常域の精度向上

改良点

*蛋白標準液(100mg/dL)は

ヒトアルブミン100%

現製品(AR)

2000

2500

3000

3500

4000

4500

O

D

×

1

0

0

0

0

blank

蛋白標準液

アルブミン

γ-グロブリン　

改良品

2000

2500

3000

3500

4000

4500

O

D

×

10

00

0

blank

蛋白標準液

アルブミン

γ-グロブリン　

現行品 改良品

アルブミン　(100mg/dL)

100.1

99.8

グロブリン　(100mg/dL)

77.3

98.7

アルブミンとグロブリンの反応性

現行品

直線性①

(mg/dL)

vs理論値

現製品

改良品

現製品

改良品

1

7.6

9.8

85%

98%

2

16.0

19.5

89%

98%

3

24.5

29.0

91%

97%

4

33.3

38.8

93%

97%

5

42.2

49.3

94%

99%

6

51.7

59.0

96%

98%

7

61.0

69.0

97%

99%

8

70.1

79.7

97%

100%

9

79.0

89.2

98%

99%

10

89.9

99.9

100%

100%

低値直線性の改善（コントロール血清I（Glb含有）50倍希釈） ）

低値直線性が改善され、正常値付

近の精度が向上

0

20

40

60

80

100

120

希釈系列

m

g

/

d

L

現製品

改良品

現行品

現行品

直線性②

高値直線性（コントロール血清I（Glb含有）9倍希釈）

(mg/dL)

vs 理論値

現行品

改良品

現行品

改良品

1

58.9

66.6

94%

96%

2

125.0

139.4

100%

100%

3

189.8

213.6

101%

102%

4

258.9

284.8

104%

102%

5

323.5

351.4

104%

101%

6

389.6

418.2

104%

100%

7

458.3

483.6

105%

99%

8

506.3

544.8

101%

98%

9

557.7

601.8

99%

96%

10

611.8

666.0

98%

96%

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

6 0 0

7 0 0

8 0 0

希釈系列

m

g

/

d

L

現行品

改良品

コントロール測定値

血清コントロールはグロブリンを約

41％含有している。

現行品のグロブリン反応率は約

75％であるため、改良品は

41％×25％=10％程度高値となる。

現行品

改良品

尿コントロールI

me an

1 4 .9

17 .2

対現行品

10 0 .0%

1 15 .4 %

尿コントロールII

me an

5 2 .5

55 .8

対現行品

10 0 .0%

1 06 .3 %

血清コントロールI

me an

8 8 .9

99 .0

(5 0倍希釈)

対現行品

1 00 %

1 1 1%

血清コントロールII

me an

1 3 8 .2

15 1 .2

(5 0倍希釈)

対現行品

1 00 %

1 0 9%

現行品との相関（尿検体）

実検体尿(n=50)

y = 1 . 0 6 3 3 x + 1 . 0 0 7 2

R

2

= 0 . 9 9 9 3

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

6 0 0

7 0 0

0

1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0

現製品(AR)

改

良

品

y = 1 . 0 2 8 5 x + 1 . 8 2 6

R

2

= 0 . 9 9 7 6

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

現製品(AR)

改

良

品

拡大

現行品との相関（髄液）

実検体髄液(n=30)

y = 1 . 1 1 9 2 x + 2 . 9 8 3 1

R

2

= 0 . 9 9 9 8

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

3 0 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

3 0 0

現製品(AR)

改

良

品

y = 1 .0 9 4 7 x + 3 . 3 9 3 2

R

2

= 0 . 9 9 8 3

0

2 0

4 0

6 0

8 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

現製品(AR)

改

良

品

拡大

現製品との相関（２）

尿検体(n150)

髄液検体(n84)

y = 1 . 0 1 8 1 x + 3 . 7 3 3 2

R

2

= 0 . 9 9 7 9

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

現製品　 H7 1 8 0

改

良

品

H

7

1

8

0

y = 1 . 0 7 5 1 x + 5 .3 6 3 8

R

2

= 0 . 9 9 9 2

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

現製品　H7 1 8 0

改

良

品

H

7

1

8

0

各種蛋白との反応性

[mg/ dL]

現製品(AR)

改良品

アルブミン

mean

100 .1

99 .8

対改良品

α1 - アンチトリプシン

me an

87 .5

90 .3

(α-グロブリン分画)

対改良品

9 7 %

トランス フェリン

mean

11 0 .1

14 9 .8

(β-グロブリン分画)

対改良品

7 3 %

γ- グロブリン

mean

77.3

98 .7

対改良品

7 8 %

発色色素；アシッドバイオレット（ポンソーよりも高感度）

いずれの検体も5～10倍濃縮液を使用

尿蛋白分画図

アルブミン

80.1%

α1-グロブリン 0.9%

α2-グロブリン 3.6%

β-グロブリン

4.9%

γ-グロブリン 10.5%

アルブミン

78.2%

α1-グロブリン 2.7%

α2-グロブリン 2.1%

β-グロブリン

6.9%

γ-グロブリン 10.1%

アルブミン

69.4%

α1-グロブリン 1.1%

α2-グロブリン 6.3%

β-グロブリン

6.8%

γ-グロブリン 16.4%

サーベイ試料（

_{H21年埼玉サーベイ結果）}

測定データの互換性

現 行 試 薬 （報 告 値 ）　　*標 準 も現 行 使 用

測 定 法

日 立 7170

QUICK RUN

用 手 法

試 薬

μ TP AR

μ TP AR

μ TP テ スト

液 量 　S/R（μ L）

　2/250

　5/300

用 手 50/3000

サー ベ イ 試 料 № 51A

62.7

60.8

62.6

vs 7170

97%

100%

サー ベ イ 試 料 № 52A

155.2

142.5

145.9

vs 7170

92%

94%

改 良 試 薬 　　*標 準 も改 良 品 使 用

測 定 法

日 立 7170

QUICK RUN

用 手 法

試 薬

μ TP AR

μ TP AR

μ TP テ スト

液 量 　S/R（μ L）

　2/250

　5/300

用 手 50/3000

サー ベ イ 試 料 № 51A

65.8

66.3

66.2

vs 7170

101%

101%

サー ベ イ 試 料 № 52A

156.1

156.4

157.6

vs 7170

100%

101%

その他の低分子血漿蛋白

α

₁

_{-ミクログロブリン}

レチノール結合蛋白（ＲＢＰ）

リゾチーム（ムラミターゼ）

尿中酸可溶性蛋白

(acid soluble protein:ASP)

血清中のα

₁

_{-酸性糖蛋白､トランスフェリン､Tamm-Horsfallムコ蛋白}

Bence Jones蛋白

FDP（フィブリノゲン／フィブリン分解産物）

尿中特殊蛋白

開封安定性

開封後期間

初日

1週間

2週間

3週間

4週間

5週間

Blank

n=1

2233

2257

2199

2204

2207

2204

生食水

n=2

2244

2263

2202

2208

2209

2208

n=3

2252

2261

2200

2210

2203

2209

Ave.

2243

2260

2200

2207

2206

2207

標準感度

n=1

813

810

821

797

803

811

蛋白標準液

n=2

821

807

806

805

815

797

n=3

814

813

800

797

805

799

AM382

Ave.

816

810

809

800

808

802

対初日

100%

99%

99%

98%

99%

98%

尿コントロールI

n=1

17.5

16.9

16.9

17.3

18.1

17.6

n=2

17.5

17.8

17.8

17.3

16.1

17.2

62241

n=3

17.1

17.7

16.9

17.8

17.7

18.1

Ave.

17.4

17.5

17.2

17.5

17.3

17.6

対初日

100%

101%

99%

101%

99%

101%

尿コントロールII

n=1

56.2

57.2

56.1

57.2

56.2

57.7

n=2

55.3

56.9

56.2

57.9

57.0

55.8

62242

n=3

55.6

57.3

54.8

57.0

56.0

55.8

Ave.

55.7

57.1

55.7

57.4

56.4

56.4

対初日

100%

103%

100%

103%

101%

101%

自動分析装置（日立７１７０ｓ ）にセッティングした状態で 開封試験実施。

開封5週間後でも試薬性能は維持されており、安定性は良好で あった。

開封安定性

2260

₂₂₀₀

₂₂₀₇

₂₂₀₆

3070

₃₀₀₉

₃₀₀₇

₃₀₁₄

2207

2243

3009

3059

17.5

17.2

17.5

17.3

57.1

_55.7

57.4

_56.4

17.6

17.4

56.4

55.7

2000

2500

3000

3500

4000

0

1

2

3

4

5

週目

吸

光

度

(O

D

x1

00

00

)

0

20

40

60

80

測

定

値

(m

g/

dL

)

Blank

(ODx10000)

標準液

(ODx10000)

ﾗｲﾌｫﾁｪｯｸ

尿ｺﾝﾄﾛｰﾙ

(1)

(mg/dL)

ﾗｲﾌｫﾁｪｯｸ

尿ｺﾝﾄﾛｰﾙ

(2)

(mg/dL)

御

静

聴

あ

り

が

と

う