博 士 （ 医 学 ） 常 松 学 位 論 文 題 名
マウスにおけるp 53Yeast Functional Assay 法の確立とそのp 53 変異検出能の評価
学位論文内容の要旨
泉
（背景・目的）
癌の発生，悪性進展の過程においては，癌原遺伝子の変異や過剰発現ならびに、癌抑制 遺伝子の変異，欠失などが多段階的に起こり，悪性形質が獲得される，癌抑制遺伝子p53 は，ヒトの悪性腫瘍において最も変異，欠失が多く報告される遺伝子であり，悪性腫瘍の 半 数 以 上で 何 らか のp53の 異常 が みら れ る．p53遺 伝 子産 物 は標 的 遺伝 子 であ る p21/wafl／cipl，Baxなどの転写を活性化し，その結果細胞周期の停止，アボトーシスの誘 導など癌化を抑制する機能を発揮する，従ってこのようなp53の機能の喪失は癌化と密接 にかかわるものと思われる，
マウスを用いたモデル実験はこのようなp53の変異と癌化の関係を解析する上で有用で ある，マウスでは化学物質やウイルスによる発癌，さらにrransgenlc mouseにおける発 癌実験などがなされており，これらの多くにp53変異が見いだされている，ヒトと同様に p53が癌の発生過程に重要な役割を果たしていることは，p53のノックアウトマウスでは 高 率に癌が発生することからも明らかである．現在，マウスp53の変異の解析は主に SSCP法を利用した変異スクリーニングにもとづき行われている．しかし この方法は手 技に習熟を要し，また変異細胞の数がサンブル中に少ない場合や，変異が多様である場合 は検出が困難であるといった問題がある，近年ヒトp53の鋭敏な検出法として開発され たyeasr functional assay法は 1）変異p53の検体中での害0合が赤コロニーの割合によ って表現されるため、判定の再現性、客観性が高い，2）検体中の変異p53の割合が低い 場合でも，異常の検出が可能，3）p53の機能的な変異のみを検出することが可能，4） 赤コロニーからブラスミドを回収することにより変異p53の塩基配列決定が容易である，
な どSSCP法 に な ぃ 長 所 を も っ た 優 れ た 方法 で ある ， マウ ス にお け るp53 yeasL functi。nal ass ay法の確立は，p53の役割の解析に大きく資するものと思われるが，そ れ に成功したとする報告はなぃ，そこで実際にマウスのp53発現ベク夕一を構築し，
yeasL functional assayを行ったところ，正常検体での赤コロニーのバックグラウンドが 異常に高く実用的でないことが判明した．著者はその問題点を解決し，より実用的なマウ スp53 yeasr functional assay法を構築するべく以下の実験を行った．1）マウスp53 のyeast funcCional assay用の発現ベクターのブロトタイブを作製し，assay上の問題の 原因を検証した．2）この結果に基づぃて，ハックグラウンドが低下するよう発現ベク夕 一の改変を行った，3）この新しいべクターを用いたアッセイ法の感度を検討し，その有 用性を検討するため，各種のマウス培養細胞ならびに紫外線照射XPC（色素性乾皮症相補 群C）遺伝子変異マウスのp53変異を検索した．
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（結果・考察）
1） ヒ トp53 yeast funccional assayに用 いられ るp53発 現ベ クタ ーを もとに ，マ ウス 野 性 型p53の 全 長 を 組 み 込 ん だ べ クタ‑pLSMP53．1を 構 築 し た ．こ の べ ク タ ー の コ ド ン66ー343に ギ ャ ッ プ を 設 け て， マウ ス正 常肝全RNAよりMMLV逆転 写酵 素を用 いてRTー PCRに よ り 増 幅 し たp53 cDNAのyeast functional assayを 行 っ た と こ ろ ，25．8土 2．8％の 赤コ ロニ ーが 出現 した．この赤コロニーは逆転写酵素のエラーおよびp53の偽遺 伝子 がPCRで 増幅さ れる こと によるエラーであると考え，逆転写酵素をSuperS criptIIヘ 変更 し，DNaseI処 理の 付加 を行ったところ赤コロニーは13．6土3．3％まで有意に減少し た．しかしヒト正常検体でのバックグラウンド赤コ口ニ一5．2土2．7弼より明らかに高率な ので ，赤 コロ ニー から べク ターを回収してマウス正常検体のp53変異を解析した．この結 果， マウ スp53 cDNA上 の6・7個のアデニン（A），または6個のチミン（T）が連続する部 位（以下6A，7A，6Tと略す）でAまたはTが挿入・欠失する変異が赤コロニーの46．196（全 コロ ニー の6．3％ ）に みら れた ，こ のよ うな部 位は ，ヒ トp53 cDNAで は1箇 所し か存 在 せず ，従 って マウ スで はこ れら の部 位で の高率 なエ ラー がyeasc funcLional assayの高 バックグラウンドの原因と考えられた．
2） マ ウ スp53 cDNA上 に は6Aが2箇 所，7A．6Tが それ ぞれ1箇所 ずっ ある ．こ のう ち，2 箇 所 の6Aと6Tはp53の5・ 側 に 存在 し，p53の変異 集積 部位 であ るDNA結 合ドメ イン 外で あるため，アッセイの評価領域から除外してもp53変異検出能｜ま損なわれないと考えた。
そこ でpLSMP53−1ベク 夕一 上のp5'3にア ミノ酸 変異 を伴 わない変異を加え，制限酵素切 断部 位の 変更 を行 った ．こ れによルギャッブ領域はコドン66―343からコドン111―343と なり ，5．側 の2箇 所の6A，6Tは ギャ ッブ 修復領 域か ら除 外された，この新たなべクタ一 pLSMP53Mlを 用 い てp53 yeasr functional assayを行 う と ， マウ ス正 常肝に おけ る赤 コロ ニー のハ ック グラ ウン ドは8．O士1．4%へと有意に低下した，またAまたはTが連続す る部位での変異は赤コロニーの30．8％（全コロニーの2．5％）へと減少していた，以上よ り ， 低 バ ッ ク グ ラ ウ ン ド の マ ウ スp53 yeastfunctional assayが 確 立 さ れ た ， 3） 新し く確 立され たマ ウスp53 yeast funcLional assayに よっ て各 種のマ ウス 培養 細 胞株 のp53変 異を解 析し た，QR，32で は51．7％ の赤 コロ ニ一 比率 を呈 し R246Lの変 異 が ．MerhAで は93．4％の 赤 コ ロ ニ ー を 呈 し ，C132Fの 変 異 ， およ ぴE168G，M234Iの変 異が 同定 され た．B16，colon 26の各シリーズでは赤コロニーは10％以下でバックグラウ ンドレベルであり変異はないと判定された，本アッセイにより培養細胞株の変異を効率よ く検出することが可能であった，
次 に ， ヌ ク レ オ チ ド除 去 修 復機 構の 構成 要素 であ るXPC遺伝 子に 変異 をも つXPC遺伝 子変異マウスについて検討した．紫外線を照射した部位に発生した皮膚癌組織では，88．1
％の 赤コ ロニ ーを 呈し ，R210Cの 変異 と，S238Pの変 異が 同定された，一方同一個体の紫 外線非照射皮膚組織では，8．O％の赤コロニーを呈し，正常組織と差はなかった，また紫外 線照射非腫瘍部皮膚組織では18．7％の赤コロニーを呈し，多様な変異が同定された．これ らの 変異 の多 くはdipyrimidine siteにおぃてCがTに変異したもので，正常組織のバック グラ ウン ドか ら同 定さ れる 変異 とは 異な ってい た． した がってこれらは紫外線照射によ る変異であることが示唆された．赤コロニーの18．7％への増加はヌクレオチド除去修復の 異 常 に 起 因 す る 様 々 なp53変 異 の 蓄 積 を 反 映 し て い る も の と 思 わ れ た 。 以上より，著者の確立したマウスp53 yeasL functional assayは培養細胞株及びマウス 腫瘍 組織 からp53変 異を 簡便 に検出できるばかりでなく，さらに実験発癌モデルでの多ク 口一ン性変異の検出，およびその頻度の推定を可能とした，今後，様々な癌の動物実験系 に お い てyeasL functional assayを用 いてp53の 変異 を解 析す るこ とに より ，p53変異 の発癌における役割がより明らかになることが期待される，
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学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
マウスにおけるp 53Yeast Functional Assay 法の確立とそのp 53 変異検出能の評価
ヒ トp53の 簡 便 か つ 敏 感 な 変 異 検 出 法 と し て 、p53 yeast functional assay法 が 知ら れ て い る 。 マ ウ ス に お け る 発 癌 系 に お い てp53変 異 の 検 出 を よ り 容 易 に 行 う 目 的 で 、 マ ウ ス p53 yeast functional assay法 の 樹 立 を 試 み た 。 ま ず 、 ヒ トp53発 現 ベ ク タ ー 上 の p53cDNAを マ ウ ス の そ れ と 置 換 し た べ ク タ ー を 作 成 し 、 マ ウ ス 正 常 肝 を 用 い て ヒ 卜 と 同 様 の 方 法 でp53 yeast functional assay法 を 行 っ た と こ ろ 、25.8％の バ ッ クグ ラ ウ ンド 赤 コ 口 二 ー が 出 現 し た 。 逆 転 写 酵 素 の 変 更 、DNaseI処 理 の 付 加 に よ ル パ ッ ク グ ラ ウ ン ド 赤 コ 口 二 ー は13.6％ ま で 減 少 し た が 依 然 高 値 で あ っ た 。 塩 基配 列 決 定 によ り 高 いバ ッ ク グラ ウ ン ド の 原 因 がp53遺 伝 子 上 の ア デ ニ ン ま た は チ ミ ン の り ピ ー ト 部 位 で の エ ラ ー で あ る こ と を 解 明 し 、 同 部 位 を ア ッ セ イ か ら 除 外 し て 、 バ ッ ク グ ラ ウ ン ド を8.0％ ま で 低 下 さ せ る こ と が で き た 。 こ の よ う に し て 確 立 し た ア ッ セ イ を 用 い 、 種 々 の マ ウ ス 培 養 細 胞 株 のp53 変 異 を 検 出 し た 。 ま た 、XPC遺 伝 子 変 異 マ ウ ス の 紫 外 線 誘 起 皮 膚 癌 のp53変 異 を 検 出 し 、 ま た 紫 外 線 照 射 非 腫 瘍 部 皮 膚 組 織 に お け る 多 様 なp53変 異 を も 検 出 す る こ と が で き た 。 公 開 発 表 に あ た っ て 、 副 査 の 第2病 理 長 嶋 教 授 よ り 、 検 出 範 囲 の 縮 小 に よ る 検 出 感 度 の 低 下 が ど の 程 度 み ら れ る か に つ い て 質 問 が あ っ た 。 申 請 者 は 、検 出 感 度 の低 下 は ある 程 度 避 け ら れ な い が 、p53の 変 異 集 積 部 位 で あ るDNA結 合 ド ヌ イ ン は 検 出 範 囲 に す べ て 含 ま れ る た め 、 感 度 の 低 下 は 大 き く な い も の と 考 え て い る と 答 え た 。 次 に 、 本 ア ッ セ イ で は p53のDNA結 合 能 が 保 た れ て い る も の を 正 常 と 判 定 し て い る が 、 そ れ 以 外 の 機 能 を 欠 損 し た よ う なp53変 異 は 本 ア ッ セ イ に よ っ て は 検 出 で き ぬ い の で は な い か と い う 質 問 が あ っ た 。 申 請 者 は 、 そ の 可 能 性 は 否 定 で き な い が 、 実 際 に ど の よ うな 変 異 が 偽陰 性 に なる か は 検 証 が き わ め て 困 難 で あ り 、 ま たp53の 機 能 と し て は 四 量 体 を 形 成 し てDNAに 結 合 し 下 流 の 遺 伝 子 を 活 性 化 す る 機 能 が 最 も 重 要 で あ り 、 そ の 中 心 と な るDNA結 合 能 を 評 価 す る こ と が 最 も 重 要 と 考 え こ の ア ッ セ イ を 確 立 し た と 答 え た 。 続 いて 、p53 yeast functional assay法 の マ ウ ス ヘ の 応 用 は 本 論 文 以 外 に 存 在 す る か に つ い て の 質 問 が あ っ た 。 申 請 者 は 、 他 施 設 で も 試 み は 行 わ れ た が 、 応 用 に 成 功 し た の は 本 論 文が 初 で あ ると 答 え た。 次 に 副 査 の 癌 研 細 胞 制 御 守 内 教 授 か ら 、 ギ ャ ッ プ 領 域 の 縮 小 に よ って 検 出 範 囲を 縮 小 した が 、
博 也
郎
正 哲
和
香 内
嶋
浅 守
長
授 授
授
教 教
教
査 査
査
主 副
副
実際の検出範囲はどの程度縮小されたか、それによる感度の低下は何％と見込まれるかと いう質問があった。申請者は、ギャップ修復領域には含まれないがPCRで増幅される領 域については実際に検出が可能であるが、その領域での検出感度の低下を数量的に見積も ることは困難であると答えた。続いて、アデニンまたはチミンのりピート部位でのエラー は、どのようにして生じたか、この現象は逆転写酵素のェラーによって生じたアーチファ ク卜ではないかという質問があった。申請者は、無細胞系によって合成したp53 mRNA を鋳型としてアッセイを行うとこのようなエラーの発生はほとんど発生しないことから逆 転写のエラーではなく、mRNAへの転写時に起きた現象(transcriptional sLippage)と考え られ、近年同様の現象がヒトApoB遺伝子や第vni因子遺伝子において生じることが報告さ れていると答えた。続いて、マウス培養細胞のアッセイでp53変異を持つ細胞が少ない理 由について質問があった。申請者はマウスの培養細胞でp53変異を持つことが知られてい るのは、今回用いたMethA株や、Friend leukemia関連の自血病細胞株であり、報告が 多くなく、入手した範囲ではこのような結果となったと答えた。最後に、主査の第3内科 浅香教授から、マウスにおいてp53変異を検出するアッセイを開発した理由についての質 問があった。申請者は、マウスでは化学発癌、ウイルス発癌、ノックアウ卜マウスやトラ ンスジェニックマウスの発癌など、多種多様な発癌実験が可能であり、ヒト癌のモデルと しての役割は今後も大きいと思われるため、そのような系においてp53変異を検出するこ とはヒトの癌研究にも大きく資すると考えて本アッセイを開発したと答えた。さらに、今 後どのような系に本アッセイを応用していくかという質問があった。申請者は、肝発癌の モデル動物として、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルスのゲノムを導入したトランスジ エニックマウスが最近樹立されており、それらのマウスにおいてp53変異の評価を行うこ と に よ ル ヒ ト 肝 発 癌 機 構 の 解 明 に っ な が る と 思 わ れ る と 答 え た 。 本研究は、今後p53の発癌における役割および多段階発癌機構の解明に役立つことが 期待されるため、審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や 取得単位なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと 判定した。
