脂 質 過 酸 化 反 応 に対 す る セ フ ァ ラ ンチ ンの 影 響 に つ い て
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(2) 236. 上. て は,充. 者. 分 な 解 明 が な され て い る と は い えな. い.. 郁. 夫. Nitroso‑PSAP. (2‑nitroso‑5‑N‑propyl‑N‑sulfo‑. propylaminophenol. 現 在 ま で に な さ れ て い る,セ 使 っ た 研 究 に つ い て,特 例 を み る と, Lead る 赤 血 球 のK+遊 23) , Bilirubinに. pase. に 生体 膜関 係 で の報 告. acetateやLysolecithinに. よ る 赤 血 球 のK+遊 et al.)24),膜. et al.)25), Snake. A2,. よ. 離 に 対 す る 阻害(Utsumi. 阻 害(Yoshioka (Utsumi. フ ァ ランチ ン を. et al.). 離 に対す る. 流動性 への影響. venome,. LysolecithinやLead. ミ トコ ン ドリア の 障 害 の 抑 制(Miyahara 26) ,赤 血 球 の 形 態 変 化 へ の 影 響(Fujii, Sato. よる. et a1.) et al.,. et al., Watanabe)29)〜32)と. た よ う に,こ. ら,セ. いっ. の 薬 物 が 膜 に 何 ら か の 作 用 を持 つ. こ とは 確 か で あ る と思 わ れ る.こ. れ らの こ と か. フ ァ ラ ンチ ンに よ る脂 質過 酸 化 反 応 の 阻. 害 は,セ. 学 研 究 所)を. 購 入,あ. る い は 供 与 さ れ た もの を. の 他,実. 験 に は全 て 特 級 の試 薬 を. 使 用 し た. 動 物:市. 販 の オ リ エ ン タ ル 固 型 飼 料(MF)を. 用 い て 飼 育 し たWistar系. フ ァ ラ ン チ ン に よ る 膜 の 修 飾 に よ り,. 素 ガ ス を 流 し て,除. 去 し,. リ ン 酸 緩 衝 液(pH. 作 製 し た.な. お,セ. 15分)後,. 10,000rpm,. そ の 上 清 を,リ. 2分. 肝 ミ ト コ ン ド リ ア の 分 離:ラ. O2‑(Superoxide. Nitroblue. (Dianisidine)法. フ ァ ラ ン チ ン に よ っ て 著 し く抑 制 さ れ る こ と が. (p‑Nitrosodimetylaniline)法. 報 告 さ れ て い る こ とか ら,こ. 水 素(H2O2,. の 阻害 の 機 構 を明. ら か に す る 目 的 で, ① セ フ ァ ラ ン チ ン の 抗 酸 化 で に報 告 され て い ト コフ ェ ロ ー ル. 反 応 の 阻 害 と い う点 を 明 確 に す る た め に,脂. 560nmの. に よ り36),過 酸 化. 成 系 に キ サ ン チ ン. サ ン チ ン 酸 化 酵 素(Xanthine を 用 い てNBTの. 還 元 の 阻 害率 を. 吸 光 度 変 化 量 よ り 算 出 し,. 活 性 を25℃. 下 で 求 め た.反. い,セ. Nitroblue. tetrazolium,. られ た. μg/ml. Xanthine. 緩 衝 液(pH. 材 料. Xanthineoxidase,. tase, Nitroblue. tetrazolium,. Superoxide Xanthine,. sodimetylaniline,. Dianisidine,. Catalase. chemical. (Sigma. phosphatidylcholine K. K.),. 8.4)を. 応 液 は, 0.1mM. oxidase,. O2‑の. 除去. 80×10‑6M. Xanthine,. 10mM. 25. Tris/HCl. 用 い た.. と 方 法 (2)デ. 試 薬:. 測 定は. よ り 行 っ た.. が 膜 構 造 を 取 ら な い 系 で の 脂 質 過 酸 化 反 応 を行. 結 果 に つ い て 報 告 す る.. (Hydroxyl. peroxide)の. O2‑生. (Xanthine)‑キ oxidase)系. ・OH. トロ ソ ジ メ チ ル ア ニ リ ン. Hydrogen. NBT法;. と の 比 較 検 討 し, ② 膜 安 定 化 作 用 に よ る 過 酸 化 質. 測 定 はp‑ニ. Ferrithiocyanate法37)に (1). ィア ニ シ ジン. に よ り35),. radical)の. フ ァ ラ ン チ ン の 影 響 を検 討 し,得. anion)の. tetrazolium)法34),デ. と考 え られ て い る ア ル カ ロ イ ドの 一 種 で あ る セ. る い くつ か の 系 を使 っ てSODや. ッ ト肝 ミ ト コ ン. et al.33)の 方 法 に 準. 測 定 は ニ ト ロ ブ ル ー テ ト ラ ゾ リ ウ ム(NBT,. 安 定 化 作 用 を もつ. 剤 と し て の 働 き の 有 無 を,す. 音 波 処 理(4℃, 間 の 遠 心 を 行 い,. ポ ソ ー ム と し て 実 験 に 使 用 し た.. 活 性 酸 素 の 測 定:. ク ロ ゾ ー ム 等 生 体 膜 に お け る 脂 質 過 酸 化 反 応 が, in vitroの 実 験 に お い て,膜. Egg‑. フ ァ ラ ン チ ン を 含 有 した リ. ポ ソ ー ム を 作 製 す る 場 合 は,超. じ て 行 っ た.. ト コ ン ド リア,ミ. KCI‑10mM. 加 え て(2mg. ル テ ッ ク ス ミ キ サ ー で か く は ん し て,. い か と推 定 さ れ て い る が10),15),こ れ を 支 持 す る. ポ ソー ム,ミ. 温 に て 溶 媒 を窒. 0.15M. 7.2)を. ド リ ア の 分 離 はHogeboom. 実 験 結 果 は 今 の と こ ろ 得 ら れ て い な い.. 令). 機 溶 媒 に 溶 か した卵 黄. レ シ チ ン を フ ラ ス コ に 入 れ,室. 脂 質 と活性 酸 素 との 反応 が 抑制 され るの で は な. 本 研 究 は,リ. 雄 ラ ッ ト(5‑8週. を実 験 に使 用 した。. PC/ml),ボ. et al.)27),28),血 小 板 凝 集 へ の影 響(Watanabe. et al., Kanaho. 仁化. 使 用 し た.こ. リ ポ ソ ー ム の 作 製:有. Phospholi. acetateに. hydrochloride),(同. p‑nitro. Riboflavin, Co.),. (egg‑PC),(半. Cepharanthine(化. dismu. Egg. L‑α‑. 井化学薬品. 研 生 薬K. K.),. ィ ア ニ シ ジ ン 法;. ラ ビ ン(Riboflavin)‑光. O2‑生. 成 系 に リボフ. 照 射 系 を用 い て デ ィ. ア ニ シ ジ ン の 吸 光 度 変 化 量(410nm)か の 除 去 活 性 を 求 め た.光 よ り,室. 温 下 で 反 応 を 行 っ た.反. 10‑4M. Dianisidine,. 10mM. Tris/HCl緩. 1,. ら, O2‑. 照 射 に は 蛍 光 燈20Wに 応 液 は,. 3×10‑5M. 衝 液(pH. 2×. Riboflavin, 7.4)を. 用 い た..
(3) 脂 質過 酸 化 反 応 に対 す るセ フ ァ ラ ンチ ンの 影響 につ いて (3). p‑ニ トロ ソ ジ メ チ ル ア ニ リン 法;. 237. あ る い は ク ロ ロ ホ ル ム/メ. ・OH. タ ノ ー ル/水(Chl/. 生 成 系 に キ サ ン チ ン ー キサ ン チ ン酸 化 酵 素 系 を. MeOH/H2O,. 用 い てp‑ニ. ス ター ラ ー で 攪 拌 し な が ら行 っ た.. トロ ジ メ チ ル ア ニ リ ン の440nmの. 光 度 の 変 化 か ら, ・OHの 求 め た.反. 応 液 は, 53.5×10‑6M. methylaniline, /ml. 0.1×10‑3M. Xanthine. 衝 液(pH (4). p‑nitrosodi. 10mM. 25μg,. Tris/HCl緩. 存 す るH2O2量. 10分 間 の 反. をFerrithiocyanate法. に よ り 測 定 し た.反. 応 液 は, 13.7×10‑6M. 10mM. 衝 液(pH. Tris/HCl緩. 7.4)を. 脂 質 過 酸 化 反 応 の 誘 導 と測 定:脂 応 は, 25℃ で 二 価 鉄 で,あ. 用 い た. 質 過 酸化 反. るい は放 射 線 照射 に. よ っ て 誘 導 し た. (1)二. 反 応 を 行 っ た.ク. HCl. 分 間 処 理,冷. 価 鉄 に よ る脂 質過 酸 化 反 応 の. 衝 液(pH. 7.4). ル 中 で 二 価 鉄(FeSO4(NH4)2SO46H2O)の. 添. 加 に よ り行 っ た. 二 価 鉄 誘 導 に よ る ミ ト コ ン ドリ ア の 脂 質 過 酸. TCA. 0.5mlを. リ ク ロ ロ 酢 酸(TCA)0.5m 2%. TBA. 分 間 処 理 後,冷. 0.5ml加. 却 し,遠. て, 532nmと600nmの. お,標. 反 応液 に. 1.5N え,沸. HCl. 騰 水 中 で15. 心 を 行 い,上. V/V,. 準 物 質 に は1, 1, 3, 3,‑テ トラエ ト. フ ァ ラ ン チ ン,ト rad/min,. 定 は,反 応 液2mlに,. 40%. 2%. TBA. 過 酸 化 反 応の 測. TCA. 0.5ml,. 0.5mlを. 1.5N. 加 え た 後, α‑. ト コ フ ェ ロ ー ル を含 む メ タ ノー ル3.0mlを て, 80℃ で, 30分 間 前 加 熱 後,沸 却 後,メ. 0.15M. 照 射 装 置(Cu. 69rad/min)を. KCl‑10mMリ. 測 定 を行 っ た.. 射 線 照射 に よ る脂 質過 酸 化 反. 応 の 誘 導 は,東 芝 深 部X線 0.5mm,. 加 え. 騰 水 中 で15分. タ ノ ー ル を 全 量 が10mlに. な る よ うに 加 え て, 532nmの. +Al. 液(1mM. Nitroso. 加 え て, 752nm. 3h,. 0.5mm. 用 い て, 25℃ 下,. ン 酸 緩 衝 液(pH. 7.4)中,. .8)に,あ. コ フ ェ ロ ー ル をX線 25℃)し,直. る. 接 に,あ. 照 射(69 る い は反. ペ ク トル の 測 定 を行 っ た.. 結 (1)放. ロ. タ ノー ル に 溶 か した セ. 応 液 で 希 釈 してUVス. 果. 射 線 照 射 に よ って誘 導 され る リポ ソー. ム の 脂 質 過 酸 化 反 応 とセ フ ァ ラ ン チ ン に よ る 阻. PCリ. 射 線:放. っ. ン 酸 緩 衝 液, pH 7/NaOH/H2O,. HCl‑95%エ. 清 につ い. 換 算 して 表 わ. 二 価 鉄 誘 導 に よ る, egg‑PCの. (2)放. 用 い て,行 取 り,こ れ に40%. ロ ホ ル ム/メ タ ノ ー ル/H2O(1/2/0. の 加 水 分 解 物 を 用 い た39).. 間 処 理,冷. 測 定 を 行 っ た,. の 吸 光 度 の 測 定 を行 っ た40),41).. 害: Table. 0.25ml,. 騰 水 中 で15. 加 え て 反 応 を 停 止 し,遠 心 後 上 清. .2Mリ. キ シ プ ロ パ ン(1, 1, 3, 3,‑tetra‑ethoxypropane). HCl. 加. 価 鉄 の 定 量 は ニ トロ ソ フ ェ. 0.5/2.5/0.6/0.4)4mlを. 吸光 度 の 測定 を行 いマ ロ. ン ア ル デ ヒ ド含 量(MDA値)に し た.な. 0.5ml, 加 え た 後,. タ ノー ル を 全 量 が10mlに. 対 してNitroso‑PSAP溶. い は20mM. オ バ ル ビ ツ ー ル 酸(TBA). 反 応 に よ り行 っ た38).反 応 終 了 後,各. 0.25ml,. TCA. ラ ジ カ ル に よ る ト コ フ ェ ロ ー ル の 酸 化:ク. 化 反 応 の 測 定 は,チ. 40%ト. 40%. 0.5mlを. 加 熱 後,沸. 時 的 に 反 応 液2mlを. 0.15M. Tris/HCl緩. TBA. ノー ル 試 薬(Nitroso‑PSAP)を. ‑PSAP/0. 使 用 し た 実 験 系 で は,メ タ ノー. 却 後,メ. 二 価 鉄 の 定 量:二. 1mlに. KCl‑10mM. 2%. な る よ う に 加 え て, 532nmの. 誘 導 は ミ ト コ ン ド リア を使 用 し た 実 験 系 で は,. 中 で, egg‑PCを. 応 液2mlに,. 0.25ml,. α‑トコ フ ェ ロ ー ル を含 む メ タ ノ ー ル3.0mlを. た.経. 価 鉄:二. ロ ロ ホ ル ム/メ タ ノ ー ル/水 の. え て, 80℃ で30分 間,前. H2O2,. クロバ ッ ト. て は 上 述 の ミ トコ ン ド リ ア と同 じ 方 法 でTBA. 5N 25℃,. 系 で,ア. 脂質 過 酸化 反 応 の 測定 は リポ ソー ム系 につ い. 系 の 場 合 は,反. 用 い た.. Ferrithiocyanate法;. 応 後,残. 下 で. Xanthine,. oxidase,. 7.8)を. 吸. 除 去 活 性 を25℃. 1/2/0.8)の. 1はX線. 照 射 に よ っ て 誘 導 し たEgg‑. ポ ソー ム の 脂 質 過 酸 化 反 応 に 対 す る セ フ ァ. ラ ン チ ン(Cepharanthine)の. 阻 害 作 用 をMDA. の 生 成 量 か ら測 定 し た も の で あ る が,セ ン チ ン は, 50μMで34%の, 害 率 を示 し た.一. 方,抗. フ ァラ. 100μMで59%の. 阻. 酸 化 剤 と して知 られ て. い る ト コ フ ェ ロ ー ル(α‑Tocopherol)で. は,. 50. μMで83%と. よ り)高い 阻 害 率 を 示 し た.こ. 応 は, SODに. よ る 阻 害 も認 め ら れ る こ とか ら,. の反. こ の 過 酸 化 反 応 にO2‑が. 何 らか の 関与 を して い. る こ と が 推 定 さ れ た.す. でに 報告 され て い る放. 射 線 照射 に よ る過酸 化 反 応 の セ フ ァラ ン チ ン に よ る 阻 害 に つ い て は,ダ. イ ズ レ シチ ン リポ ソー.
(4) 238 Table. 上 1. Effect of cepharanthine induced lipid peroxidation. 者. 郁. 夫. on radiation in egg-PC. liposomes.. Liposomes were irradiated at a total dose of 124.2 Gy. Each value represents the average of two experiments. Fig.. ム を使 っ た60Co照. 1.. Effect tion. 射 に よ る もの が あ る が13),こ. of in. cepharanthine. on. mitochondria. lipid. and. peroxida. consumption. of. Fe2+.. の 場 合 の 阻 害 率 は, お り,こ. 50, 200μMで40%と. なって. Mitochondria. の 阻 害 率 の 違 い は 実 験 系 に よ る もの で. buffer. は な い か と推 定 した.. ƒÊ M. (2)二. 価 鉄 に よ って 誘導 され る脂 質過 酸 化 反. 応 とセ フ ァ ラ ン チ ン に よ る 阻 害: っ て 生 成 す る 活 性 酸 素 にO2‑,. ・OH,. incubated. 0.15M (pH. 7.4). Fe2+.. hyde. X線 照 射 に よ. at. 25•Ž. in. and. the. in. the. Cepharanthine ƒÊ. were. text. 5ƒÊM;. presence of. Fe2+. (•¢),. medium Tris/HCl. Concentration. formed. described. in. KCl-10mM. spectorphotometrically.. 1O2等 が. 考 え ら れ る が42),二 価 鉄 に よ っ て 誘 導 さ れ る 過. were. containing. of 50. malondialde determined. The. methods. are. (•›),. Control;. (•œ),. 10ƒÊM;. (•£),. 50. M.. 酸 化 反 応 に は こ の よ う な 活 性 酸 素 ば か り で な ぐ, 鉄 イ オ ン と 酸 素 の 複 合 体 で あ るPerferryl 〔FeO2〕2+やFerryl 定 さ れ て お り,放. ion〔FeO〕2+な. ion. どの 関 与 も推. 射 線 照射 の場 合 と異 な る活 性. 阻 害 さ れ て い た(Fig.. 1).こ. の 阻害 は二価 鉄 と. セ フ ァ ラ ン チ ン が 直 接 に,何. ら か の 反 応 を した. も の で な く,セ. フ ァ ラ ン チ ン が 膜 系 に 作 用 し,. 酸 素 種 に よっ て過 酸 化 反応 が 誘 導 され て い る可. そ の た め に 二 価 鉄 と 膜 系 との 反 応 が 抑 制 さ れ た. 能 性 が あ る43)〜47).セフ ァ ラ ン チ ン は こ の よ う な. も の で あ る こ とが,膜. 系 に お い て も過 酸 化 反 応 を 阻 害 す る こ と が 知 ら. 二 価 鉄 の 減 少 が セ フ ァ ラ ン チ ン に よ り阻 害 され. れ て お りす で に 報 告 さ れ て い る10),13).. な い こ とか ら 推 定 さ れ た(Fig.. 本実 験 に おけ る ミ トコ ン ドリア を使 っ た二 価 鉄 誘 導 に よ る 脂 質 過 酸 化 に お い て も, 5μM %,. 10μM. 53%,. 50μM. 98%と. 26. いったセ フ ァ. (3)ク. 系 が存 在 し ない状 態 での. 2).. ロ ロ ホ ル ム/メ タ ノ ー ル/H2O系. とメタ. ノ ー ル 系 で の 脂 質 過 酸 化 反 応 と セ フ ァ ラ ンチ ン の 影 響 に つ い て:以. 上 の よ うに セ フ ァ ラ ンチン. ラ ンチ ンに よる定 量 的 な 濃度 依 存 性 の 阻 害 が認. が リ ポ ソ ー ム や ミ トコ ン ド リア と い っ た 膜 系 で. め られ た(Fig.. の 脂 質過 酸化 反応 を 阻害 す る こ とは 明 らか であ. 1).こ. の 二 価 鉄 誘 導 に よ る脂 質. 過 酸 化 反 応 に お い て は 二 価 鉄 の 減 少 が,過 の 誘 導 に 重 要 で あ る こ と が,す. 酸化. る が,脂. 質 が リポ ソー ム の よ う な 膜 構 造 を取 ら. でに 報告 され て. な い状 態 で の 脂質 過 酸 化 反 応 に 対 して セ フ ァラ. い る が40),41)この 二 価 鉄 の 減 少 に 対 して セ フ ァ ラ. ン チ ン が ど の よ う な 影 響 を 持 つ か は 興 味 あ る問. ン チ ン が ど の よ う な 作 用 を持 つ か 検 討 し て み た .. 題 で あ り そ の 検 討 を行 っ た.. そ の 結 果,予. 期 され た よ うに セ フ ァ ラ ンチ ンの. 存 在 下 で は,こ. の 減 少 の 速 度 が,濃. 度依存的に. Fig. る,メ. 3は 脂 質 を 抽 出 に 一 般 的 に 用 い ら れ て い タ ノ ー ル/ク ロ ロ ホ ル ム/H2O(v/v,. 2/1/.
(5) 脂 質過 酸 化 反 応 に 対す るセ フ ァ ラン チ ンの影 響 に つ い て Table. 2. Effect on - PC. of cepharanthine. radiation-induced dissolved. 照 射 に よ る過 酸 化. 反 応 を示 し た も の で あ る.照. /mg Fig.. 2.. Effect. of. cepharanthine. on. consumption. of. of egg. at a total dose of 82.8Gy. the average of two experi. で のEgg‑PCのX線. MDA値. and ƒ¿-tocopherol peroxidation. in MeOH/CHCl3/H2O. Lipids were irradiated Each value represents ments. 0.8)系. 239. 射 時 間 と と もに. の 増 加 が 認 め ら れ, 4時 間 照 射 で8nmol Egg‑PCのMDA値. を 示 し た.. この系 の 中 に セ フ ァ ラ ンチ ンを添加 した もの. Fe2+. Fe2+. (50uM). added HCl. in. and. cepharanthine. medium. buffer(pH. 7.4). mitochondria.. at. 25•Ž. in. the. absence. of. of. Fe2+. was. (•œ),. ポ ソ ー ム の 系 や ミ ト コ ン ド リア の 系 で. 示 さ れ た よ う な 強 い 阻 害 は 認 め られ な か っ た.. Tris/. spectrophotometrically. (Fe2+);. で は,リ. were. KCl-10mM. Concentration. determined Control. (5uM). 0.15M. 一方. ,ト. コ フ ェ ロ ー ル を 添 加 し た もの で は,こ. の よ う なMDAの. 生 成 に対 して そ の濃 度依 存性. (•›),. Cepharanthine. (Fe2++. の 強 い 阻 害 が 認 め られ た(Table. 2,. Fig.. 4).. この よ うな膜 系 以外 での セ フ ァラ ンチ ンの作 用. Cepharanthine).. に つ い て さ ら に 検 討 す る た め,メ. タ ノー ル 中 で. のFe2+誘. 導 に よ る過 酸 化 反 応 に 対 す る 影 響 を検. 討 し た.. Table. 3はegg‑PCのFe2+誘. 過 酸 化 反 応 を示 し た も の で あ る. 存 在 下,. 0.181nmol/mg. 成 が 認 め ら れ た.こ ン,ト 3,. 導 に よる 1mM. Fe2+の. Egg‑PCのMDAの の 系 の 中 に,セ. 生. フ ァ ラ ンチ. コ フ ェ ロー ル を 添 加 し た も の で はTable. Fig.. 5に 示 す 結 果 と な り,ト コ フ ェ ロ ー ル. が 強 い 阻 害 を示 す の に 対 し て セ フ ァ ラ ン チ ン は 阻 害 を 示 さ な か っ た. 以 上 メ タ ノー ル/ク ロ ロ ホ ル ム/H2O系 ノー ル 系 で の 過 酸 化 反 応 がMDA形 り,セ. とメ タ. 成 でみ る限. フ ァ ラ ンチ ンが 弱 い阻 害 しか示 さず 抗 酸. 化 剤 と して の 働 きが あ る ト コ フ ェ ロ ー ル が 強 い Fig.. 3. Radiation-induced dissolved. peroxidation. Egg-PC. (2mg/ml). CHCl3/H2O at a dose. (V/V, rate. ondialdehyde. diation.. egg-PC. in the. 2/1/0.8). formed text.. in was. MeOH/. at 25•Ž.. was. determined methods Control;. る い は弱 い. 活 性 で あ る こ と, ② セ フ ァ ラ ン チ ン が 過 酸 化 反. irradiated. The (•›),. 阻 害 を示 した こ と は, ① セ フ ァ ラ ン チ ン は 抗 酸 化 剤 と して の 活 性 を も た な い か,あ. dissolved. of 0.69Gy/min. trophotometrically. scribed. of. in MeOH/CHCl3/H2O.. Mal spec. are. de. (•œ), Irra. 応 を 強 く 阻 害 で き る の は,リ ン ド リア の よ う に,脂. ポ ソー ムや ミ トコ. 質 が 一 定 の 構 造 を取 る時. に 見 られ る こ と の 二 点 を 示 唆 す る も の と 思 わ れ た.し. か し,こ. の結 果 の み に よ って セ フ ァ ラ ン.
(6) 240. 上. 者. 郁. Fig.. 夫. 5.. Concentration. effect. ƒ¿-tocopherol of. egg-PC. Percent Fig.. 4.. Concentration. effect. ƒ¿-tocopherol. on. of. cepharanthine. of. egg-PC. dissolved. MDA. peroxida. in. of. dissolved of. cepharanthin. Fe2+-induced in. inhibition. and. peroxidation. MeOH. was. estimated. using. and. radiation-induced. tion. tion. on. formed The. in egg-PC. methods. after. are. 20min. described. incuba in the. text.. MeOH/CHCl3 (•›),. Cepharantine;. (•œ), ƒ¿-Tocopherol.. /H2O. Percent. of. MDA diation.. 3.. (•›),. Effect on. in. The. text.. Table. inhibition. formed. methods. of. estimated after. are. Cepharanthine;. represents. in. using. 120min. irra. described. in. the. (•œ), ƒ¿-Tocopherol.. cepharanthine. Fee+-induced. dissolved. Each value. was. egg-PC. and ƒ¿-tocopherol. peroxidation. of. egg-PC. MeOH.. the average. of two experiments.. Fig.. チ ン の 抗 酸 化 剤 と し て の 働 き を 否 定 す る こ とは で き な い と思 い,更. に い くつ か の 系 で 検 討 を 試. み た. (4)活. 6.. Percent of. oxide. dismutase. (•›),. methods. (•¢),. nitorblue. tetrazolium. concentrations and. of. cepharanthine. oxidase are. Superoxide. ranthine;. て: Fig. 6はNBT‑キ. of. different. xanthine-xannthine The. 性 酸素 とセ フ ァ ラ ンチ ンの 反応 に つ い. inhibition. assay. described dismutase;. super using. system. in. the. (•œ),. text. Cepha. Liposome-cepharanthine.. サ ンチ ンー キサ ンチ ン オ. キ シ ダ ー ゼ 系 を 使 用 して セ フ ァ ラ ン チ ン やSOD. う な 現 象 は,セ. のO2‑の. 除 去 活 性 を み た も の で あ る が, SODに. 反 応 系 に 加 え た 場 合 で も 同 じ で あ っ た.. はO2‑の. 除 去 活 性 が 認 め られ た が,反. 応系にエ. フ ァ ラ ン チ ン 含 有 リポ ソー ム を. こ れ と 同 じ結 果 は,図 に は 示 さ な い が, O2‑生. タノー ル 溶 液 と して加 え られ た セ フ ァ ラ ンチ ン. 成 系 と し て,非. に は 全 く除 去 活 性 が 認 め ら れ な か っ た .こ. ジ ン 系 を 使 用 し た 実 験 に お い て も 認 め ら れ た.. の よ. 酵 素 反 応 系 を用 い た デ ィ ア ニ シ.
(7) 脂 質過 酸 化 反 応 に対 す るセ フ ァ ラ ンチ ン の影 響 につ い て. Fig.. 7.. Percent assay and. inhibition. concentrations using. of. methanol. xanthine-xanthine. system.. The. methods. (•›),. Ethanol;. Fig. 7は ・OH除 る が,す. of p-nitrosodimetylaniline. of different cepharanthine. oxidase. 241. are. described. (•œ),. in. the. text.. Cepharanthine.. 去 活 性 につ いてみ た もの で あ. で に 報 告 さ れ て い る よ うに エ タ ノー ル. に は そ の 除 去 活 性 が 認 め ら れ た が36),セ. ファラ. ンチ ン には その 除去 活 性 は 認め られ なか っ た. こ の 他 に, H2O2除 が,カ. 去 活 性 に つ い て も検 討 し た. タ ラー ゼ に認 め られ る よ うな 除去 活性 が. セ フ ァ ラ ン チ ン に は 認 め ら れ な か っ た.以 よ う に セ フ ァ ラ ン チ ン に はO2‑,. ・OH,. 上の H2O2. と い っ た 活 性 酸 素 の 除 去 活 性 は 認 め られ な か っ た. 以 上 の結 果 は活 性 酸素 測 定 系 を利 用 してセ フ ァ ラ ン チ ン と活 性 酸 素 との 反 応 を解 析 し よ う と し た も の で あ る が,活. 性 酸 素 とセ フ ァ ラ ンチ ン. が 反 応 し て い る か ど う か,更 のUVス. に セ フ ァ ラ ンチ ン. ペ ク トル の 変 化 か ら,検. Fig. 8は. 討 して み た.. リポ ソー ム にエ タ ノー ル に溶 か した. セ フ ァ ラ ン チ ン あ る い は ト コ フ ェ ロ ー ル を添 加 し, X線 照 射3時. 間 を行 った 反 応終 了後 の メタ. ノー ル/ク ロ ロ ホ ル ム/反 応 液(v/v,. 2/1/0.8) Fig.. 中 で の セ フ ァ ラ ンチ ン と トコ フ ェ ロー ル のUVス ペ ク トル を 示 し て い る ,こ の 系 で は セ フ ァ ラ ン チ ン,ト. コフ ェ ロー ル共 に脂 質過 酸 化 反 応 を阻 害. す る の で あ る が,. UVス. ペ ク トル に 著 名 な 変 化. 8.. Sequential. の 原 因に つ い て は充 分. な 検 討 を行 っ て い な い が,こ. の 反 応 系 での ラ ジ. in. of. cepharanthine. liposome. exposed. and ƒ¿ to. X-irradia. tion. Ethanol. solution. -tocopherol The. は 認 め ら れ な か っ た.こ. spectra. -tocopherol. samples. of. 124.2Gy.. the. text.. - Tocopherol. of. were were The A,. cepharanthine. added. or ƒ¿. the. irradiated methods. Cepharanthine (20ƒÊM).. to. liposomes. at. are. a total. dose. described. (20ƒÊM);. in B, ƒ¿.
(8) 242. 上. 者. 郁. 夫. Fig.. 10.. Sequential ƒ¿-tocopherol posed. to. spectra of cepharanthine in acidified 95% ethanol X-irradiation.. Cepharanthine. Fig. 9. Sequential - tocopherol exposed. spectra. of cepharanthine. dissolved in MeOH/CHCl3/H2O to X-irradiation. Cepharanthine. (100ƒÊM)and ƒ¿-tocopherol solved in MeOH/CHCl3/H2O 0.8) and. irradiated. Gy. The methods A, Cepharanthine (25ƒÊM). and ƒ¿. (100ƒÊM)were (V/V,. at a total. dose. of. dis 2/1. 124.2. are described in the text. (100ƒÊM); B, ƒ¿-Tocopherol. (100ƒÊM). (100ƒÊM). were. acidified. with. at a total The. and ex. dose. methods. A, Cepharanthine rol (100ƒÊM).. and ƒ¿-tocopherol. dissolved 20mM of are. in 95% HCl. and. ethanol irradiated. 124.2Gy. described. in the. (100ƒÊM);. B, ƒ¿-Tocophe. text..
(9) 脂 質過 酸 化 反 応 に対 す るセ フ ァ ラ ンチ ン の影 響 につ いて カ ル に よ る 反 応 自体 が 低 い こ と と(MDA値 比 較 す る と, MeOH/CHCl3/H2Oの1/6程. で. 243. 増 加 も 認 め ら れ な か っ た.. 度で. 以 上 の よ う に,ト. コ フ ェ ロ ー ル が 酸 化 を受 け. あ る),さ ら に,ト コ フ ェ ロー ル が リポ ソ ー ム の 系. る よ う な 条 件 で,セ. フ ァ ラ ン チ ン の ス ペ ク トル. で は 酸 化 さ れ に くい こ と に よ る と思 わ れ る.リ. の 変 化 は ク ロ ロ ホ ル ム/メ タ ノ ー ル/H2Oの. ポ ソー ム の 系 で ト コ フ ェ ロ ー ル が 酸 化 さ れ に く. 以 外 で は 認 め る事 は で き な か っ た.. い こ と は,す. で にFukuzawa. い る が48),そ. の 結 果 と一 致 す る も の か も しれ な. い.し. か し,ト. et al.が 報 告 して. コ フ ェ ロ ー ル がO2‑に. 化 さ れ る こ とは,非. 系. よ って酸. 水 溶 媒 系49),デ. オキシコ. 考. 察. ビ ス コ ク ラ ウ リ ン 型 ア ル カ ロ イ ドの 一 種 で あ る セ フ ァ ラ ン チ ン に よ る,脂. 質過 酸 化 反 応 の 阻. ー ル 酸 に よ る ミセ ル 系50)で 明 らか に さ れ て お り,. 害 が 報 告 さ れ て い る が10),13),15),22),その 阻 害 機. そ の 違 い に つ い て は 今 後 尚 解 析 が 必 要 と考 え ら. 構 は 依 然 不 明 の ま ま で あ る.最. れ る. 一方. 構 に つ い て, Nagatsuka. 近,こ. の 阻害 機. et al.15)が セ フ ァ ラ ン. 質過 酸 化 反 応 で セ フ ァ ラ ンチ ンが 弱. チ ン に よ る 脂 質 過 酸 化 反 応 の 阻 害 は,そ. の抗 酸. い 阻 害 率 を 示 し た 系 で あ る メ タ ノー ル/ク ロ ロ ホ. 化 剤 と し て の 働 き に よ る も の で な く,セ. ファラ. ル ム/H2Oで. ン チ ン が 脂 質 の 脂 肪 酸 部 分 に 入 り込 ん で,ラ. ,脂. は ト コ フ ェ ロ ー ル は,. et al.48)が酸 性 エ タ ノ ー ル,. Fukuzawa. γ‑線照 射 で 報 告 し た. と同 じ よ うな 酸 化 に よ る と思 わ れ る292nmの 光 度 め 減 少(O. 増 加(O.. D.=0.168),. D.=0.88)と. 270nmの. い うUVス. 吸. 吸光度の. ペ ク トル の 著. ジ. カル の不 飽 和 脂 肪酸 に対 す る攻撃 を防 護 す る と い う 考 え を,リ. ポ ソー ム 膜 の 流 動 性 や 透 過 性 に. 対 す る影 響 や ラ ジ カ ル トラ ッ ピ ン グ作 用 を持 た な い と い う結 果 か ら,述. べ て い る が,実. 験的根. 拠 に は 乏 し く推 定 の 域 を 出 て い な い 。 明 な 変 化 を 示 し た が,セ 300nm,. 280nm,. ‑0 .08)以. フ ァ ラ ン チ ン で は400‑. 260nmで. の 増 加(O.. D.=0.05. 外 は,吸 光 度 の 減 少 は 認 め ら れ な か っ. た. (Fig. 9A,. B),こ. の 変 化が 何 に よるか は 更. に 検 討 す る 必 要 が あ る が,も. し照 射 に よ っ て 発. 本 実 験 で は,セ え る上 で,そ. フ ァラ ンチ ンの 阻害 作 用 を考. の 脂 質 過 酸 化 反 応 の 阻 害 の 報 告 が,. リ ポ ソ ー ム,ミ. ト コ ン ド リア,ミ. クロ ゾー ム と. い っ た 膜 系 に 限 ら れ て い る こ と か ら,こ. 生 した活 性 酸素 に よ る酸 化 に よ る もの で あ る と. 興 味 を持 ち 検 討 し た.ま. し て も,セ. が 否 定 し た 抗 酸 化 剤 と し て の 働 き も,彼. フ ァ ラン チ ンの 抗酸 化 剤 と しての 働. き は, MDA値. で み る か ぎ り,こ. の系の中での. い た,. 1, 1‑diphenyl. を 使 う 方 法 以 外 に,他. な い こ と と, (Table. が あ る と考 え,い. と,抗. Fig. 4)考. え合 わ せ る. 酸 化 剤 及 び ラ ジ カル 捕捉 剤 として の活 性. が 明 らか で あ る トコ フ ェ ロ ー ル に,比. 較す る と. い,以 ①. た, Nagatsuka. et al.15) らが 用. 2‑picrylhydazyl(DPPH). 脂 質 過 酸 化 反 応 を セ フ ァ ラ ン チ ン が 強 く阻 害 し 2,. の よう. な系 以 外 で の脂 質過 酸 化 反 応 に対 しての 影 響 に. の系 で更 に検 討 す る必 要. くつ か の 系 を 用 い て 実 験 を 行. 下 の 点 を 明 ら か に す る こ と が で き た. セ フ ァ ラ ン チ ン は,リ. ポ ソ ー ム や ミ トコ. ン ド リア と い っ た 膜 系 で の 過 酸 化 反 応 で は 強 い. そ の 活 性 は 極 め て 弱 い も の と推 定 さ れ た. 次 に ト コ フ ェ ロ ー ル が 酸 化 を 受 け る こ とが,. 阻 害 を 示 す が,ク. ロ ロ ホ ル ム/メ タ ノー ル/H2O. す で に 報 告 さ れ て い る 酸 性 エ タ ノ ー ル 系48)を 用. や メ タ ノー ル とい った 溶媒 系 での 反 応 で は弱 い. い て,セ. 阻 害 を 示 し た. (Table. 2, 3).抗. トコ フ ェ ロ ー ル が,こ. の よ うな溶 媒 系 の脂 質過. フ ァ ラ ンチ ン の ス ペ ク トル の 変 化 を 検. 討 して み た. Fig. 10は 酸 性 エ タ ノ ー ル 中 で のX 線 照 射 後 の,. UVス. ペ ク トル を示 す が,ト. ェ ロ ー ル が 酸 化 に よ る292nmの 270nmの. コフ. 吸 光 度 の 減 少,. 吸 光 度 の 増 加 とい う著 明 な 吸 収 ス ペ ク. トル の 変 化 を示 す の に 比 較 し て,セ ン は 全 く変 化 を 示 さ ず,ク ー ル/H2Oの. フ ァラ ンチ. ロ ロ ホ ル ム/メ. 系 で 見 ら れ た ,わ. タノ. ずか の吸 光 度 の. 酸化剤である. 酸 化 反 応 を 強 く 阻 害 す る こ と(Table ら考 え て,こ. の 結 果 は,セ. 2, 3)か. フ ァ ラ ン チ ン が,抗. 酸 化 剤 と し て 働 い て い る 可 能 性 が 低 い こ と,ま た こ の よ う な 系 の 中 で は,リ. ポ ソー ム の 系 と比. 較 し て セ フ ァ ラ ン チ ン と脂 質 の 相 互 作 用 は,弱 い こ とが 考 え られ,そ の た め に 過 酸 化 反 応 を 阻 害.
(10) 244. 上. 者. 郁. 夫. し な い 事 を示 唆 す る も の で あ る と考 え ら れ た. ②. セ フ ァ ラ ン チ ン は,ト. 結. に よ っ て 示 し た よ う な 著 明 な ス ペ ク トル の 変 化. ①. を 示 さ な か っ た. (Fig.. れ る リ ボ ソ ー ム や,. 9,. こ れ ら の 結 果 か ら,本. 語. コフ ェ ロー ル が 酸化. Fig. 10).. 実 験 で は,セ. チ ン の 脂 質 過 酸 化 反 応 の 阻 害 は,そ. フ ァラ ン. の 抗酸 化 剤. セ フ ァ ラ ン チ ン はX線. ト コ ン ド リア の 脂 質 過 酸 化 反 応 を 濃 度 依 存 的 に. と し て の 作 用 に よ る もの で な く(?),膜 構 造 を取. ②. で のFe2+の. セ フ ァ ラ ン チ ン は,ミ. の 速 度 を 抑 制 し な か っ た.. の と考 え て い る.こ. ③X線. al.15)の考 え と相 反 す る もの で は な い.. ァ ラ ン チ ン の 脂 質 過 酸 化 反 応 の 阻 害 を,考 場 合,膜. フ える. 安 定 化 作 用 と い う こ とが 問 題 に な る.. 序 論 で 述 べ た よ う に,こ. の 作 用 に 基 づ く と思 わ. れ る 多 くの 報 告23),〜32)が な さ れ て い る.し か し こ の 膜 安 定 化 作 用 に つ い て も,そ の 解 明 は 尚 不 充 分 で,過. 照射 に よ って 誘 導 され る ク ロ ロホ ルム. /メ タ ノー ル/H2Oの. 抗 酸 化 及 び ラ ジ カ ル 捕 捉 活 性 に 依 ら ず,セ. の分 子 レベ ル で. 酸 化 反 応 の 阻害 機構 を. 考 え る上 で の 充 分 な 情 報 を提 供 し な い.膜. ト コ ン ド リア 存 在 下. 酸 化 速 度 を 抑 制 し た が,非 存 在 下 で. の セ フ ァ ラ ン チ ン の 組 み 込 み に よ り阻 害 す る も et. よって誘 導 され る ミ. 阻 害 し た.. っ た 脂 質 と ラ ジ カ ル との 相 互 作 用 を 膜 構 造 内 で. の こ と は, Nagatsuka. 照 射 に よ って誘 導 さ. Fe2+に. 系 やFe2+に. よ って 誘 導 さ. れ る メ タ ノー ル 中 で の脂 質 過 酸 化 反応 は セ フ ァ ラ ン チ ン に よ っ て 阻 害 さ れ に ぐい が,ト. コフ ェ. ロ ー ル は こ れ ら の 反 応 を 濃 度 依 存 的 に 強 く阻 害 し た. ④. セ フ ァ ラ ン チ ン はO2‑(ニ. リ ゥム 法,デ. トロ ブ ル ー テ ラゾ. ィア ニ シ ジ ン 法),. ・OH(p‑ニ. トロ. ソ ジ メ チ ル ア ニ リ ン法), H2O2(Ferrithiocyanate. と抗. 法)の. 酸 化 剤 の 相 互 作 用 に 関 して は ト コ フ ェ ロ ー ル の. ⑤X線. 照 射‑ク ロ ロ ホ ル ム/メ タ ノ ー ル/H2O. 例 が あ る が,こ. 系, X線. 照 射‑酸 性 エ タ ノ ー ル 系 で α‑ト コ フ ェ. れ に して も, Lucy. 説 が 提 出 さ れ て 以 後,明 ら ず,膜. et al.51)の仮. らか な証 明 は され て お. 安 定 化 作 用 に つ い て の 分 子 レベ ル で の. 解 明 に は 困 難 な 点 が 多 い.し. か し,膜 安 定 化 作. 除 去 活 性 を 示 さ な か っ た.. ロ ー ル は 酸 化 に よ る著 明 なUVス 化 を示 し た が セ フ ァ ラ ン チ ン はX線 ロ ホ ル ム/メ タ ノー ル/H2O系. 用 と い う機 構 に よ る 脂 質 過 酸 化 反 応 の 阻 害 を,. 示 し た の み で,. は 全 く変 化 を 示 さ な か っ た.以. の 効 果 に つ い て の 情 報 が 必 要 で あ る.現 の 報 告 と し て は,膜 15),25) ,セ. て い る.し. か し,こ. X線 照 射‑酸 性 エ タ ノ ー ル 系 で 上 の 結 果 か ら,. 在まで. セ フ ァラ ンチ ンの 脂 質過 酸 化 反 応 の 阻害 作 用は 膜脂 質 内へ の セ フ ァラ ンチ ンの 組 み込 み が その. フ ァ ラ ンチ ン に よって膜 流動 性 が低 下. 用 い て,検. ロ. 流動 性 に 関 す る もの が あ り. す る と さ れ て い る.こ rene)を. 照 射‑ク. で わ ずか の 変化 を. 解 明 す る に は,膜. 物 性 に 及ぼ す セ フ ァ ラン チ ン. ペ ク トル の 変. 原 因 で あ る と 推 定 し た.. れ に 関 係 し て ピ レ ン(Py. 討 中 で あ り同 様 な 結 果 を 得 れ 以 外 の,膜. 物 性 に対 す る. 謝. 辞. 原 稿 を終 わ るに 当 た り御 懇切 な る御 指 導 を頂 いた. セ フ ァ ラ ン チ ン の 影 響 に つ い て の 報 告 は な く,. 放 射 線 医学 教 室,青. 今 後 こ の 分 野 で の 研 究 が 注 目 さ れ る.. 助 手,教 室 の 各 位 に謝 意 を表 し ます.ま. 野要 教 授 に,並. び に,白 石 則 之 た,実 験 機. 器 の 使 用 に つ き御 配 慮 下 さい ま した,麻 酔 学 教 室, 小 坂 二 度 見 教 授,並. び に 教 室 の 各 位 に,原 稿 の御 校. 閲 を頂 い た 高 知 医 科 大 学 生 物 学 教 室,内 海 耕慥 教 授 に 謝 意 を表 し ます 。 ま た,セ フ ァ ラ ン チ ン を御 提 供 下 さ い ま した,化 研 生 薬K. K.に 謝 意 を表 し ます..
(11) 脂 質過 酸 化 反 応 に対 す るセ フ ァラ ンチ ンの 影 響 に つ い て 文 1.. 五 島 雄 一 郎:序. 論‑過. pp. 133‑146, 2.. 3.. 正 一,美. 真. 濃. 監 編,医. 大 柳 善 彦:第12章,そ. 熟 児,新. 歯 薬 出 版,. 性 酸 素 の 生 物 に 対 す る 作 用,代. R. L.: Hydroxyl. Oxygen Free Radicals. T. F.:. radicals. and. Excerpta Pfeifer,. 島雄 一 郎. 編,医. 学 書 院,. 性 酸 素,ブ. リー ラ ジ カ ル ー,馬. 場 一 雄,坂. 本. 1981. ー パ ー オ キ サ イ ドと 医 学,早. 石. 修. 監 編,共. 立 出 版,. Medica,. alteration. McCay,. of membrane. production. 1277‑1285,. in vitro:. ed. D.W. Fitzsimons,. what relevance. Excerpta. against. the damage and. in vivo., In. Medica,. produced. Amsterdam,. Reduced V.. systems. by. ed. D.W. Fitzsimons,. 1979.. triphosphopyridine. nucleotide. Use of erythrocytes. with the properties. in biological. Tissue Damage. Oxford, New York, pp. 143-176, P. B.:. phospholipids.. of a component. 1978.. damage. In Oxygen Free Radicals. Amsterdam,. and. 15,. 1979.. of protection. radicals.,. P. M.. 謝,. and biological. Tissue Damage. Mechanisms. oxygen-derived. 7.. 木 国 夫,五. 1981.. 浅 田 浩 二:活. Slater,. 生 児 の 酸 素 障 害‑活 pp. 106‑125,. の 他 の 病 気 と 活 性 酸 素,ス. Oxford, New York, pp. 19-42, 6.. 酸 化 脂 質 と 疾 患,八. 1981. 膜 の 酸 素 障 害,未. 5. Willson,. 献. 酸 化 脂 質 の 臨 床 的 意 義,過. 武 田 佳 彦:網. pp, 209‑220, 4.. 245. oxidase. to demonstrate. of a free radical.. catalyzed. enzyme-dependent. J. Biol. Chem. 246, 6401-6408,. 1971. 8.. Fee, J. A. and Teitelbaum, red cells against. 9.. Dobretsov,. 10. Shiraishi,. bilayer rigidity. N., Arima,. biscoclaurine 299-305,. O. and. mitochondrial. K., Inouye,. of lipid peroxidation. Nakazawa,. Yu. A., Olenev, membrane.. K., Shiraishi,. mitochondrial. plays a role in protecting Yu. A.:. 1972.. The increase. of. FEBS (Fed. Eur. Biol. Soc.) Lett. 84, 125. B., Morimoto, in biological. Y. and. Utsumi,. membranes.. T.:. 内 海 耕 慥,白. 石 則 之:. ジ カ ル‑,馬. 場 一 雄,坂. 15. Nagatsuka, cepharanthine,. S. and. by. 1.生. V.I., Suslova,. K.:. Inhibition. by. Physiol. Chem. Phys. 12,. peroxidation. T., Inouye,. lipid. 八 木 国 夫,錦. 本 正 一,美. 濃. T.:. 真. 監 編,医. Effects. their. Z.P.:. T. and. inhibition. Lipid peroxidation. Utsumi,. K.:. Changes. by biscoclaurine. 熟 児 ・新 生 児 の 酸 素 障 害‑活. 歯 薬 出 版,. pp. 127‑139,. of membrane-stabilizing. lipid peroxidation. in. in. alkaloid.. 性 酸 素,フ. リー ラ. 1981.. agents,. and permeability. cholesterol. in liposomes.. and. Biochim.. 1982.. K., Bohni, P., Winterhalter,. 見 盛 光:酸. membrane-bound. 1981.. on radiation-induced. causes. and. and. 1980.. 1980.. B., Nakazawa,. peroxidation. Nakazawa,. an increase. Biol. Soc.) Lett. 42, 59-62,. peroxidation. T. B. and Cheremisina,. 体 膜 と過 酸 化 脂 質 に つ い て,未. Biophy Acta 691, 171-177, 16. Eichenberger,. lipid. Adv. Lipid Res. 17, 173-249,. N., Arima,. function. Radiation-nduced. Int. J. Radiat. Biol. 37, 621-631,. Physiol. Chem. Phys. 13, 137-144,. 17.. dismutase. V.A. and Vladimirov,. after lipid peroxidation.. in liver microsomes.. 12. Vladimirov,. 14.. superoxide. T. A., Petrov,. T., Aono,. alkaloid. that. Biochem. Biophys. Res. Commun. 49, 150-159,. 1980.. 11. Yukawa,. 13. Aono,. Evidence. hemolysis.. G.E., Borschevskaya,. phospholipid -128, 1977.. enzymes. H.D.:. peroxidative. K. H., Kawato,. in the order. S. and Richter.. of the membrane. lipid domain.. 1982.. 素 毒 性 と ビ タ ミン,代. 謝,. 15,. 1287‑1295,. C.:. 1978.. Microsomal. lipid. FEBS (Fed. Eur..
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