分光 光度 法 に よ る入血 液 カ タ ラーゼ活性 の定量 お よび
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(2) 626. Fig.. Fig.. 中. 1. 過 酸 化 水 素(H2O2を0. 2. 溶 血 液(1,000倍. め られ ず260mμ. .01Mol燐. 嘉. 人. 酸 緩 衝 液 に 溶 解 し 終 濃 度0.0125Molと. 溶 血 液0.5mlを0.01Mol燐. あ た りか ら急 に 吸 収 が 増 大 して い. る. Fig. 2は1,000倍. 川. 酸 緩 衝 液2.5mlに. し た も の)の. 加 え た も の)の. 紫 外 部 吸収 曲線. 紫 外 部 吸 収 曲線. な つ て い る.ま た240mμ 以 下 で は 吸 収 の 急激 な増大 が 認 め られ る.. に 稀 釈 され た 溶血 液 の 紫 外 部 吸. Fig. 3は 基 質 の溶 液 と して 用 い る0.01Mol燐. 収 曲 線 で あ る. 280mμ を 中心 とす る最 大 吸 収 帯 が 認. 衝 液 の 紫 外 部 吸 収 曲 線 で230‑260mμ. め られ, 240‑260mμ. と ん ど 吸 収 は 認 め られ な い.. で は 吸 収 が 小 さ くゆ るい 谷 と. 酸緩. の範 囲では ほ.
(3) 分 光 光 度 法 に よ る人 血 液 カ タ ラ ーゼ 活 性 の定 量 お よ び低 「カ」血 液 症 の ス ク リー ニ ン グ法 に つ い て. Fig.. 前 編 に 述 べ た 如 くBeersら てH2O2の. 3. 0.01Mol燐. 酸. は 波 長240mμ. 緩. 衝. 液. の. 紫. を用い. 外. 部. Table. 吸. 1. 収. 曲. 627. 線. 一 次反応適合範囲 について. 残 存 量 を測 定 して い る の で 本 法 で も 一 応. それ に従 つ て測 定 を行 な つ た.し か し必 ず し も波 長 を厳 密 に240mμ. に定 め る必 要 は な く,要 す る に 溶. 血 液 に よ る吸 光 度 が な るべ く小 さ く,か つH2O2の 吸 光度 が あ る程 度 大 き くて,分 光 光 度 計 で 読 み 易 い と ころの 波 長 部 分 を 定 め る こ とが 必 要 と さ れ る.ま たH2O2濃. 度 につ い て は 測定 の 際 吸 光 度 を あ る程 度. 大 き くしな い とよ み に くい の で 滴 定 法 の 場 合 のH2O2 濃度 の2.5倍 の 濃 度 で あ る0.0125Mol =0.5)を. (O. D. 240mμ. 用 い た.. な お一 層 高 濃 度 の基 質 を用 い て 実験 を 行 な うた め には, H2O2の. 吸 光 度 が240mμ. %と な る253.4mμ. に お け る 場 合 の 約50. を 用 い る こ と も1つ の 方 法 で あ. る.こ の 場 合 に は 溶血 液 に よ る吸 光 度 が ほ ぼ 最 小 で あ る ので,測 定 上 溶 血 液 に よ る吸 収 を 減 ず る に は 好 都 合 で あ る.. 法 の如 き場合 には初速度が求 めに くい とすれ ば一 次. ⅲ ) 一 次 反 応(first. order reaction)適. 合範囲 に. ついて. 反応適合範 囲内でな るべ く初速度 に近 い部分 の値 を とることが好 ま しい と考え られ る.. Table 1 は既 述 の反 応 条 件 下 に 行 な つ た 代 表 的 な 実験 例 に つ い て第1編. 2. 基 質 濃 度 と人 血 液 カ タ ラ ーゼ 活 性 との 関 係 に. で 述 べ た 反 応 定 数Kcat(0. ついて. 〜t sec)を 反 応 時 間 経 過 に 沿 つ て 順 次 求 め た もの で. 既 述 の 如 く本 法 で は 分 光 光 度 計 の波 長240mμ. あ る.こ れ に よつ て本 法 の 如 き反 応 条 件 に よ る場 合. お け るH2O2のO.. の一 次 反応 適 合 範 囲 を窺 うこ とが で き る. Kcatは. と る た め に 滴 定 法 の 場 合 の0.005Mol. 0〜30秒 以 後0‑120秒. =0.2)で. る.な お0〜30秒. 迄 は殆 ど一 定 値 を 示 し て い. 迄 のKcatは. 比較的再現性が少 な. か つ たが そ れ は 基 質 と溶 血 液 と の混 合 が 充分 で な く 均一 にな らな い た めkcatが. 動 揺 し やす い もの と 考. え られ る.ま た120秒 以 後 に はkcatは. 順 次低 下 して. い る.酵 素 活性 度 の測 定 に は 可 及 的 に初 速 度(Initial velocity)を用 い る こ とが 肝 要 と考 え ら られ る が. ,本. 0.5)を. に. D.を な る べ く読 み や す い範 囲 に H2O2. は 好 ま し くな い の で0 .0125Mol. (O. D. (O. D.=. 用 い た.従 つ て 本 法 の 実験 条 件 を 第2編. 述 べ た 如 く定 め るな らばUV法 滴 定 法 の 場 合 の2.5倍. に. で は 基 質 濃 度 の みが. の 濃 度 と な り,他 は 全 く同一. 条 件 に す る こ と が で き る.従 つ て 両 測定 法 に よ る測 定 成 績 を 比 較 した場 合 基質 濃 度 の 点 の み が 問 題 とな り うる..
(4) 628. 中. 川. 嘉. 人. 基 質 濃 度 が 上 昇 す るに 従 つ てkcatは. 上 昇 してい る. こ の点 に 関 してBonnischen. et al4)の 成 績 に よ れ. ば 基 質 濃 度 が0.01〜0.1Molの. 範囲 では反応速度恒. こ とが わ か る.従 つ て 以 上 の如 き範 囲 内 で は基 質濃. 数 は ほ ぼ一 定 で あ り,本 法 の 如 き実 験 条 件 下 で この. 度 が 上 昇 す る に従 つ て 反 応 速 度 恒 数 は僅 か で は あ る. 程 度 の基 質 濃 度 の変 化 は反 応 速 度 恒 数 に ほ とん ど影. が 上 昇 を示 す もの とい え る.. 響 を 与 え な い もの の よ う で あ る. Table 2はH2O2. 3. 温 度 の カ タ ラー ゼ 活 性 に与 え る影 響 に つ いて. 濃 度0.005〜0.025Mol. カ タ ラ ー ゼ 活性 の 温 度 変 化 に よ る影 響 に つ いて は. 6.8に 溶 解)に. (0.01Mol燐. 酸 緩 衝 液, pH. つ い て 行 な つ た著 者 の 実 験 例 で あ る.. 本 例 で は実 験(1)と(6)は. 同 じ基 質 濃 度0.025Mol. で あ る が,溶 血 後 時 間 が 前 者 は1分,後. 者 は8分 で. あ る.. Sizer3), Bonnichsen. et al4)の 文 献 が み られ高 原 ら5). は 或 る測 定 条 件 下 で0〜60℃ 化 は, kcat値. ま で の 範 囲 の 温度 変. に対 して 有 意 な 影 響 を 示 さ な い よ う. に述 べ て い る.し か しな が ら本 法 の 如 き実 験 条件 で 測 定 した 場 合 は ど うで あ ろ うか とい う問 題 が 残 る.. Table. 2. 基 質 濃 度 と人 血 液 カ タ ラ ー ゼ 活性 との 関 係 17℃,. 0.01Mol燐. 酸 緩 衝 液,. pH.. 6.8. Fig. 4は 温 度 変 化 とkcatと. の 関 係 を 示 す 著者 の 実. 験 例 で あ る. 実 験 条 件 はTable. 3に 示 す 如 く実験 番 号R1‑R4. は 恒 温 水 槽 を 用 い て 滴 定 法 に よ り, R5, R6は 装 置 を装 着 してUV法 測 定 温 度37℃ (R1,. 恒温. に よ り行 なつ た.. 及 び25℃. の 活 性値 を 実 験4例. R3は 除 く)に つ いて 平 均 値 を求 めて 比較 す る. と100:91で. あつ た.な お この 成 績 は 滴 定 法 に よ る. 我 々の 教 室 のDataに. よ れ ばTable. 4の 如 く93%で. あ り,こ れ よ り も多 少 低 い が 大 差 は 認 め られ なか つ た. (実験6). 従 つ て 室 温 下 に 測定 実 験 を 行 な う 場 合, 37℃ で. 明 らか に 低 下 した 値 を示 して い る.し. 行 な う場 合 に比 較 して 上 記 の 如 く温 度 に よ る活性 値. そ の た めkcatは3.94 と実験(6)は. (実 験1),. 3.55. か しな が ら以 上 の如 き溶 血 後 の 時 間経 過 に よ るkcat. の 低 下 が み られ るの で 温 度 に よ る 活性 値 の補 正 を考. の 低 下 を 考 慮 して も 実 験(5),. 慮 され な け れ ば な らな い.. Fig.. 4. (3), (2), (1)と. 順次. 温 度 の カ タ ラ ー ゼ 活 性 に 与 え る 影 響 に つ い て,. R1〜R4:. Tit., R5,. R6:. UV法.
(5) 分 光 光 度 法 に よ る人 血 液 カ タ ラー ゼ 活 性 の 定 量 お よ び 低 「カ 」血 液 症 の ス ク リー ニ ン グ法 に つ いて Table 3. 実. 験. 条. 件. Fig. 5. 溶 血 後 の 時 間 経 過 に よ る カタ ラー ゼ活 性 の. 温度 の カ タ ラー ゼ活 性 に 与 え る影 響 につ い て. Table. 4. 629. 低 下につい て. 温 度 の カ タ ラ ー ゼ 活 性 に 与 え る 影 響6). な お本 実験 は 溶 血 後 室 温 放 置 の 場合 の 概 略 を 示 す もので あ る が,溶 血 液 を 低 温 に保 存 す る方 が,又 稀 釈 倍 数 が少 な い 方 がkcatの 4. 溶 血 後 の 時 間 経 過 に よ る カ タ ラー ゼ 活性 の 低. 低下 率 は 少 な い よ うで. あつ た.. 下 につ い て Ⅳ. 結. 人血 液 カ タ ラー ゼ は 採 血 後,時 間 経 過 に従 つ て そ の保 存方 法 に大 き く影響 され て 次 第 に活 性 が 低 下 し. UV法. 論. に よ る カ タ ラ ー ゼ 活性 測 定 法 の 原 理 の 検 討. てい く.な お低 「カ」血 症 の ス ク リー ニ ン グ の た め. と反 応 条 件 が 活 性 度 に及 ぼ す 影 響 に つ い て 実 験 を行. に血 液 カ タ ラー ゼ 活性 が採 血 後 の保 存 方 法 及 び時 間. な い以 下 の如 き知見 を 得 た.. 経 過 に どの よ うに 影響 され る か に つ い て は 教 室 の高 越 が別 に 詳 しい 研究 を行 な つ て い る. 本章 で は人 血 液 カ タ ラー ゼ 活性 の 測 定 実 験 を行 な うた めに1,000倍. 溶血 液 を作 つ た 際,そ の 活 性 は時. 間経過 に従 つ て ど の よ うに低 下 す るかUV法. に よつ. て 実験 を行 なつ た. Fig.5は1,000倍. 以 後0‑. 120秒 迄 の 範 囲 内で 殆 ど一 次 反応 に 従 う. 2) 基 質 濃 度0.005‑0.025Molの. 範 囲内で基質濃. 度 が 高 くな る に従 つ て 反 応 速 度 恒 数 は わ ず か に上 昇 す る.. 溶血 液 調製 後 の 時 間 経 過 とkcat. との関 係 を示 す 実 験 例 で あ る.即 ち 溶 血 後 室 温 下 (16〜20℃)に. 1) UV法 に よ る人 血 液 カ タ ラー ゼ の 過 酸 化 水 素 分 解 反 応 は既 述 の 如 き条 件 下 で は0〜30秒. 放 置 した 場 合kcatは. 時 間経 過 と 共. にほぼ直 線 的 に低 下 して い る.溶 血 後5分. 経 過 して. kcat値 が どれ程 低 下 す るか に つ い て 検 体3例(R1 を除 く)に つ い て の 低下 率 の 平 均 は2.7%で 溶 血 は蒸 溜 水0.005Mol及. び0.1Mol燐. あつた. 酸緩衝液. によつて 行 な つ た が,緩 衝 液 に よ る活 性 低 下 防止 作 用 はあ ま りみ られ ず,か え つ て 標 本 に よ る低 下 率 の 差が大 きい よ う で あ つ た .. 3) カ タ ラ ー ゼ 活 性 値 は 室 温(25℃)下 の 場 合, 37℃ に お け る値 の約9%低. での 測 定. い 値 を 示 す.. 4) カ タ ラー ゼ 活 性 値 の 測 定 は溶 血 後 時 間 の 経 過 と共 に 活 性 値 が 低 下(5分. 後 に2.7%)す. る の で,. な るべ く迅 速 に 行 な う必 要 が あ る. 5) 以 上 を 総 括 してUV法 被 検 血 よ り1,000倍 (或 は37℃)下 後0〜60秒. の至 適 測 定 条 件 と して は. 溶 血 液 を作 り, 5分 以 内 に室 温. に 測 定 を 行 な う.測 定 値 は 反 応 開 始. 或 は 少 な くと も120秒 以 内 の 値 を 用 い る. べ きで あ る..
(6) 630. 中. 本 論 文 の 要 旨は 第8回. 川. 嘉. 日本 人 類 遺 伝 学 会 総 会 お よ. 人. た恩 師 緒 方 正 名 教 授 並 び に 高 原 滋 夫 教 授 に 深甚 の謝. び 第34会 日本 衝 生 学 会 総会 に お い て発 表 した .. 意 を 表 し ます.又 終 始御 好 誼,御 鞭 撻 を い ただ いた 小 倉 義 郎 助 教 授,広. 擱 筆 す る に 当 り御 懇 篤 な る 御 指 導 御 校 閲 を 賜 わ つ. に 教 室 の 諸 先 輩 諸 兄 に 感 謝 致 し ます.. 文 1) 赤 堀 四 郎,酵 素 研 究 法II,. 島 日赤 病院 武 内元 成 博士 に,更. 献 -473 , 1944 4) R. K. Bonnichsen et al.:. 324朝 倉 書 店,東 京. 1957. 2) Chance, B., Maehly, A. C.: Assay of catalase. 685 1947. and peroxidases. In Colowick& Kaplan (ed.), "Method s in Enzymology" 2, 764, Academic Press, N. Y. 1955 3) Sizer, I. W.: Temperature activation and in. 5) Takahara, S., et al.:. Hypocatalasemia; A new. Genetic carrier state, ABCC Technical Report, 05-59, 4, 1959 6). 緒 方 正 名,カ. タ ラ ー ゼ の 測 定,無. activation of the crystalline catalase hydrogen. 液 症 の 遺 伝 学 と生 化 学. peroxide system. Jour. Biol. Chem., 154, 461. No.. Studies the. on the. Measurement. Screening. Part. 3.. Method. of Human. 5,. 297,医. of. experiments. UV. on. method. the. blood. 京. Activity. Vol. 54,. 1965. and. by Spectrophotometry supplemented. measurement. catalase. カタ ラー ゼ血. 医 学 の あ ゆ み,. 歯 薬 出 版,東. Blood Catalase. of Hypocatalasemia. Evaluation. Acta Chem. Scand. 1,. with. basic. of human. activity. By Yoshito Department. of Public. Health,. NAKAGAWA. Okayama. (Director:. University. Author's The. present. catalase it. has. first. communication. activity been. order. of. human. clarified. that. kinetics. within. deals. blood the. by. with UV. reaction. 30-120. Catalase at. It minutes. values,. Kcat,. measured. School, Okayama,. Japan. Abstract the. principle. of. measuring. method.. Under. the. conditions. of. catalase-hydrogen. peroxide. and. calculating. previously practically. the. described, follows. the. seconds.. The velocity constant, k, seems to have no concern in the range of 0.005-0.025 mole. taken. Medical. Prof. Masana Ogata). under. room. with. the substrate. temperature,. are. catalase. activity. about. concentration. 10%. lower. than. with those. 37•Ž.. has after. been. found. hemolysis. that. measurements. of. the. have. to be. taken. within. 5.
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