実験２
電気泳動
光合成関連 ン
質 分離
目的：
ン 質を分子量 違い 分離 手法
あ SDS 電気泳動法
原理を理解 そ 手法を習得
材料：
ノ テ Synechocystis sp. PCC 6803
野生株 びcpcA遺伝子欠損変異株
実験：
班単位 う
A：野生株 びcpcA遺伝子欠損変異株 細胞を破砕後
ン 質を電気泳動 分離 ニン
ン を同定 そ 分子量を推定
B：分光光度計を用い 細胞 吸収 を測定
ニン 光合成 利用 光 波長を推定
実験
A
電気泳動
手順
１ 泳動サン
調製
1人２本：野生株 変異株を一本
培養懸濁液を 混合
野生株 変異株を 1 mLい 蓋を
遠心 15,000 rpm, 1分
沈澱 ッ
さごご µL 細胞破砕緩衝液を
加え ッテ ン
再懸濁
そ 全量を移
ュー
細胞破砕 4,000 rpm , 40秒
蓋付 ュー 蓋
蓋をあ 自動 ッ
細胞を吸わ い う注意
上澄 液を 除
沈澱 細胞 上澄 液
→
ー をい
入 注意
蓋を 破砕機 ッ
蓋
2×サン ッ ーさごごµLを加え 混合
出来上 ！
遠心 15,000 rpm, 10秒
2
電気泳動
1. 泳動用緩衝液を泳動槽 線 い
2. 板 ー をゆ 垂直 抜 取
ーン 配列 乱 場合 教員 TA 申 出
3. 板を泳動槽 (教科書参照)
4. 上部槽 上端 2-3 mm 完全
浸 泳動用緩衝液を入
5. 自動 ッ 両端 ーン 分子量 ー ーを
10 µL そ 間 ーン 各自 サン さご µLを
ー を 吸わ い う 上 方 吸い
ゆ 流 込
全 ーンを埋 方 い 泳動
6. 電源部 泳動槽 取 付 を う(教科書参照)
7. ン ッ OFFを確認 AC ーを
ン ン 差 込 ン ッ をON
Tris-Gly PAGEL High ー 選択 い
を確認
8. RUN ンを押 泳動を開始
泳動 30分経 自動的 終了
泳動 30分 間 実験Bを う
３ ゲ
染色、脱染
手袋を 操作
1. 泳動終了後 泳動用緩衝液を流 捨 泳動槽
板を取 出 軽 板全体を水洗 後
テ を使 板を 裏表 分 う
右下を切
2. を 板 染色用 容器 入
50mL ュー 染色液全量 約30mL)を加え
を 後 電子 ン ッ 加熱処理
あ ー 約30〜40秒 目安 火傷 注意
容器を振 う機 置 約10分間振 う
染色液を を使 50 mL ュー 必 戻
3. 容器 水道水を50 mL程度加え 量 入 必要
い 2. 同様 電子 ン 加熱処理後 約10分間
ン 見え う 振 う
※脱染水 指定 容器 廃棄 絶対 流 捨 い
4. を写真 撮
撮影方法 い 教員 指示 従う
実験
B
吸収 ペクト
測定
1. 野生株(WT)又 変異株(MT) 培養懸濁液 1 mLを
測定用 入 測定を う 班 1本
あ 培養懸濁液を 混合 自動
ッ を用い 懸濁液を分取 ー ン
事前 教員 補正済 培養懸濁液 測定
を行う い
2. ノ廃液入 細胞を捨 後 を蒸留水 DW
5
タン ク質名称 け 分子 (kDa) 存在場所
ロッドリンカー 34 ロッド
ロッドリンカー 33 ロッド
ロッドコ リンカー 30 ロッド コ 間
フ コシ ニン 21 ロッド
ロフ コシ ニン 18.5 コ フ コシ ニン 17.5 ロッド
ロフ コシ ニン 17 コ
参考資料
表 教科書 p.30
生 株 ？ 変
異 株 ？ マ
ー カ ー
kDa
コ ロッド
フ コシ ニン
フ コシ ニン
ロフ コシ ニン
ロフ コシ ニン
ロッドリンカー
ロッドコ リンカー
図： 生株 フ コビリソーム 構造
図：電気泳動 け
後かたづけ
泳動漕
水 洗 あ 実験机上 逆 乾
染色用ガラ 容器
水洗後 各自 実験机 逆 乾
ビー 入った容器
各自 実験机 置
使用済ゲ 板
軽 い 所定 机 指定容器 捨
包装袋 ー 不燃
使用済 イク チュー
軽 水 洗浄後 指定容器 を開 捨
使用済 じ蓋付チュー
指定容器 を閉 捨
15mlチュー 野生株・変異株用
水洗→蒸留水 い 後 野生株・変異株を
分 所定 机 洗い桶 逆 乾 う
入
ラ チック 分光器
純水 後 逆 各自 実験机上
立
ート 内容
○タイト 目的 材料と方法 生物名
○結果
A)電気泳動
• 写真 余白を切 取 糊付
• 各 ーン 説明 分子量 ー ー サ 記載
• 実験A課題1〜3
– 課題1： ニンα ン 特定 そ 特定理由
– 課題2：変異株 ニンα以外 失わ ン
質 特定
– 課題3：変異株 ソー 構造 う
い 図 文章 説明
2) 細胞 吸収
• 野生株 変異株 余白を切 取 糊付
• 株 種類 読 取 吸収 ー 波長を記載
• 実験B課題1 問い 3 あ 注意
– ノ テ 光合成 利用 い 波長 推定
– 野生株 変異株 見 目 色 違い 生 原因を
吸収 違い 噛 砕い 説明
– ニン 吸収 光 波長
○考察
書 しょう。
例1: フ コシ ニン 以外 も影響 出た理由 ?
例2: 変異株 増えた ンド い ? ？
7
遺伝子 欠損 あ ニンα あ 注意
