[報文]カラシナのカルス由来プロトプラストからの不定芽再分化: 沖縄地域学リポジトリ

Title

[報文]カラシナのカルス由来プロトプラストからの不定

_芽再分化

Author(s)

徳元, 正和

Citation

南方資源利用技術研究会誌 = Journal of the society tropical

_{resources technologists, 10(1): 1-6}

Issue Date

1994-03-20

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12001/14085

南方資源利用技術研究会誌 Vol.10Nol 1- 6 1994

カラシナのカルス由来 プロ トプラス トか らの不定芽再分化

徳 元 正 和 (沖縄県農業試験場) ShootRegenerationfrom ProtoplastsDerived from CallusofBrassicaJuncea MasakazuTOKUMOTO

OkinawaPrefecluralAgriculturalExperimentStation,

4T222Sakiyana-cho,Naha,Okinawa903

諸 言 プロ トプラス トを用いた細胞融合や遺伝子 導 入など,細胞 レベルで作物育種 を行 う場合, プ ロス トブラス ト培養法 は育種の技術 として欠 か せ ない ものにな りつつある. これ まで多 くの作 物種でプロ トプラス トか らの植物体再分化 報告 があるが1),特 に野菜分野 で の成功例 が多 い. なかで もアブラナ科 のキ ャベ ツやブロッコリー, ウ リ科のキュウリやメロン等ではプロ トプ ラス トか らの植物体再分化が安定的な技術 にな って お り,体細胞雑種 に よる新 品種 の作 出や遺伝 子 の導 入 等 , 育 種 - の利 用 が 試 み られ て い るZ) 3) 4) 中国 を原産 とす るアブ ラナ科 の カ ラシナ は, 沖縄地方 における特産野菜 として定着 してい る が,国内での育種例 はあ ま りな く, また, プロ トプラス ト培養 についての報告 は見あたらない. 本研究 は地域特産野菜 に対す る細胞育種技術 の応用が 目的であ り,本報ではカラシナの子 葉 か ら誘導 したカルス を用いてプロス トブラス ト を分離培養 し, カルス形成 を経て不定芽形成 が 確認 されたので報告す る. 実験方法 1) カルスの誘導 と増殖 '沖縄県那覇市首里崎山町4-222 カラシナ (Brassica junceaCzern.etCoss) の種子 を,70%エ タノールに30秒間, 1%次亜 塩素酸ナ トリウムに10分間浸漬滅菌後,滅菌水 で3回洗 浄 した. これ をMurashige･Skoogの 固形培地 (M S培 地) に播種 し, 27℃,16時 間照 明で1週 間培 養後, 展 開 した子葉 をBA (ベ ンジルアデニ ン), カイネチ ンとNAA (ナ フチル酢酸), 2.4-D組合せのM S固体培地 に移植 しカルス誘導 を行 った. 誘導 カルスは大槻 らの方法 に準 じて5)ステ ン レスメ ッシュを用いて砕 き,M S液体培地 (2. 4- D lm9/A)で回転振 とう培養 して増殖 し た.培地 は1週間毎 に新鮮培地 と交換 した. 2) プロ トプラス トの分離 増殖 した カルスは洗 浄液 (0.5Mマ ンニ トー ル液) 中で細断後,切片 をマセロザ イム0.1%, セルラーゼ オノズカR-10,RSの各0.5%, デキ ス トラン硫酸 カ リウム0.5%, マ ンニ トール0.5 M,pH5.7の酵素液にいれ, 27℃,50rpmで 3 時間回転振 とうした. プロ トプラス トを含 む酵 素液 は80/Jmのナイロンメ ッシュの フ ィル ター で渡過 し, 500rpmで 5分 間遠心 後 に上澄 液 を 捨て,沈殿 したプロ トプラス トを洗浄液に懸濁 した.同条件で さらに2回遠心 ･洗浄 を繰 り返 し酵素液 を除いた. 3) プロ トプラス トの初期培養条件 の検討 調整 したプロ トプラス トは浸透圧濃度 に対 す

る安定性,初期分裂 にお け るホ ルモ ンの影響 , 基本培地濃度及 び窒素塩濃度の影響 につ いて調 べ た. 浸透圧濃度 に対す るプロ トプラス トの安 定性 につ いては, プロ トプラス トを各濃度 のマ ンニ トー ル液 で約1×10bl国に な る よ うに調 整 し, 6cmシャー レに 3mlずつ添加 し培養 した.各時 間における健全 な形 の プロ トプラス ト数 は, 倒 立顕微鏡で計測 した. プラ トブラス ト分裂 に及ぼすホルモ ンの影 響 につ いては, BAとNAAの各濃度組み合 わせ のM S培地 を用 いて調べ た. プロ トプラス ト分裂 に及ぼす培地組成の影 響 につ いては,NH｡N03を (NH｡)2SO.に換 地 し た修正MS培地 を用 い, あ らか じめ窒 素 源 を除 いた同培地 にKN03も し くは (NH.)2S04を添 加 して,濃度別の影響 を調べ た.細胞分裂 は培 奉 5日後に倒立顕微鏡 にて測定 した.なお, 上 記培養培地 は1%の シ ョ糖 を含 み, pH5.7に調 整 した液体培地で,培養 は27℃の暗黒条件下 で お こなった. 4) コロニー形成 と不定芽誘導 修正M S培地 1/ 2濃度,マ ンニ トール0.45 M, シ ョ糖 1%, (NH.)2SO.200mg/ e､K NO3475mg/

e

を基 本培 地 と し, ホ ルモ ンは BA lm9/

e

とNAAO.5mg/

e

の組 合せ , ち しくは2.4-D lm9/

e

に活性炭 (0.035%), カサ ミノ酸 (0.025%) 及 びConditioning培 地 (あ らか じめ基本培地 で カ ラシナ葉 を培 養 した 培養 ろ液) を50%添加 した培地で プロ トプラス トの初代培養 を行 った.培養 は27℃,暗黒 条件 下で行 い約3週 間_I.コロニ ーが形成 された. コ ロニーの形成 された培地 は2週間毎 に培地交換 を行 い, コロニーの生育 を促 した.培養後 5-7週間を経過 し2- 3mm大 に生育 したカルス を 固形培地 に移植 し不定芽 の誘導 を行 った.不 定 芽誘導 は27℃,約2,000lx, 16時 間照 明下 で 行 った. 南方資源利用技術研究会誌 実験結果お よび考察 プロ トプラス トの材料 は通常葉 肉 を用 いて行 うことが多い. しか し, カラシナ葉 肉由来 の プ ロ トプラス トは物理的刺激 に弱 く,精製時 にお ける収量減 と生存率の低下, さらに細胞分裂 の 遅延 と異常 な分 裂 が観 察 され た (Fig.1). そ こで,大槻 らの方法 31に したがい, カルス を材 料 に用 いて プロ トプラス トの単離 と培養 を試 み た. Fig1T hefirstcelldivisionofleafmesophyll protoplast 子 葉 か らの カルス誘 導 をTablelに示 した . オーキ シンの2.4-D, NAAそ してサ イ ト カイニ ンのBA, カイネチ ンを含 むいずれの培 地 において もカルスは誘導 された.サ イ トカ イ ニ ンは単独 で も増殖効果 は高か ったが,サ イ ト Table1 Cullusinductionandplantregeneration from leafofB.junceaonMSmediumcontaining auxinandcytokinin Cytokinin (m9/

e

)

BA Kinetin Aux

】

nk/l) 0 05 1 5 05 1 5 2.4D O 十十十 十十† ††† 十日 十†十 十†† 05 十l H †十 †十 †† † 十 1.0 †十 †† † † 十† H H 20 十十 I十 † H H 十 † NAA O5 十†なIII6/仰HG/利手目刺 ††刺 †IW Il刺 10 ††刺十什6AH16JQlH川l †刺 十刺 1刺 2.0 1細目iB)HiC)++6州 1刺 川) +刺 Degreeofcalluslng.･notVisible.

+

.poor.

++

:good,

+++

verygood S.ShootformatlOnR:Rootfomat10m

Vo110Nol 1994 カイニ ンを含 む培 地 の カルス はやや緑色 をおび, 形状 もオーキ シ ン単独 の カルス とは異 な り, か つ酵素処理 に よるプロ トプ ラス ト分離 お よび収 量が低 か った. しか し,2.4-D単 独 培 地 で の カ ルス増殖 はサ イ トカ イニ ンを含 む培 地 に劣 る も のの,酵素処 理 に よるプ ロ トプ ラス ト収量 は多 か った.従 って,以後 の実験 にお け るカル ス誘 導 お よび増殖 は2.4-Dlm9/eを含 むMS培 地 で 行 った. NAA を含 む培地 で はカルス形成 後 発 根 がみ られ, さらに NA AOl5-1mg/eとBAO. 511m9/Aの組合 わせ 範 囲 にお い て は シ .1- ト 形成 が認 め られた. いわゆ る,脱分化 した カ ル スか らの,植物体再分化が確認 された (Fig.2). Fig 2 Shootformation from cullus on MS medium containing BA and NAA

プロ トプ ラス トのマ ンニ トール濃度 に対 す る 安定性 をTable2に示 した. 浸 透 圧 剤 は通 常 マ Table 2 EffectofMannitolconcentrationon protoplaststability in B.juncea

1

15 20 30 48(hr)

+

+

0 5 0 5 0 5 0 5 0 0 2 5 7 0 2 5 7 0 4 4 4 4 5 5 5 5 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0

+

十

十

十

+

十

十

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

十

+

十

十

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

十

十

十

十

十

十

十

+

+

十

十

十

十

十

十

+

十

十

十

十

十

十

+

十

十

十

十

十

十

十

+

+

± 士 十

十

十

十

+

一 ･± ･±

+

± ± 土 一

+

Degreeofsurv)vatprotoplast.一,0%,±:く3%,+:3-10

%

,

十

十

:

10-30%,

+

+

+

:30-50%,++++:>50% ンニ トール な どの糖 アル コールやぶ ど う糖 な ど の糖 を用 い るが,植物 の種類 や組織 の由来 に よ り浸透圧 剤 や濃 度 に対 す る安定性 に差異がある. 代 謝 的 に不 活性 と考 え られ最 も利用 されて い る マ ンニ トール は,0.3-0.7Mの濃 度範 囲 で利 用 され るが, カラシナ プロ トプ ラス トにおい て は 0.475-0.5Mの濃度 で最 も安定 であ った. Table3 EffectofNAA andBA onprotoplast division in B.juncea NAA (mg/

e)

BA(m9/A) 0.2 0.5 1.0 2.0 2 5 0 0 0 1.0 9 8 5 9 5 6 2 0 1 1 2 2 5 4 7 4 3 1 2 9 1 1 2 2 3 7 8 9 8 7 7 1 1 1 2 12.7(%) 10.7 8.4 6.9 プロ トプラス ト分裂 にお よはす ホルモ ンの影 響 をTable3に示 した.植 物 細 胞 の分 裂 は, サ イ トカイニ ンあ るい はオーキ シ ン単独 で は効 果 の低 い事 が あ り,両者 の相乗効果 で分裂が 促 進 され る と考 え られて い る. しか し

, 2

つ の ホ ル モ ンが どの様 な働 きを してい るのか, まだ は っ き りした結 論 は得 られて ない6). カラシナ プ ロ トプ ラス トにお け る分裂率 は, BAO.5- 1n一g/ eとNA AO.5-1mg/eの組合せ範 囲 で比 較 的 高 い分裂率が得 られ, BAlm9/ eと N A AO.5

m

9

/

eの組合せ で最 も分裂率が高 か った. 窒素源 を除いたM S培地濃度及 び同培地 に添 加 す る硝酸塩 濃度, ア ンモ ニ ウム塩濃度が プ ロ トプ ラス トの初期分裂 に及 ぼす影響 をTable4, 5に示 した.植物 には窒素 源 と して NH｡+を好 む植物 やNO 3-を好 む ものが あ る. また,培 地 中の Nの形態 が NH｡+か NO 3 か とい うこ とは 単 に細胞 の増殖 のみで な く,不定肱形成 に も関 係 してい る7㌧ M S培 地 濃 度 及 び K NO3濃 度 が カラシナの プ ロ トプラス ト分裂 に及 ぼす 影 響 を見 る と (Table4),M S培地が 1/ 1- 1/ 2

Tab)e 4 Effect of varied concentration of KNO,andMS'mineralsonprotoplastdivISion lnB.juncea Dilution KNO.(mg/

e)

ofMS' 0 237 475 950 1,900 3,800 1/ 1 5-9 23.2 36.2 16.9 10.2

0

1/ 2 5.1 22.5 26.4 16.1 9.8

0

1/4 7,3 8.5 8.3ll.4 9.6

0

l/8 0

0

0

0

0

0

'MSmineralsⅥereexceptedforanJtOrOgenSource

TabJe 5 Effect of vallied concentration of (NH右 SOland MS● minerals on protoplast d】vision inB.Juncea DIIution (NH.)ZSOl(m9/ e) ofMS'

0

200 400 800 1,600 3,200 1/ 1 5.4 18.7 19.8 16.5 16.2 7.2 1/ 2 6.4 34.7 31.3 17.6 17.0 6.2 1/ 4 8.2 18.8 25.4 10.2 5.1 0 1/ 8

0

0

0000

●MS m】neralsweresameTable4 南方資源利用才支術研究会誌 濃度, K N03が237-950m9/eの範 囲で比較 的良好 な細胞分裂が見 られた.最 も分裂率 が高 か った の はM S培 地1/ 1濃 度 でK N 03が 475rng/ eで あ った.冗 NO,の高濃 度 は初期 分裂 に阻害的 に働 いた. また, (N H｡)コS04 濃 度 の 影 響 を見 る と (Tables), M S培 地 1/ 1- 1/ 2濃度及 び (N H4)ごSO｡の200 - 800m9/

e

の 範 囲 で 良好 な分 裂 が 見 られ , M S l/ 2濃度及 び (NHJ)2SO.200mg/

e

で最 も分裂率が高か った.K NO3同様 , 高濃 度の (NH.)2S0.は阻害的 に働 くことが示 さ れた.いず れの場合 も, M S培地1/ 8の低 濃 度で は分裂 は認 め られなか った. 上記の結果で得 られた最適条件 の培地 を基 本 に, プロ トプラス ト分裂, コロニー形成, シュ ー ト形成 ,発根 に及 ぼす種 々の添加物 の影響 を Table6に示 した.初期培 養 にお いて活性 炭添 加培地 を除 く各培地で細胞分裂 (Fig.3)が見 られたが,2.4-D添加 の培地では分裂率が低 く, コロニー形成 まで至 らなか った.最 も細胞 分裂 お よびコロニー形成 (Fig.4)が良好 だ ったの はCondltioning培 地で,同培 地 で形成 され た コ ロニーを継代培地に移植するとカルスを経てシュー トが形成 された (Fig.5).同培地におけるシュー ト形成率 は12%, 発 根 率 が94%であ った. ま た,対照及 びカザ ミノ酸添加 の培地において も, コロニーお よびカルス形成 を経 て出根が見 られ たが, シュー ト形成 は見 られなか った.

Table6 Effectofthe growth regulation on colonyformation and plantregeneration inB.juncea

Growthregulators(mg/

e

)

1ndcultivation 2ndcutlVation

l coOny Soot root

Additives BA NAA 2.4-D division formation

*

formation formation Control l 0.5 33.9(%) 1 18.8 Activated 1 0.5 0 Chacoal(0.035射 1 0 Cazamino 1 0.5 39.3 Acid(0.025%) 1 14.4

++

o₀ ㈲ 0 0 0

0

100(

0

%) 0 0 100 0 Conditioned 1 0.5 54.5

十++

12 94 Medium (50%) 1 17.5 0 0

*

Degreeofcolonyformation

,-:

0,十 :10-50

,++:

50-100

,+++:

>

100/plate･

γol.10 Nol 1994

Fig3 Thefirstcelldivisionofcullus protoplast

Fig4 A cellcolonythathadformed3weeks afterprotoplastisolation

Fig5 Shootregenerationfrom protoprast

植物 のプロ トプラス ト培養 において,新 しい 培地での分裂 ･増殖 は困難 だが,すで に培 養 に 使用 した培地 (Conditioning培 地) を新培 地 に 加 えて培養す る と増殖が促進 されることがある｡ これは,成長旺盛 な細胞 や カルス等 か ら細 胞 分 裂 を促進す る物質が培地 中に分泌 され る と考 え られて い るが8), Bellincampiらはニ ンジ ンの 培 養 細 胞 か ら分 子 量 約 700のConditioning Factorと呼 ばれ る細胞増殖 因子 を分離 し9

)

, ま た,Birnbergらは対数増殖期 にある トウモ ロコ シ懸濁細胞培養培 地 か ら分 子 量約1,200の細 胞 増殖 因子 を確認 してい る10). これ らの因子 の構 迄 は植物 ホルモ ンとは化学的 に類似せず, オ リ ゴ糖類 と推定 されているが,構造 は解明 されて ない. カラシナ葉培養培地 を用 いた場 合 もプ ロ トプラス ト分裂及 びコロニー形成 を促進 した こ とか ら,葉培養培地 中には,植物 ホルモ ンとは 異 なる,細胞増殖 に関与す る因子が分泌 されて いる可能性 が示 された. 要 約 力ラシナ カルスか ら単離 したプロ トプラス ト を用 いて,初期分裂 に及ぼす基本培地濃度, 窒 素塩濃度の影響 ,ホルモ ン濃度の影響, さ らに 不定芽再分化 に対す る各種添加物 の効果 につ い て検討 した. カラシナプロ トプラス トは浸透圧調節剤 のマ ンニ トール0.475-0.5Mの範囲で安定であった｡ プロ トプラス トの初期分裂 に対 して, BA l m9/eとNAAO･5mg/

e

の ホ ルモ ン組 合せ で 効果が高 く,分裂 率 は29.4%で あ った. また, 修正 M S培地 (NH.NO,を (NH

j

)l･S0.に 置換) の窒素源 と して (NH.)2SO.は200mg

/e

, K N 03は475mg/

e

の濃 度 で もっ と も 高 い分裂率が得 られ,それぞれ34.7%, 36.2% であ った.修正 M S培地 中の無機塩濃度 (窒 素 源 は除 く) は1/ 2濃度が効果 的であ った. 得 られた最適条件 の培 地 に, 活性 炭 (0.035 %), カザ ミノ酸 (0.025%), コ ンデ シ ョニ ン グ培地 (50%)を添加 して, プロ トプラス ト培 茸 をす る と,活性 炭以外 はコロニーを経 て カル スが形成 された.特 にコ ンデ シ ョニ ング培 地 で はコロニ ーお よびカルス形成効果が高 く,得 ら れたカルス を再分化培地 に移植す る と, コ ンデ シ ョニ ング培地で不定芽形成 (形成率12%)が 見 られた. しか し,他 の培地で は不定芽 は形 成 されず不定根 のみ形成 された. 文 献 1) 中島皐介 (1994) 1993年 度 細 胞 育 種技 術 の進捗状況, BRA TNテクノニュース, 42,p22

南方資源利用技術研究会誌 2)赤松豊和,他 (1988) 育雑 ,38(別 1), 14. 3) 田口拓郎 ,他 (1993)植物組織 培 養,10, 138. 4)吉岡啓子,他 (1992)育雑,42,277. 5)大槻義昭,他 (1988)育雑,38 (別1),78. 6)倉石すす む (1990)植 物 ホ ルモ ン 〔第2 版〕,P89.

7)S.Narayanaswamy,(1977)"PlantCell,

Tissue,and Organ Culture

"

, ed. by∫. Reinert,Y.P.S.Bajaj,p.178,Springer -Verlag,Berlin.

8)山川 隆, 児玉 徹 (1990) 植物細胞工

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9)Bellincampi,D andMorpurgo,G (1987) PlantScience51,83-91

10) Birnberg,P.氏.et al(1988)∫.Plant PhysioL132,316-321