Studies on the Autolysis have an effect of pH derived from       Soybean Seed Protein during Germination

発芽各時期における大豆種子蛋白質の自己分解に及 ぼすpHの影響

著者 宇高 京子, 森永 真希子

雑誌名 東京家政大学研究紀要 2 自然科学

巻 38

ページ 17‑23

発行年 1998

出版者 東京家政大学

URL http://id.nii.ac.jp/1653/00010619/

〔東京家政大学研究紀要 第38集 （2），p．17〜23，1998〕

発芽各時期における大豆種子蛋白質の     自己分解に及ぼすpHの影響

宇高 京子，森永真希子  （平成9年10月2日受理）

Studies on the Autolysis have an effect of pH derived from       Soybean Seed Protein during Germination

Kyoko UDAKA and Makiko MoRINAGA

     （Received on October 2，1997）

1．緒  言

 「幼根が種皮を破る」という形態的変化を最終過程と して，それに先立って起こる一連の細胞内生理生化学的 変化を一般に「発芽」という．

 従来から宇高らは，この発芽過程での第一段階である この異化作用に関与するプロテアーゼについて検討して いる1）〜6）．そこで本論文では発芽に伴う大豆種子蛋白 質の自己分解に与えるpHの影響にっいての実験結果を 得たので報告する．

2．実験方法

（1）試料の調整

 前述5）の通り大豆種子を発芽させ，試料採取は発芽 0，1，3，5および7日目に行い以下の実験に供した．

（2）発芽各時期からの粗酵素液の抽出

 上記（1）の発芽時期から20粒ずっ採取し，胚軸および幼 根を除去し，1．OM食塩を含むバルビタール緩衝液

（pH8．0）を15ml加え， Ultra−turraxホモジナイザー で3分間（氷水中）磨砕した．次ぎに日立高速冷却遠心 機（20PR−52）で15000rpm，20分間遠心し，その上澄 液を粗酵素液として，以下の実験に供した．

（3）緩衝液の調整

（3−1）pH4．0（0．1M酢酸緩衝液）

（3−2）pH5．0（0．1M酢酸緩衝液）

（3−3）pH6．0（0．1M燐酸緩衝液）

（3−4）pH7．2（0．1M燐酸緩衝液）

（3−5）pH8．0（0．1Mトリス塩酸緩衝液）

（3−6）pH9．0（0．1Mトリス塩酸緩衝液）

（4）試料の調整

 上記（2）の発芽各時期からの各粗酵素液0．lmlと各緩衝 液O．6meを加え，試料調整し，0分および38℃で120分間 保温した．また，大豆11S蛋白質分画区分0．2m4と各粗酵 素液0．1meおよび緩衝液（pH8．0）0．6m聴加え，0分と 38℃で120分間保温した．

（5）試料の純度の検定方法

（5−1）グラジエントスラブゲル電気泳動法   E液：トリスアミノメタン（メルク社製）10．75g      と棚酸5．04gとNa2EDTAO．93gを純水で

     lOOOrn4とする．

  F液：アクリルアミド57．6gとビスアクリルアミド      2．4gをE液でIOOm4とする．

  G液：アクリルアミド7．68gとビスアクリルアミド      0．32gをE液で100rneとする、

  H液：3一ジメチルアミノプロピルニトリル0．3m4を      E液でIOOm4とする．

  1液：過硫酸アンモニウム0．3gをE液でIOO rn2とす      る．

   以上の溶液でF液：H液：1液＝2：1：1で混   合し30％ゲル溶液作成，次ぎにG液：H液：1液＝

  2：1：1で混合し，4％ゲル溶液作成し4〜30％

  グラジエントスラブゲルを作成し，電気泳動を行う．

  アミドブラック10Bで染色し，7％酢酸で脱色する．

栄養科 食品学第一研究室

（17）

（5−2）SDS電気泳動法

 A液：0．5M燐酸緩衝液（pH7．2）

 B液：1％SDS溶液

宇高 京子・森永真希子

 C液：アクリルアミド22．2gとビスアクリルアミド     0．6gを純水で100meとする．

 D液：N，N， N ， N 一テトラメチルエチレンジ     ァミン（TEMED）

 E液：過硫酸アンモニウムO．0225gに純水1．Sm2を加     える．

 F液：2一メルカプトエタノール（またはDTT）

  以上の溶液で10％ゲルカラム22本分を作成する  （A液6m6， B液3 me，純水6m2， C液13．Sme， TE  MEDO．04Sm4， E液1．5nfを加え，気泡が生じない  ように，良く撹絆する）．電気泳動を行い，アミド  ブラック10Bで染色し，7％酢酸で電気脱色する．

（5−3）酢酸酸性尿素ゲル電気泳動法

A液：アクリルアミド60gとビスアクリルアミド0．4    gと尿素36gを純水でIOOmeとする．

B液：氷酢酸43．2meとTEMED4meと尿素36gを純    水でIOOmeとする．

C液：過硫酸アンモニウム0．14gと尿素36gを純水    でIOOm4とする．

D液：尿素54gを純水でIOOm4とする．

E液：0．1M酢酸溶液

F液：2一メルカプトエタノール（またはDTT）

 以上の溶液でA液：B液：C液＝2：1：5の割 合で混和し，良く脱気し，ゲルカラムを作成する．

サンプル量：D液＝1：2の割合でサンプル調整し，

DTTを加え，50℃で2時間保温しておく．上槽を 陽極に，下槽を陰極にE液を満たし，電気泳動を行 う．アミドブラック10Bで染色し，7％酢酸で電気

脱色する．

Table．1SDS−Gel Electrophoresis Pattern of the Autolysis have an Efect on pH during Germination

day after pH pH pH pH pH pH pH

ge「mination 4．0 ^{5．0 6．0 7．2 8．O} 9．0 8．0＋9置ycinin

0

O

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1 × × ＠ ＠ ＠

0 0

2

3

0

5

O O

⁰ O

7

＠alage movement

o   middle movement

＊a littie movement

×not movement

発芽各時期における大豆種子蛋白質の自己分解に及ほすpHの影響

 i灘iド 舞

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灘り糠・灘 脚一

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Fig．1 Gradient slab Gel Electrophoresis Pattern of the autolysis have an efect on pH derived     from Soybean Seed Protein during Ungermination．

（1）pH 4．0，

（5）pH 8． 0，

（9）pH 8．0，

（13）pH 8．0，

（15）glycinin

騰1 繋︑︑

 Omin．（2）pH 4．，120min．（3）pH 5．0， 0mln．

 Omin．（6）pH 6．0，120min．（7）pH7．2， 0min．

 Omin．（10）pH8．0，120min．（ll）pH 9，0， 0min．

add to glycinln， Omln．（14）pH 8．0， add to glycinin，

 （16）conglyclnin

（4）pH 5．0，120min．

（8）pH7．2，120min．

（12）pH 9．0，120mln．

120min．

ぞ璽櫛

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譲嚢 懸 ^灘繋

獺 縫

鰐醗

       、一 ＿．一遡＿＿＿＿、＿  懸・

       玉23 4567891911夏ll 1．3141516

Fig．2 Gradient Slab Gel Electrophoresls Pattern of the autolysis have an efect on pH drlved     from Soybean Seed Protein during one Day after Germination．

  モ聯

（1）pH 4．0， 0min．（2）pH4．0，120min．（3）pH 5．0， 0min．（4）pH 5．0，

（5）pH6．0， 0min．（6）pH6．0，120min （7）pH 7．2， 0min．（8）pH 7．2，

（9）pH8．0， 0min．（10）pH8．0，120min．（11）pH9．0， 0min．（12）pH90，

（13）pH8．0， add to glyclnin， Omin．（14）pH 8．0， add to glycinin．120mln．

（15）91yclnin  （16）conglyclnin

120min．

120min．

120mln．

（19）

      宇高 京子・森永真希子

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Fig．3 Gradient Slab Gel Electrophoresis Pattern of the Autolysis have an efect on pH drived     from Soybean Seed Protein during 2 Days after Germination．

    （1）pH 4．0， 0min．（2）pH4．0，120min．（3）pH 5．0， 0min．（4＞pH 5．0，120mln．

    （5）pH 6．0， 0min．〈6）pH6．0，120min．（7）pH 7．2， 0min．（8）pH 7．2，120min．

    （9）pH 8．0， 0min．（10）pH8．0，120mm．（ll）pH9．0， 0min．（12）pH 9．0，120min．

    （13）pH 8．0， add to glycinln， Omin．（14）pH 8．0， add to glycinin，120min．

    （15）glycinin  （16）conglycinin

灘 撫 難

灘

       123456 78910111213i41516

Fig．4 Gradient Slav Gel Electrophoresis Pattern of the Autolysis have an efect on pH drlved     from Soybean Seed Protein during 3 Days after Germination．

    （1）pH 4．0， 0min．（2）pH4．0，120min．（3）pH 5．5， 0min．（4）pH 5．0，120min．

    （5）pH 6．0， 0min．（6）pH6．0，120min．（7）pH 7．2， 0mln．（8）pH7．2，120min．

     （9）pH8．0， 0min．（10）pH8．0，120min．（ll）pH9．0， 0min．（12）pH9．0，120min．

     （13）pH 8．0， add to glycinin， Omin．（14）pH8．0， add to glycinin，120min・

     （15）glycinin  （16＞conglycinin

発芽各時期における大豆種子蛋白質の自己分解に及ほすpHの影響

Et＾ 級T 畔ヴー一．ww噸「 ^蟹

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Fig．5 Gradient Slab Gel Electrophoresls Pattern of the Autolysis have an efect on pH drlved     from Soybean Seed Proteln durlng 5 Days after Germinatlon．

（1）pH 4．0，

（5）pH 6．0，

（9）pH 8．0，

（13）pH 8．0，

（15）conglyclnin

 Omln．（2）pH 4．0，120mln．（3）pH 5．0， 0min．（4）pH 5．0，

 Omln．（6）pH 6．0，120min，（7）pH 7．2， 0min．（8）pH 7．2，

 Omln．（10）pH 8．0，120min．（11）pH9．0， 0mln．（12）pH 9．0，

add to glyclnin， Omln．（14）pH80， add to glycinin，120mln．

    （16）glycinin

120min．

120min．

120mln

   L／s  い t  ，      き

灘灘灘議顯

      1234 56789茎Ol毒12】3i41516

Fig．6 Gradient Slab Gel Electrophoresis Pattern of the Autolysis have an efect on pH drlved     from Soybean Seed Protein during 7 Days after Germination・

（1）pH 4．0，

（5）pH6．0，

（9）pH 8．0，

（13）pH 8．0，

（15）glycinin

 Omin．（2）pH 4．0，120min．（3）pH5，0， 0mln．（4）pH 5．0，

 Omin．（6）pH 6．0，120min．（7）pH 7，2， 0min．（8）pH 7．2，

 Omln．（10）pH8．0，120min．（11）pH9．0， 0min．（12）pH9．0，

add to glycinin， Omin．（14）pH8．0， add to glycinin，120min．

 （16）conglyclnln

120min。

120mln．

120mln．

（21）

宇高 京子・森永真希子

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Fig．7 SDS−Elect・・ph・・e・i・P・tt・・n・f th・A・t・ly・i・have an・fect・n pH 8・Odrlved f・・m     Soybean Seed Protein during Germination．

    （1）Od。y。ft，， g・・minati・n， Omi・．（2）Od・y・ft・・g・・minati・n・120mi・・（3）Od・y・fte「

    9，，mi。。ti・n，・dd t・gly・i・i・， Omi・．（4）Od・y・ft・・g・・mi・・ti・n・120mi・・（5）1d・y・fte「

    9，，mi。。ti。n， Omi・．（6）1d・y・ft・・g・・minati・n，120mi・・（7）・dd t・gly・i・i・・1d・y after germination， Omin．

after germination， O min．

add to glycinin， Omin．

after germination， O min．

tion， add to glycinin，0       min．

day after germination， O mln．

germination， add to glycinin，Omln．

（21）conglycinin  （22）glycinin

（8）add to glycinin，1day after germination，120 mln．（9）3days

（10）3days after germination，120min．（11）3days after germlnatlon，

（12）3days after germination， add to glycinin，120 min． （13）lday   （14）5days after germinatlon，120min．（15）5days after germma−

    （16）5days after germination， add to glycinin，120min．（17）1   °  （18）7days after germination，120 min． （19）7days after       ° （20）7days after germination， add to glycinin，120mm．

22

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t2 3 156 ：J 8 91 1隻三213重45151 i 18192°；12，2

Fig．8 Acetic Acid−Urea−Gel Electrophoresis Pettern of the Autolysis have an efect on pH 8．O     drived from Soybean Seed Protein during Germination．

（1）Oday after germlnatlon germination， add to glycinin，0 germination， O min．

germination， O min．

germination， O min．

to glycinin， O mln．

germination， O min．

to glycinin， O min．

germination， O min．

to glycinin， Omin．

（21）91ycinin

 ° ，Omin．（2）Oday after germination，120mln，

         min．（4＞Oday after germination，120min．

（6）1day after germination，120min．

（8）add to glycinin，1day after germinatlon，120min．

（10）3days after germination，120min．

（12）3days after germination， add to glycinin，120min，

（3）Oday after  （5）1day after

（7）add to glycinln，1day after

（9）3days after

（11）3days after germination， add

（13）5days after

（14）5days after germination，120min．（15）5days after germlnation， add

（16）5days after germination， add to glycinln，120min． （17）7days after

（18）7days after germination，120min．（19）7days after germination， add

②O）7days after germination， add to glycinin，120mln．

（22）conglycinln

発芽各時期における大豆種子蛋白質の自己分解に及ぼすpHの影響

3．実験結果と考察

 図1は発芽0日目におけるpHの影響を見たグラジエ ントスラブゲル電気泳動像である．図2は発芽1日目に おけるpHの影響を見たグラジエントスラブゲル電気泳 動像である．図3は発芽2日目におけるpHの影響を見 たグラジエントスラブゲル電気泳動像である．図4は発 芽3日目におけるpHの影響を見たグラジエントスラブ ゲル電気泳動像である．図5は発芽5日目におけるpH の影響を見たグラジエントスラブゲル電気泳動像である．

図6は発芽7日目におけるpHの影響を見たグラジエン トスラブゲル電気泳動像である。以上の結果を一覧表に まとめたのが，表1である．全体的にpH6．0〜pH8．0あ たりに大豆11S蛋白質（グリシニン）および大豆7S蛋 白質に影響を与えている．pH9．0では，大豆11Sおよび 7S蛋白質にわずかに影響を与えている．また， pH4．0 およびpH5．0においては，発芽各時期から得た大豆蛋白 質の自己分解像には影響を及ぼしていないことがわかっ た．発芽7日目においては，いずれのpHも影響を受け ていない．他の移動した位置に，すべての自己分解像が 得られている．図7は発芽各時期におけるpH8．0での影 響を見たSDSゲルカラム電気泳動像である．発芽各時 期より得た大豆蛋白質はpH8。0および，それに大豆11S 蛋白質分画区分を加えると，蛋白質の自己分解像に変動 を起こさせ影響を与えていることが見られた．図8は発 芽各時期から得た蛋白質のpH8．0での影響を見た酢酸酸

性尿素ゲル電気泳動像である．pH8．0および，それらに 大豆11S蛋白質分画区分を加えても，グリシニンには，

あまり顕著な影響を与えず，わずかな変動が見られた．

4．要  約

 発芽各時期から得た大豆種子蛋白質の自己分解はpH 6．0〜pH8．0あたりで発芽初期（1〜4日目）頃に11S蛋 白質および7S蛋白質の分解が起こり，発芽8日目前後 には，7S蛋白質は分解消失され認められなくなり，グ リシニンも段々と分解していくという結果が得られた．

5．文  献

1）宇高 京子；東京家政大学生活科学研究報告，13  （1990）

2）宇高 京子；東京家政大学研究紀要 第35集

 （1996）

3）宇高 京子；東京家政大学研究紀要 第36集

 （1995）

4）N．A．Yeboah，1（．Udaka et al；Protein Expres−

 sion Purif．，7，309−314（1996）

5）宇高 京子，川名 広子；東京家政大学研究紀要  第37集（1997）

6）森永真希子，宇高 京子；東京家政大学研究紀要  第38集（1998）

（23）