九州大学学術情報リポジトリ

(1)

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

脂質結合型疎水性ビタミンB_<12>を用いた新規二分子膜型人工酵素の構成と反応特異性に関する研究

小川, 晃弘

九州大学工学応化分子合成化学

https://doi.org/10.11501/3099873

出版情報：Kyushu University, 1994, 博士（工学）, 課程博士バージョン：

権利関係：

(2)

(3)

υ

脂質結合型疎水性ビタミン B ₁ ₂ を用いた新規二分子膜型人工酵素の構成と反応特異性に関する研究

平成 7 年 1 _月

小川晃弘

(4)

2 . 2 . 1 N

，

N ‑

ジヘキサデシjレ

̲ N a

‑t‑ブトキシカjレボニノレーしアラニンアミド 23

2 . 2 . 2 N

，

N ‑

ジヘキサデシル

̲ N a ‑ ( 6 ‑

ブロモヘキサノイノレ)ーしアラニンアミド24

2 . 2 . 3 N

，

N ‑

̲ N a‑ ( 6 ‑

トリメチノレアンモニオヘキサノイル) 25 ーL・アラニンアミド臭素酸塩

2 . 2 . 4 N

，

N ‑

̲ N a‑ ( 6 ‑

スjレホヘキサノイ jレ)ーしアラニン 26 アミドナトリウム塩

2.3 アスパラギン酸残基を含む二本鎖ペプチド脂質の合成 ²⁷

2 . 3 . 1 N

，

N ‑

̲ N a

‑t‑ブトキシカjレボニjレ‑0‑ベンジル 27

・L‑アスバルトアミド

2 . 3 . 2 .

N，N‑ジヘキサデシjレ‑N^に (6・プロモヘキサノイjレ)・0ペンジル 28 ーしアスバルトアミド

2 . 3 . 3 N

，

N ‑

‑N

仁 (6・トリメチjレアンモニオヘキサノイル) 29

‑0‑ペンジノレーしアスバルトアミド臭素酸塩

2 . 3 . 4 N

，

N

二ジヘキサデシjーレ

N a ̲ ( 6

国トリメチルアンモニオヘキサノイノレ) 30 ーしアスバルトアミド臭素酸塩

2 . 3 . 5 N

，N二ジヘキサデシル圃

N

^a^'

‑ ( 6 ‑

スルホヘキサノイノレ)ーしアスバルト 31 アミドナトリウム塩

2.4 総括 32

(5)

第

3

章疎水性ピタミン B12^類の合成 33 3.1 ジシアノコピリン酸ヘプタメチルエステノレ: 36

(CN)2Cob(III)7C1^{郎防}

3.2 コピリン酸ヘプタプロピルエステル類の合成 37 3.2.1 ジシアノコピリン酸ヘプタプロピルエステル: 37

(CN)2Cob(III)7 C₃ester

3.2.2 シアノアココピリン酸ヘプタプロピルエステノレ過塩素酸塩: 39 [(CN)(H20)Cob(III)7C₃ester]ClO 4

3.2.3 コピリン酸ヘプタプロピルエステル過塩素酸塩: 40 [Cob(II)7C₃ester]α0₄

3.3 10イ立を修飾した疎水性ピタミン B12^類の合成 42 3.3.1 ^{ジシアノコピリン酸}‑10・ニトロヘプタメチルエステル: 42

(CN)2Cob(III)(1 0・N02)7C1es^也r

3.3.2 ^{ジシアノコピリン酸}‑10‑ニトロヘプタプロピルエステル: 43 (CN)2Cob(III)(10・N02)7C₃ester

3.3.3 ^{ジシアノコピリン酸}‑10・アミノヘプタメチルエステル: 44 (CN)2Cob(III)(10・NH2)7C1ester

3.3.4 ^{ジシアノコピリン酸・}10・アミノヘプタプロピルエステル: 45 (CN)2Cob(III)(10・NH2)7C₃ester

3.3.5 ジシアノコピリン酸‑10・アセトアミドヘプタメチルエステル: 46 (CN)2Cob(Im(10^・Ac)7C1ester

3.4 総括 47

第4章疎水性ピタミン B12が結合した人工脂質の合成 49 4.1 新規カチオン性人工脂質の合成 53

11

(6)

4.1.1 ^{ジシアノコピリン酸・}¹⁰^‑^[N^，^N^‑^ジヘキ^サデシル^̲Na‑⁽⁶^'^‑^トリ 53

メチルアンモニオヘキサノイノレ)ーしアスバルトアミド臭素酸塩]

ヘプタメチルエステル:

(CN)2Cob(III)(10・N+C_SAsp2C16)7C1 ester

4.1.2 シアノアココピリン酸・10・[N，N‑ジヘキサデシjレーNa‑(6'‑トリ 56

メチルアンモニオヘキサノイル)ーしアスバルトアミド臭素酸塩]

ヘプタメチルエステル過塩素酸塩:

[(CN)(H20)Cob(III)( 1 0・N+C_SAsp2C16)7C1ester]CIO 4

4.1.3 ^{コピリン酸}^‑¹⁰^‑^[^N^，^N‑^{ジヘキサデシ}^j^レ^̲Na^‑⁽⁶^'^‑^{トリメチル} 58

アンモニオヘキサノイノレ)ーしアスバルトアミド臭素酸塩]ヘプタメチルエステル過塩素酸塩:

[Cob(II)(1 0‑N+C_SAsp2C16)7C1 ester]CIO 4

4.1.4 ^{ジシアノコピリン酸ー}¹⁰^‑^[^N^，^N‑^{ジヘキサデシルー}^Na‑⁽⁶^'^‑^トリ 60

ヘプタプロピルエステル:

(CN)2Cob(III)(10・N+C_SAsp2C16)7C3ester

4.1.5 シアノアココピリン酸ー10‑[N，N‑ジヘキサデシノレ̲Na‑(6'ートリ 62

ヘプタプロピルエステル過塩素酸塩:

[( CN)(H20 )Co b(III) ( 1 0・N+C_SAsp2C16)7C3ester]CIO4

4.1.6 ^{コピリン酸・}10・[N，N‑ジヘキサデシル̲Na‑(6'‑トリメチル 62

アンモニオヘキサノイル)ーしアスバルトアミド臭素酸塩]ヘプタプロピルエステル過塩素酸塩:

[Cob(II) (1 0・N+C_SAsp2C16)7C3ester] CIO 4

4.2 新規アニオン性人工脂質の合成 63 4.2.1 ^{ジシアノコピリン酸}^‑¹⁰^‑^[^N^，^N‑^{ジヘキサデシル}^‑Na‑⁽⁶^'^‑^スルホ 63

ヘキサノイル)・しアスバルトアミドナトリウム塩]ヘプタメチルエステル:

(CN)2Cob(III){ 10‑(S03一)C_SAsp2C16}7C1 ester

(7)

4.2.2 ^{シアノアココピリン酸}‑10‑[N，N‑ジヘキサデシルーNa‑(6'‑スルホ 66 ヘキサノイノレ)ーしアスバルトアミドナトリウム塩]ヘプタメチル

エステル過塩素酸塩;

[(CN)(H20)Cob(III) {1 0‑(S03一)C_SAsp2C₁_6}7C₁ester]CI0₄

4.2.3 ^{コピリン酸}‑10‑[N，N‑ジヘキサデシル̲Na‑(6'‑スルホヘキサ 68 ノイル)ーしアスバルトアミドナトリウム塩]ヘプタメチルエステル過塩素酸塩:

[Cob(II) { 10・(S03一)C_SAsp2C₁₆₎7C₁ester]CI04

4.2.4 ^{ジシアノコピリン酸}‑10‑[N，N‑ジヘキサデシル‑Nσー(6'‑スルホ 70 ヘキサノイノレ)‑L‑アスバルトアミドナトリウム塩]ヘプタプロピル

エステル:

(CN)2Cob(III) { 10‑(S03一)C_SAsp2C₁_6}7C3ester

4.2.5 ^{シアノアココピリン酸}‑10‑[N，N‑ジヘキサデシル̲Na‑(6'‑スルホ 72 ヘキサノイル)・L‑アスバルトアミドナトリウム塩]ヘプタプロピル

エステル過塩素酸塩:

[(CN)(H20)Cob(III) { 10‑(S03一)C_SAsp2C₁_6}7C3ester]CI0₄

4.2.6 コピリン酸‑10‑[N，N‑ジヘキサデシル‑N仁 (6'‑スルホヘキサ 72 ノイル)ーしアスバルトアミドナトリウム塩]ヘプタプロピル

エステル過塩素酸塩:

[Cob(II) { 10‑(S03一)C_SAsp2C₁_6}7C3ester]CI0₄

4.3 総括 73

第5章ピタミン

B

₁₂人工脂質と合成二分子膜ベシクルの相互作用 74

5.1 実験の部 74

a) 試薬類 74

b) 試料の調整 76

5.2 示差走査熱畳分析 78

5.3 動的光散乱 85

lV

(8)

5.4 電子顕微鏡観察 91

5.5 ^{総括} 93

第 6章ピタミン B₁₂人工脂質とペプチド脂質からなる二分子膜型人工 95 酵素による炭素骨格組み替え反応

6.1 これまでの二分子膜型人工酵素系における研究成果 96 6.2 メチルマロニルー

CoA

ムターゼ型モデル反応 102

6.2.1 実験の部 102

a) 試薬類 102

b) 基質及び標品の合成 102

c )

アルキル錯体の合成 105

d )

測定方法 114

6.2.2 ピタミン B₁₂カチオン性人工脂質とペプチド脂質からなる 115 超分子系による異性化反応

6.2.3 臭化物生成機構の解明 117

a) 試薬類 117

b) 試料の調整 117

c ) GC‑MS

スペクトル 118

d ) ESR

スノ〈クトノレ 118

6.2.4 反応機構 122

6.2.5 ピタミン

B

₁₂アニオン性人工脂質とペプチド脂質からなる 124 超分子系による異性化反応

(9)

6.2.6 考察 126 6.3 ^αーメチレングルタル酸ムターゼ型モデル反応、 127

6.3.1 実験の部 127

a) 試薬類 127

b) 基質及び標品の合成 127

c) アルキル錯体の合成 135

d) 測定方法 141

e) 反応結果 143

6.3.2 シアンイオン添加系 144

a) 測定方法 144

b) 反応結果 145

c) 電子スペクトル 146

d) ESRスペクトル 148

6.3.3 反応機構 151

6.3.4 考察 153

6.4 アミノ酸誘導体の炭素骨格組み替え反応 154

6.4.1 実験の部 154

a) 試薬類 154

b) 基質及ぴ標品の合成 154

c) アノレキル錯体の合成 158

Vl

(10)

d) 測定方法

6.4.2 結果と考察 6.5 総括

第7章新規二分子膜型ピタミン B₁₂^{人工酵素の反応場特性}

7.1 実験の部 a) 試薬類

b) 試料の調整

7.2 電子スペクトノレによるミクロ極性の評価

7.3 示差走査熱量分析

7.4 蛍光偏光度によるミクロ粘度の評価 7.4.1 蛍光プロープの合成

7.4.2 反応場のミクロ粘度の評価 7.5 総括

第

8

章結言

参考文献

謝辞

162 164 168 170 170 170 173 175 179 183 184 185 189 191 195

(11)

第 l 章緒言

生体内で起っている現象は非常に複雑で，多様性に富み，エネルギーおよび物質変換の効率が著しく高い。この多様性，高効率性は人類による技術によっては到底，

達成不可能なものであった。しかし，生体物質の個々の機能の解明は近年の基礎生化学を中心とした関連領域の研究成果により大きく前進し，生体機能に対する理解は著しく深まってきた。他方，有機化学，無機化学，錯体化学，高分子化学などの進歩も著しいものがあり，化学者が望む機能を持つ化合物を分子設計し，合成することが可能となってきた。これら二大分野を有機的に結びつけ生まれた学聞がバイオミメティックケミストリーすなわち生体機能の化学である。この分野の化学は単に生体機能の模倣ではなく，生体に学ぶことから出発して，最終的には生体機能を化学的にしかも分子レベルで解明し，生体機能より優れた機能を持つものを生み出すことを目的としている。バイオミメティックケミストリーは生物無機化学，生物有機化学を中心とし，方法論として生物物理化学が加わって現在大きく発展している。なかでも生体系における遷移金属錯体の構造・機能の研究を中心とした生物無機化学は近年急速に発展してきた分野である1)。

生体機能には酵素の触媒作用細胞膜による区画形成，生体膜を介しての物質移動，核酸による情報伝達，あるいは糖類，ペプチドその他の生理活性物質を含むこれらの生体物質の集合系として発現する機能などがある。このうち酵素は物質代謝機能を司る生体触媒であり，常温常圧， pH中性の水溶液系という極めて温和な条件下で高活性，高選択性を発現するという点で省エネルギー的な優れた触媒であるといえる。なかでも，酵素のもつ高度な反応特異性，基質特異性，立体特異性は最近の精密化学の発展に伴い，基礎化学分野のみならず，医薬化学方面からもその重要性が認識されつつある2)。

酵素は構造的にはタンパク質であり，そのもの自体が触媒機能を主体的に示す場合と，複合タンパク質(ホロ酵素)としてアポ酵素と呼ばれるタンパク質部分と，

低分子化合物である補酵素とからなる場合とがある3)。この補酵素にはしばしばCr， Mn， Fe， Co， Cu，

z n

などの微量必須金属イオンが取り込まれており，また一方，

金属イオン自身が補欠要素の役割を演じることも多く，このような酵素を通常金属酵素と呼んでいる4)。補酵素の大部分はピタミン類であり，本来これら補酵素と基質

(12)

の問である程度は起りうる反応が，アポ酵素と補酵素の協同によってけた違いに高い速度で，特異的に，能率的に進行する。さらに，本質的には酵素タンパク質だけでも触媒となる反応，つまり酵素の活性中心の官能基と基質の問で起る比較的単純な反応が補酵素の介在によって極めて多彩なものになり，また非常に円滑に進行する。しかし，本質的には補酵素が触媒活性の中心となり，タンパク質官能基が関与することにより基質の反応の方向性を多様化しているともいえる1)。本論文で取り上げたピタミン B₁₂類もこのような補酵素であって，生体には必要不可欠なビタミン類である。

ピタミン B₁₂は金属イオンとしてコバルトを有しており，発見の当初から現在に至るまでその複雑な構造と重要な生理活性により広範な分野の研究者の注目を集め

てきたの。ピタミン B₁₂は1948年にSmi出ら6)および、Folkers7)らによって肝臓中の抗悪性貧血因子として発見され， 1958年にB訂kerらによって光に不安定な補酵素型が発見

された8)。次いで，ピタミン B₁₂およびその補酵素型の構造がHodgkinらのX線結品構造解析により決定され9)，コリン環の部分のみでも不斉炭素を 9個も含むネ鯨住極まる構造は有機合成化学上最大のターゲットとなり， 1972年にはWoodward， Eschen moserらによる全合成が達成された10)。現在では，補酵素として生化学反応を司どる触媒メカニズムの解明に研究の重点は移っている。

ピタミン B₁₂類は，自然界では他に類例をみないコバルトー炭素 (Co‑C)シグマ結合を有する有機金属錯体であり，図 1. 1に示すように，その基本構造はコリン環と呼ばれるテトラピロール環状配位子がコバルトに配位した錯体である。コリンはヘム鉄の配位子であるポルフイリンとは異なるモノアニオン性の配位子であり，

A， D両ピロール環が直結しているため平面からの歪みも大きい。また，コリン環周辺位の 7個の酸アミド基のうち，アセトアミド基は s‑配位面に，プロピオンアミ

ド基は十配位面へ向いている。通常ピタミン

B

₁₂補酵素と呼ばれるアデノシルコパラミンは，十配位面側の配位子としてリン酸，リボース，5，6‑ジメチルベンツイミダゾールから成るヌクレオチド部を有し，

s ‑

配位面側の配位子としてグーデオキシアデノシル基を持ち，しかもその5'‑位の炭素とコバルトがシグマ結合しているという有機金属的特徴を備えている。

(13)

H₂NOC

し=

し=Me し =CN

H

アデノシルコバラミン

NH₂

メチルコバラミンシアノコバラミン

図1.1 ビタミン B₁₂類の構造

‑3‑

(14)

表 1. 1 ピタミン B₁₂が関与する酵素反応形式¹¹⁾

酵素反応形式転移基

CH3CH(OH)CH20H^{一一 +} Dioldehydrase

CH3CH2CHO + H20 OH

CH2(OH)CH(OH)CH20H^{一一 +} Glyceloldehydrase

CH2CH(OH)2CHO + H20 OH

Ethalamine CH2(NH2)_CH20H ^ー^ー^ー^ー^ー^ー^ー^ー^ー

deaminase CH3CHO + NH3 NH2

Ribonucleotide R(SH)2 + GPT ^{一ーー‑ーー} reductase R(S2) + dGPT + H20 Methylmalony卜 H02CCH(CH3)COSCoA三二三

COSCoA CoA mutase H02CCH2CH2COSCoA

Glutamate H02C(CH2)2CH(NH3 +)C02H 二二三

mutase H O2 C C H (C H 3) C H (N H 3+ ) C O2 H CH(NH3+)C~H

α‑methylene‑ H02C(CH2)2C= CH2( C O2 H) 二二三

C = CH2(C~H)

glutamate mutase H02C(CH3) C=CH 2( C 02H)

しβLysine H3~CH2(CH2)2CH(NH3+)CH2C~ ‑ ^ー4^ー・^ー一^ー一^ー.ー一一^.^.

aminomutase CH3CH(NH3 + )CH2CH(NH3 +)CH2C02‑ NH2 D‑a‑Lysine H3N+ _CH2(CH2)3CH(NH 3+) C~- ^ー4^ート一一一^ー^ー^一^事^ー

aminomutase CH3CH(NH3 +) (CH2)2CH(NH3 + _)CH2C~‑ NH2 Ornithine H3~CH2(CH2)2CH(NH3+)C02 ‑ .. ^ー^一^一ー^ーー^ーー^̲ーー^̲ー^̲^.

aminomutase CH3CH(NH3+)CH2CH(NH3+)CH2C02ー NH2 Leucine 2，3・， CH3CH(CH3)CH2CH(NH2)COOH 三二三

aminomutase CH3CH(CH3)CH(NH2)COOH NH2

Methane 還元剤_(H2)

synthethase ^C¹^ー~CH4 (ATP， H2'

"Coenzyme M")

Methylarsane ATP， H2，

synthethase ^C1^ー~AsH3-n(CH3)n "Coenzyme M"(?)

Acetate C₁+C02 ^一^~ CH3C02 還元剤

synthethase

Methionine 5‑CH3‑THFA + Homocysteine^{ー +} Adenosylme‑

synthethase THFA + Methionine Thionine

‑4‑

(15)

生体内においてピタミン B₁₂類はアデノシルコパラミンとメチルコパラミンの 2

種類の補酵素型として存在し前者は隣接炭素原子上の官能基と水素原子の交換を伴う酵素反応に，後者はメチオニン合成などにおけるメチル基移動を伴う酵素反応

に，それぞれ関与している(表 1. 1 ) 11)。前者のアデノシルコバラミンの関与する 11種類の異性化反応は， ( 1)炭素骨格の組み替えを伴なう反応， (2)水またはア

ンモニアの脱離を伴う反応， (3) アミノ基の分子内転位反応の3つに分類される。

表 1. 1にあげた水素移動を伴う反応のっち，リボヌクレオチドリダクターゼ以外の 10種類の酵素反応はいずれも式 1. 1に示すように，官能基Xが隣接炭素上の水素と交換，転位するという共通の側面を持っている。

H i n v l x L

C i

H X

I I

‑ C

¹

‑C

^2‑

I I

( 1 . 1 )

アデノシルコバラミンの反応機構に関しては (2) に属するジオールデヒドラーゼならびにアンモニアリアーゼに関する石汗究をもとに，図 1.2に示すようなラジカル反応機構により進行するという考え方が最も有力である12)。すなわち，基質の酵素内への取り込みにより活性化されたアデノシルコパラミンのコバルト ‑ 炭素結合のホモリシスによりアデノシルラジカルが生じ基質から水素原子を引き抜き基質ラジカルとグーデオキシアデノシンが生成する。基質ラジカルは生成物ラジカルへ転位した後， 5'・デオキシアデノシンから水素原子を引き抜いて生成物とアデノシルラ

ジカルが生じ，後者はコバラミンと再結合してアデノシルコバラミンを再生するという考え方である。

これに対して， Schrauzerら13)および、Coreyら14)は酵素反応中にCo‑C結合がヘテロリシスを起すという仮定のもとにそれぞれ独自の機構を提案しているが，これらを支持する実験的証拠が酵素系からは得られておらず，一般に受け入れられるに至っていない。ラジカル機構説については， Dolphin‑Abelesのπ錯体経由機構15)，Finke， Goldingらの結合型ラジカル機構16)等が提案されているが，ジオールデヒドラーゼに関する一連の研究結果を比較的よく説明できる結合型ラジカル機構を支持するものが近年大勢を占めているようである。しかしながら，官能基転位の機構についての

(16)

ロH2

UU PU

‑

S

^剖^H ^〆

_~S~九CH

^つ^荊^{R ‑ ‑}

/ ^巨 / / y S.

^C^ω^ト^H

( / ，， ^[ ^戸向 ^C ^向 ⁶ 白 ^向 (l 』司

^O

「 ^¥ ^》 ^[ ^戸 ^ω ^向 ^句 ^C ^向

^O

^付 γ i

^》

R C ^H

2

E +

[ C o ] ‑‑

¹^，²^‑^転位

...，・

ノ PH / '

E' • CHフR

三 E .

CH~R

" ' [ C o ] ‑

~[ëo]

‑

R‑CH_2‑， 5'‑デオキシアデノシル基 ;[Co] ，コパラミン;

E，アポ酵素;SH，基質;PH，生成物図1.2 アデノシルコパラミンの作用機構

酵素的データが無いことから推測の域を出ておらず，完全な定説とはなっていない。一方アデノシルコパラミン依存性酵素の初期反応である， Co‑C結合の活性化については， Co‑C結合の開裂反応に関する動力学的研究17‑19)，X線結品構造解析によるCo‑c結合距離および結合角の相関関係に関する研究2031)，分子軌道計算による理論的研究22^・24)，レーザーフラッシュフォトリシスによるco‑c結合の開裂反応に関するナノ秒，ピコ秒オーダーでの動力学的研究など25‑27)がある。 Hodgkinらは

X

線結晶構造解析からアキシアル配位塩基である5，6‑ジメチルベンツイミダゾリノレ基が，

コリン環の立体構造に影響を及ぼすことを明らかにしている28)。

また， Hogenkampらはポーラログラフ法による研究から，アキシアル配位子の電子供与性によってコバルトの電子的性質が著しく変化することを立証している29)。これらの結果から， α‑配位面側の窒素塩基配位子とコバルトとの結合が， CO‑C結合の安定'性に影響を与えていることが示唆される。以前より，コリン環の構造変化によるCo‑c結合の活性化の機構が提案されてきたが30‑32)，近年，このようなコリン環の構造変化について，フーリエ変換技術の進歩により，ピタミン B₁₂類の異核

‑6‑

(17)

種NM R，2次元N MR33)，近赤外ラマンスペクトル34)，EX A F S35)，X A N E S 36)等による測定にもとづいた検討が行われており，溶液中での構造と結晶構造の聞に大きな変化がない事が示された。一方虎谷らは，下方配位塩基の種類やスペーサ一部分の長さの異なるピタミン B₁₂類を種々合成し，その酵素活性について検討

している37)。その結果，アボタンパク中にはアデノシル基に特異的な結合部位が存在し，さらにビタミン B₁₂のアミド周辺置換基とアボタンパクとの間の強固な相互作用によるコリン環の折れ曲がりによってCo‑C結合が活性化されていることを示唆している。 Brownらも配位塩基の立体的な効果の重要性を指摘している38)。さらにFinkeらは反結合性のCo‑C結合の LUMOへの 1電子移動により，Co‑C結合が弱くなることを示したが，酵素系ではその様な可能性は低いと述べている39)。また最近， Krautlerらはコリン環下方部分の立体的かさばりが小さいシアノイミダゾール

コパミドを合成し，補酵素 B₁₂と結晶構造を比較することにより下方配位子の立体的なかさ高さがコリン環の歪みに寄与していることを直接的な証拠として報告している40)。以上のように， Co‑C結合の活性化は主にアボタンパクと補酵素 B₁₂との立体的な相互作用によるコリン環の折れ曲がりが重要であると考えられているが，

その一方でコリン環の変化は無関係であるという説もある³⁵，41)。このように，酵素反応におけるCo‑C結合および基質の活性化ならびに，官能基の転位に関する機構

は推定の域を出ず，現在もなおモデル系を含め多くの研究が展開されている。表 1. 1に示した炭素骨格組み替え反応を含む異性化反応は，これまでの有機化学や有機金属化学では見出されていない反応を含んでおり，有機合成化学的な観点からも興味深いものである。これらのなかでメチルマロニルーCoAムターゼ，グルタミン酸ムターゼ，トメチレングルタル酸ムターゼの 3種類の反応はK+，Mg²+など別の共同因子を必要としないこと等から最も注目されている。酵素系において E S RによりメチルマロニノレーCoAムターゼ42)，グルタミン酸ムターゼ43a)，αーメチレングルタル酸ムターゼ43b)についてそれぞれラジカル種が検出されている事から，これらの反応においてはラジカル中間体が関与しているという可能性が濃厚になっている。

また，モデル反応ばかりでなく，量子化学計算による転位機構の検討44‑47)も行われているが，エネルギー的にはラジカル転位46)，アニオン転位47)のいずれも可能であり，実験的裏付けが求められている。

メチルマロニjレーCoAムターゼの反応に関連した非酵素系におけるモデル反応とし

‑7一

(18)

ては，ピタミン B₁₂あるいはそのモデル錯体を求核性の高い Co(I)状態に還元し，

基質として相当するハロゲン化アルキルを反応させることによりアルキル錯体を生成させ，このものから生成物を得るという手法が一般的によく行われている48^・53)

。

Dowdらは，コバラミン [Co(I)]錯体とハロゲン化アルキルを反応させることによりアルキル錯体を生成させ温和な条件下で放置するだけで，低収率ではあるが転位生成物が得られることを示している(式 1. 2 )48)

。

H C O^司Me H C O門H ̲COっH

〆∞:‑×

^f ^っ^Me ^Me

^H+

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0 0

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C/￨￨¥Cψ

( 1 . 2 )

また，

s

∞抗らはモノチオエステル誘導体を基質として用いることにより，モデル反応系においても転位する官能基はエステル基ではなく，酵素反応と同じくチオエステル基であり，転位反応はラジカル的に進行していることを提案している

(式1.

3 )

49)

。

判断 M X : : t ‑ J t ‑ M て

⁰²^B ₍₁_.₃₎

しかしながら， Schrauzerらは式 1.3と同じモノチオエステル誘導体の基質を用いて種々の条件下で反応を行い，還元剤存在下でのみ高収率で異性化生成物が得られることおよびその動力学についての測定結果から，アルキjレ錯体のヘテロリシス関裂により生成するカルボアニオン中間体を経由して転位反応が起ることを提案している(式 1. 4 ⁾⁵⁰⁾

。

(19)

また，多田らはピタミン B₁₂のモデル錯体であるコバロキシムを用いて，アルキルコパロキシムを光照射することによっても同様な転位反応が進行することを報告

している(式1. 5 )51)

。

Me̲ COSEt

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，

/COSEt yCOSEt y P h

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L

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、Ph 'COSEt

ん

^60% ^8% ^11%

以上のピタミン B₁₂およびモデル錯体を用いた反応とは異なり，Halpernらはピタミン B₁₂の存在なしにn‑Bu3SnHを用いて相当する基質ラジカルを発生させ，少量の転位生成物を得ている(式 1. 6 )54)

。

M ( < : ご

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Me̲ COSEt n‑Bu‑:lSnH ^IVIC，‑/

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Me̲̲. ^/C O2 Et Me̲̲.ノ^{C 0}2Et

y

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y

‑冒

. 、、

COSEt COSEt

90/0

( 1 . 6 )

またナトリウムナフタレニドを用いてカルパニオンを発生させた場合，転位生成物の収率は飛躍的に増大するが，チオエステル基ばかりでなくエステル基の転位も起り，転位が選択的ではないことに注目し(式 1. 7 )，カルパニオン生成の困難さや，

酵素反応では転位する基質の選択性が高いこと等から，補酵素 B₁₂は可逆なフリーラジカル運搬体としてのみ働き，転位反応、自体には関与しないといっフリーラジカルキャリアー機構を提案している⁵⁴⁾

。

0% 42% 4%

これに対してDowdらは分子内にラジカルトラップ基としてペンテニル側鎖を有す

‑9‑

(20)

る基質を用いた場合には， n‑Bu3SnHを用いて発生させたラジカル種は速やかに 6員環に閉環し，異性化生成物は得られなかったがjピタミン B₁₂_sで処理した場合にはチオエステル基が転位した異性化生成物が主生成物として得られることを見出した

(式1. 8 )55a)

。

~~~/COSEt

、

^{/ V V} ^Vⁱ^t^a^mⁱⁿ⁸¹²⁵

( 'C02日 MeOH 8r

い戸て日いィツ < c o s : t

40‑600/0

+パメ : ; t

⁽¹^.⁸⁾

さらに彼らは，ナトリウムナフタレニドを用いてカルパニオンを経由した異性化反応の場合には，チオエステル基が転位した異性化生成物とエステル基が転位した異性化生成物が

1: 1

の割合で得られていることから(式

1. 9 )

，異性化反応はラジ

カル反応ではなくコバルトが関与したカルバニオン経由の反応であることを示唆している。

50%

+ 仏ぺ (

¹^.⁹⁾

Eヨ

Q U E m

﹄

0 0

c c

/ l l B

︑ ︑

⁺

M 一a‑

川 F一_M一一F﹁一

H

H一

一丁

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‑

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y ﹃

‑

C一

いぺ

²^E^t

また，その後彼らはメチルチオマロネート基を有する基質を用いてアルキル錯体を合成し，これを用いて異性化反応を行い，活性化されていない炭素からの水素の引き抜きと置換基転位が同時に起ることを見いだしている(式1. 1

0

⁾⁵⁵^b⁾。

55⁰C H₂0

COSEt

EtO~、^、tI"Av

^

X ^，^C^C^h^白 +

I / C O今日

CH3 ^， ^h

γ : : : ^り ^く ^: ^: ^:

41% ^50%

( 1 . 1 0)

+ : こいつく : : :

9%

(21)

この反応をCH₃0D中で行った結果，得られた生成物の重水素の位置から転位の最終段階でカルバニオンが関与していることが示唆され，ラジカル経路に加えて第二の中間体としてカルパニオンが生成するラジカルと電子移動段階の組み合わせも考

D

Et~C ，人^ ~C Ü2 B EtSOC'

。

1. H• 3 ^f'CⁱH3 ^{六一C O}2日

37%

+

(式 1. 1 1)

。

COSEt EtQzC入人 ^_{~C Ü2日}

/ 1.. ^， ⁽^'~_ C O₂^日 O CH3 CH3

25~も

えられることを指摘している

: : : 二口出

+

酵素反応ではCo‑C結合が開裂しでも，異性化反応が完結するまでは基質は活性部位近傍に存在すると考えられることから， R

ゐ

yらは基質をコバルトの近傍位に固

定化したモデル錯体を考案し，高収率 (82~95%) で異性化生成物を得ている

( 1 . 1 2)

︐g

︑ 円

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ぴ・CH2' 0 ぴ CH2'0

¥r[rC‑o̲III¥' / (II)] I ¥r'[rC‑o̲III¥' / (II)]

hv

‑‑‑‑t・・

(式 1. 1 2 )56)

。

O. Me I .0

冷'十C~

0' CH₂b

¥r_[r_C‑_o

J

₍_I_I^IlIn_I₎_]

I

α・メチレングルタル酸ムターゼ5761)，

様なモデル反応、に関する研究が展開されているが，以上の報告例からもわかるようグルタミン酸ムターゼ62・64)に関しでも同

さらにコバルトアニオン中間体のいずれを経由するか，

に，転位段階でラジカル，

が関与するか否かについては決定的証拠がなく，依然として未解明のままである。

ピタミン

B

₁₂依存性酵素反応の機構解明のために補酵素のモデル錯体が数多く合その物理化学的挙動ならびに反応性に関する研究が行われている。モデル

この中でコパロキシムと呼ばれる [Co(DH)2]は合成が容易であり，ピタミン B₁₂類似の反応性を示すことから最もよく用いられているの)。

その構造や酸化還元挙動は天然のピタミン B₁₂とはかなり異なっており，

モデル錯体としての有用性には限界があると思われる。

成され，

錯体の代表例を図

1.3

に示す。

しかし，

ポルフィリンのコノてまた

ピタミン B₁₂モデルとしての可能性が検討されたが，

‑11‑

ルト錯体[Co(tpp)]についても，

(22)

...H、、O

0 1 ^{寸 +}

: 〈〉〈〉 (

Me N l M e Me

。、、H...O

o

_、_ト_.₍_'₀

Co(DHb

Co{(DO)(DOH)PN}

Me. Me

Co(BAE)

Co([14]aneN₄)

日þ~oy _」 _、日 t t y

Co(SALEN)

。

Co(SALOPH)

Co(BDHC) Co(tpp)

図1.3 代表的なピタミン B₁₂モデル錯体

(23)

その電子状態はピタミン B12とは著しく異なることが判明している66)。

これに対して，村上らによって開発された [Co(BDHC)]は，電子的諸性質がコリノイド錯体と類似しておりピタミン B12モデル錯体として優れているものの，その C‑19位のアンギュラーメチル基の立体障害により，異性化反応の触媒とならないこ

とが明らかになっている67)。したがって，触媒反応を取り扱う場合には適当なモデル錯体の合成が必要と判断される。

ところで最近，ピタミン

B

₁₂類およびそのモデル化合物を酵素モデル反応のみならず，有機合成反応、の触媒として用いる試みが数多くなされている⁶⁸^・⁸⁴⁾⁰^F^おc凶らはコバルト l価種のコパラミンを触媒とした，ニトリル， α，s‑不飽和カルボニル化合物，オレフイン，アルデヒド誘導体等の還元反応について検討を行っている68‑70)。また， Scheffoldらはヒドソキソコパラミンもしくはそのモデル錯体による定電位電解反応について検討しており，これらを用いてブロモアセタール類の環化反応に成功している(式 1. 1 3 )84)。

Br ^{戸﹄}

S F ) 剖sa一Y‑

I 2 . 間四

i・

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E 1

L ρ ヶ

L 昨(f

⁺

また，彼らは生理活性物質の合成反応にもコパラミンを利用しており，例えばプロスタグランジン合成における中間体の合成(式 1. 1 4 )78)， N‑アシルシクロアルケニルアミンの合成(式 1. 1 5 )85)などが挙げられる。

m h ' O

EtO

B₁_2a

( 1 . 1 4)

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electrolysis

・1.9V vs.SCE

‑ 11 C_SH11

1 1

。

‑13‑

(24)

N

人。

(CH B_12a

祖国・

人。

ρ

(1.15)

さらに彼らは，エナンチオ選択的な反応を検討するために，図 1. 4に示したようなモデル錯体を新たに合成し， 1，4‑エピペルオキシドのヒドロキシシクロアルケノンへの異性化反応(式 1. 1 6) においてエナンチオ選択的な触媒として作用すること

を示している86)

。

①

(R，R)切 talyst Vitamin C， MeOH

。

( 1 . 1 6)

O H

図1.4 キラルなビタミン B₁₂モデル錯体

一方，村上らは疎水性ピタミン B₁₂類を用いた定電位電解反応について，その反応機構等に関しでも詳細に検討しており⁸⁷⁾ シアノ，エステルアシル基等の電子吸引性置換基を導入したハロゲン化アルキルを基質として用いた場合に，分子内官

(25)

能基転位反応か効率よく進行することを見出した87)。この結果を有機合成に応用して環拡大反応にも成功している (式1. 1 7 )87d)。

0

11 r ‑8r

( 、が C0

2

C 戸

Electrolysis

UH

n J

﹄

c

nζ

o c

o

( 1 . 1 7) Cobester

・2.0V VS. SCE

このようにピタミン B₁₂類やそのモデル錯体による種々の触媒反応が報告されており，今後一層の発展が期待される。以上に述べたモデル反応はすべて均一系での研究成果であり，酵素系を意識した研究とはいえない。先に述べたように，酵素系では補酵素ピタミン B₁₂はアポ酵素が構成する水分子の存在が極度に制限された疎水的ミクロ環境に位置していると考えられている。このような条件下において，酵素反応で生成してくる反応中間体(ラジカル，アニオン等)に対してアポ酵素は疎水性場を構成し，脱溶媒和，ミクロ環境効果により安定化に寄与しているものと推察される。従って，生体内での酵素反応を再現し，より精巧なモデル系を構築するためにはアポ酵素機能に焦点をあてた研究を行うことが必要であると考えられる。

アポ酵素のモデルとしては機能性高分子，大環状化合物，界面活性剤などが挙げられるが，このうち界面活性剤が水中で形成する分子集合体は生体膜類似の機能を発現することからアポ酵素モデルとしての利用度が高まっている⁸⁸^‑⁸⁹⁾。分子集合体

はその構成成分を水中に分散するだけで分子聞の疎水性相互作用によって自発的に形成される点で環状化合物に比べて化学合成が容易であり，さらに疎水性基質を取り込むにも好都合である。分子集合体の中でも二分子膜は非常に配向性の優れた機能性分子集合体であり，アポ酵素モデルとして多用されている90)。通常は天然の脂質を用いて二分子膜を形成する方が簡単であるが，天然脂質が形成する二分子膜は光や熱に弱く，化学的安定性は極めて乏しい。従ってこのような欠点を補うために，

村上らは合成脂質の開発を行い，これらの脂質分子が水中で安定な二分子膜を形成することを明らかにしている91)。しかも村上らが開発した合成脂質は主鎖にアミノ酸残基を導入していることから水素結合の作用因子が加わり，特に超音波照射により単一膜ベシクルを形成した場合にその特徴が顕著に現れている。すなわち水素結合帯が存在するために天然の膜と比較して極めて化学的安定性に優れているという

‑15‑

(26)

ことである。

アポ酵素のモデル化と同時に補酵素のモデルイヒも必要である。 Fendlerらはアポ酵素を意識したモデル研究を行うために，アニオン性のミセル中に天然のピタミン B₁₂を取り込ませようとしたが，ピタミン B₁₂が水溶性であるためにミセル表面上

にしか固定化できず，有用な知見は得られていない⁹²⁾。従ってアポ酵素モデルが構築する疎水性場にピタミン B₁₂を取り込ませるためにはピタミン _B₁₂を疎水的に修飾する必要がある。 Eschenmoserらは天然のピタミン B₁₂の7つのアミド周辺置換基

をすべてメチルエステル基に変換した疎水性ピタミン ^B₁₂を合成している⁹³⁾。村上らはコリン環周辺置換基のエステル基がすべてプロピルエステルよりも大きい修飾体のみが二分子膜中に取り込まれることを示し，これらのアポ酵素モデルと補酵素モデルを組み合わせて人工ホロ酵素を構築することにより異性化反応が極めて効率

よく進行することを見いだしている(式 1. 1 8 ⁾⁹⁴^・⁹⁶⁾。

Ma .COMe

(

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(' Col(lll)、 <[H3 /(CHi1ρH3

己叫 J 附亡

^CH2)iN

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¹_3CH3

二分子膜

: x : : ペケて

C;02ロ C ;

^C ^J

UMe

^f

( 1 . 1 8)

二分子膜中による疎水性ピタミン B₁₂の取り込み能は疎水性錯体の水に対する難溶性度であることが示されている⁹⁶^a⁾。しかしこの場合，疎水性ピタミン B12は非共有結合的に固定化されているにすぎない。このような点を考慮して，本研究では第一に疎水性ピタミン B₁₂の固定化部位のミクロ環境極性を下げることを目的としてペプチド脂質に共有結合により疎水性ピタミン B₁₂を導入した新規ピタミン B₁₂人工脂質を分子設計し，これを合成した。第二に異性化反応が進行する要因の一つに

ピタミン B₁₂の分子運動の抑制効果が挙げられるため，共有結合的な固定化によりさらに分子運動の抑制効果が増大し，異性化反応の効率も増大することを期待して新規ピタミン _B₁₂人工脂質を用いた人工ホロ酵素による異性化反応について検討し

た。さらに反応場特性について疎水性ピタミン B₁₂が非共有結合的に合成二分子膜に取り込まれた場合と比較検討した。

本論文はこれらの成果をまとめたもので，1編 8章からなっている。

第2章では，本研究で用いたアラニン残基およびアスパラギン酸残基を有するペ

(27)

R02G

QH3

QH3 、 R02C~;;;

~C02R H

R02C' H3C

H

/ ^~、~ ，

C02R

CH3 H3C

NH

C==o

CHっ

〈 C02R

I ‑ '

/

^(CH

^山

^CH3

X(CH2)5ÇNHCHÇN~

ll¥ ^附

^Y

X=(CH3)3N+， Y=Br‑， R=CH3 : (CN)2Cob(III)(10‑N+CsAsp2C16)7Clester X=(CH3)3N+

，

^Y=Br‑

，

_R=C3H₇: (CN)2Cob(III)(10‑N+CsAsp2C16)7C3ester X=(S03

一 ) ，

Y =N

a

， +

_R=CH3_:₍_C_N₎₂_C_o_b₍_I_I_I₎_{₁_0‑(S03_‑)CsAsp2C1_6}_7C1_e_s_t_e_r X=(S03‑)' Y=Na+， R=C3H₇: (CN)2Cob(III){10‑(S03‑)CsAsp2C16}7C3ester

図1.5 新規ピタミン B12^{人工脂質類の構造}

‑17‑

(28)

プチド脂質類の合成について述べる。

第3章では，本研究で用いた未修飾の疎水性ピタミン B12類およびコリン環の10 位を修飾した疎水性ピタミン B12類の合成について述べる。

第4^{章では，第}2章でその合成を述べているアスパラギン酸残基を有するペプチド脂質と第3章で合成法を記述しているコリン環の10位にアミノ基を導入した疎水性ビタミン B12から誘導される新規カチオン性人工脂質，新規アニオン性人工脂質

の合成について述べる(図

1.5

参照)。これによりペプチド脂質のアミノ酸残基部位に共有結合を介して疎水性ピタミン

B

₁₂を導入するとともに，その固定化部位につ

いても特定することに成功している。

第5章では，第4章で合成法を述べている新規ピタミン _B12人工脂質と第2章で合成法を述べているペプチド脂質の相互作用について検討した結果をまとめている。

示差走査熱量分析(DSC)，動的光散乱(DLS)測定，電子顕微鏡観察により，新規ピタミン B12人工脂質を2モル%含有した系までは均一な混合二分子膜ベシクルを形成していることが示され 3"""'5モル%含有系では相分離している可能性があることを明らかにしている。

第6章では，新規ピタミン B12人工脂質とアポ酵素モデルとしての合成二分子膜との組み合わせにより構成した新規人工ホロ酵素系による炭素骨格組み替え反応について検討を行った結果について述べる。すなわち，ピタミン B12依存性酵素反応のうち，メチルマロニノレーCoAムターゼ， αーメチレングルタル酸ムターゼのモデル反応について検討している。新規人工ホロ酵素系では，アルキル化した疎水性ピタミ

ン

B

₁₂類を種々の媒体中で光開裂させアルキルラジカルを発生させるという条件を用い，生成物をガスクロマトグラフ法により解析している。メチルマロニノレ‑CoAム

ターゼのモデル反応では新規カチオン性ベシクルを用いるとハロゲン化アルキルが生成し，異性化生成物がほとんど得られていない。しかし，新規アニオン性ベシクルを用いることによりこの問題は解決され生成する異性化生成物の割合も増加している。さらに反応選択性も向上し，二分子膜型人工酵素系でのエステル基転位において最高の異性化率(還元生成物に対する転位生成物の割合)が得られた。また， αーメチレングルタル酸ムターゼのモデル反応では，二分子膜中における反応性を初めて検討している。その結果，通常のアルキルラジカルを発生させる方法では新規人工ホロ酵素系においてのみ低収率ではあるが，異性化生成物が得られている。

(29)

しかし，反応系にシアン化物イオンを添加することにより異性化生成物の収率が著しく向上している。この結果からシアン化物イオンのトランス効果に基づく電子移動によりアニオン中間体が生成していることが示唆される。さらに，有機合成への応用をはかるためにアミノ酸誘導体の炭素骨格変換反応について検討している。この反応においても新規人工ホロ酵素系において異性化生成物が最も多く得られ，

この二分子膜型人工酵素系が非常に有効に作用していることが明らかになっている。

第7章では，二分子膜型人工酵素の反応場特性について従来の非共有結合的な系と共有結合的な系である新規人工ホロ酵素系を比較する。電子スペクトルにより二分子膜中でピタミン B₁₂はバルク水相とは異なる疎水的なミクロ環境に位置してい

ることを明らかにしている。さらに DSC測定から両人工ホロ酵素系ともに疎水性ピタミン B₁₂が混合されることにより単一層二分子膜の構造が乱されることを指摘している。また，蛍光偏光度の測定から新規人工ホロ酵素系の方が大きな偏光度の値を示し，疎水性ピタミン B₁₂の分子運動が抑制されていることを示している。以上の結果から新規人工ホロ酵素系でのモデル反応における異性化収率増大の大きな要因は，二分子膜により構成される反応場において疎水性ビタミン B₁₂の脱溶媒和

と運動性の大きな抑制に起因すると結論している。

第

8

^{章は結言で} 本研究の成果の総括である。

‑19‑

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