静岡赤十字病院研究報
雅 浩 畑 田 大 藤
I.緒 言
近年 の分子生物学 の進歩 によ り,臨床 医学 とりわ け臨床検 査 の領域 に も遺伝子学的な手法 を用 いた検 査法が導入 されて きた。中で も,造血器腫瘍 はサ ン プ リングの容易 さ,遺伝子異常 と特定病型 との関連 性 が早 くか ら明 らか にされ ていた ことよ り,遺伝子 学的検査 の最 も進 んで い る領域 といえる.実際,1998 年 には,造血器腫瘍核酸増幅 同定検査が制限つ きで 保険承認 された.当院 で は,昨年 よ り準備 を して き た遺伝子検査室が本年初 めに完成 し,機器 の搬入 が
ほぼ完了 した 3月 よ りpolymerase chain reactioll
(PCR)法を中心 に技術 の習得 と同時 に,染色体分 析結果 と遺伝子検 査 との対比 を行 なって きた。また,
形態学的所見 とフローサイ トメ トリー (FCM)によ る表面形質 の検索 を合わせて.遺伝子学的検査 の最 も効 率的 な造血器腫瘍 の診断法 を模索 して きた。 そ の 中 で,multiplex reverse transcription‐PCR
(multiplex RT PCR)法"を採 用 し,自血病症例 を 用 いて検証 を行 なった。 さらに悪性 リンパ腫 におい
て も,予 後の不良なマ ン トル細胞性 リンパ腫(MCL)
の原因遺伝子 であるcゝ=clin I)1(CCND l)を競合
RT‐PCR法2)で検討 した。これ らの結果 を紹介 し,遺 伝子学的 な検 索法 の有用性 を考察す る。
H 対 象 と方 法
1)対象 :当 院 で経験 した造血器腫瘍 の内,遺伝子 学 的 な 検 索 が 確 立 し て い る慢 性 骨 髄 性 白血 病
(CML)慢性期 7例と急性転化 (CML BC)2例
に,FCMお よび染色体核型分析,FAB分類 で診 断 が確 定 した急性骨髄性 白血病(AML)16例 ,急性 リ ンパ性 白血病 (ALL)9例, さらに リンパ節生検 で 病理診断が な されFCMの検 索がで きた悪性 リンパ 腫6例を対 象 とした。 これ らの症例 は,全て染色体 分析 を施行 した (外注SRL)。
2)方法 :骨 髄液 また は リンパ節細切後 の細胞浮遊 液 をQIAGEN社 キ ッ トQIAamp RNA H00d
Miniキッ トを用 いて総RNAを抽 出 した.RT PCR
には, Amersham tt Ready To Go RT― PCR Beads を使用 した.RT反応 はPCR Thermal cycler Ta
造血器腫瘍 におけ るmultiplex reverse transcription pOlymerase chain reaction法
の有 用性
彦 大 棟 久美江
乏11)
黒 山 祥 文
静 岡赤 十 字 病 院 検 査 部
1) 同 血 液 内科
要 旨 :世 界保健機構 (Wond Health OrganizatiOn i WHO)分 類 で提唱 され てい る急性 白血 病 の 自血病特異的 な遺伝子学的 なサ ブグルー プを同定す る目的で,multiplex reverse tran scHption polymerase chain reacJ011(mul」 plex RT I)CR)法 を用 いて検討 した。急性 白 血病 16/25例 と慢性骨髄性 白血病 の 9/9例 で は,自血病特 異 的 な再構成 を multiplex RT‐
PCR法で確認 し,こ の結果 は染色体核型 の結果 とも関連 していた。急性骨髄性 白血病 の中で もFrench Amencan BHJsh(FAB)分類 一M2t(8;21),M3,M4EOは 形 態 所 見 と染 色 体 核 型 お よび遺 伝 子 所 見 が完 全 に一 致 した.遺伝 子 学 的 な解 析 に よ り,染色 体 分 析 で不 明確 で あ った異 常 が 明 らか とな り,残存 自l触病 の検 索 にお い て も不 可 欠 な情 報 を得 る事 が で きた。
Key words:p01ylnerase chain reaction(PCR),去 , multiplex reverse transcription―PCR
(multiplex RT I)CR)法,急性 白血 病,慢性 骨 髄 性 白血病,悪性 リンパ腫,
cyclin D l
VOL 24 N0 1 2004
KaRaを 使 用 し,42°C30分,95°C5分反 応 さ せ
cDNAを得 た。 白血病 の mu■ iplex RT‐PCR法の
PCR条件 お よ びprimerの設 計 は,Pallisgaard ら1),Kimら3)の方 法 に 準 じ て 行 なった。 Nested
PCRは, Amersham l生 puRe Taq Ready To(lo PCR Beadsを用 いて添付資料 に準 じて行 な った。
CCND lの検 索 は,Uchimaruら2)の方法 に準 じた.
増幅 した遺伝 子産物 は,Mupidミ ニグル泳動槽 を用 いて泳動後,SYBR Goldに て1時間染色後,ATTO
プ リン トグラフにて可視化 した。
リンパ腫細胞 お よび急性 自血病細胞 の表面形質 の 検 索 は,COULTER EPICS XLを 用 いて CD 45
gaing法にて分析 を行 な った。特 に悪性 リンパ腫 に おいては, CD 5, CD 10, CD 19, CD 20の 発現 を, 急 性 リ ンパ 性 白血 病 に お い て はCD 10,CD 25, KOR SA 3544の発 現 と遺 伝 子 学 的 所 見 を対 比 し た.
Ⅲ.結 果
1)CML症例 にお けるnested RT―PCR
検 出感 度 向上 の 目的 でKimら3)の報 告 す るnest ed RT‐I)CR法にて,CML症例 の Maior BCr̲Ablキ メラ遺伝子(M―BCR)の検 出 を行 なった。図 1の よ う0こcase 29は 368 bp lこ , case 28 1ま 443 bp lこバ ン/ ドが検 出 され た。 ここに示 すpHmerを用 い る こ と でM BCRキ メラ遺伝子 の成 り立 ち,即ちbcr切断
部位 の同定 が可能 となった.368 bpは b2a2,443 bpはb3a23)で,今回bcr切断部位 の検索 を行 なっ た5例の うちb2a2は 2例,b3a2は 3例に認 め ら
静岡赤十字病院研究報 れた (表2).
2)急性 白血 病 にお け るmulttplex RT PCR法 の 実際
図 2に はMLL:1l q 23を 同 定 し た (表 1
case 12)実際 の泳動像 を示 す。MLL:Rl,R2,R5
はmix primerで,その うちR2と R5にバ ン ドが 検 出 された.図 2下段 には,MLL遺伝子 のsplit out
analydsを示す。R2に含 まれ ていた 6コ の遺伝 子 とR5に含 まれていた 5コ の遺伝子 を個 々 に展開 し た ところ,R5Cに単独 のバ ン ドが検 出 された。R5 Cはt(9:11)(p22:q23)の 転座 を示 すが,MLL遺
伝子 のエ クソン (eX)6か ら9に 切 断点があ り,そ
の切 断 部 位 に応 じて,MLL ex6:321 bp,ex 7:
208(453)bp, ex 8:322(567)bp, ex 9:469(714)
CML/case 29 GttDH CML/mse 28 GOH
DNヽmarker
lst primer
5 GCCCCA鴬(〕TAC(ヽ へGGAGTC‑3. ′ヽ3Ll 5 CCATCn3C()n3ACATCCGTG‑3 BCRl
2nd Prirrler
5'GT 「(yrccACACT('TTCヽ(rG‑3 ABL2 5‑GGACCTCCAGATCCTCACGヽ ヽ‑3' BCυ
図l CML症例 におけるnested RT‐PCR(bcr遺伝子 の切断部位 と泳動位置の違い)
表l AML症例 におけるmultipにx RT‐PCR法と形態所見,染色体核 型 との対比
dl4nosls 4e (s, : mple multlplex RT PCR
ANL/M2 41(D:BM AML/M2 70(M):BM AML/M2 53(M)IBM
ハML/M8 77(M):BM AML/M3 58(M):BM
ハκL/M4 45(D:BM
ANIL/M5b 69(D:BM AML/M5b 88(NO:BM
PML/RAR
46,Ж t(821)022:q22)5/20 cen
46 XX t(15:17)(q22:q12) 17/20c‐ 11 46,XY,t(1,17)(q22,12)20/20 cen
t6,PF,t(317)(p21025)t(1517)(q22:011〜 21)15/20 46,XY t115:161 20/20 ceu:先 天Ft核型 46,XY lnv(10(p13q22)20/20∝H
XY inv(16)(p13q22)18/18∝n/付力111染色体 〈+) ,XY inv(16)(pl〔●22) 20/20∝H
45つOr,t(1117)lq23;qlo Ort(11;17)(q23:q21) der(12)t(12:13)011:o141hs(12:?)011:・l,‑13 10/20∝ll ins(12;?),+13,+19,+21■ 21 2/20 cell
46,メⅨ,add(12)rpl l)1/20 cen, 4b,0 19/20 cen
﹈¨¨
‑7‑
￨ ↑
↑
表2 ALLおよびCML症例 におけるmullpttx RT‐PCR法と形態所見,染色体核型,表面形質 との対比 Cas dienosis ce (ei : smple CD10/CD25/KORSA・ mutiplex κr PCR kη o,pe
・７
︲８
︲９ ２０ ２
． ２２ ２３ 繁 ２５
ALL Ll ll(F):BM ALL L1 3(m:BM
T￢唖 33(m IBM
皿 ―L2 37(NO:BM AIL Ll ll(M):BM
俎L曖 58(Ml:BM ALL L2 10(M):BM
ALL拿 〈CD7+) 69(Ю :BM CML―BC拿。 29〈Ю IBM CML―BCt■ 64(D:BM
CML 49(D:BM CN4L 51(M)iBM CML 57(Fl:BM CML 60(F):BM CML 65(M):BM CML 48(M)IBM CML 25(M):BM
23%/133%/224%
977%/08%/07%
15%/02%/08%
651%/922%/389%
999%/108%/976%
976%/19%/943%
952%/987%/122%
989%/115%/431%
891%/328%/NT
E2A/PBXl
54 XY+4+10+12+17+18+19+21■21 2/5"ll 46,Dく 20/20 cell
46メγ,inv〈9)01l q13).der(19)ao 19)lq23p13)[1]
46メコ nv(9)01l q13) 19/20N‐ en
46XY,t(4:11)(q21:02311(7)〈 qlo)10/20 cen め くY:tて,22)(o34●11)3/20 ceu
45,Y,―X,add(つ rp16),‑7,■ (9:22)(q34:011),‑10,
‑14 add(16)(q22),+3mar ,で′ 20/20∝u
45,XY,7 18/20∝n M BCR b3a2 46,rr● (,2'(q ;qlD 5/20 cen
,ldem.der(21)t(121)021:q22)9ノ 20 ceu M―BCR 46,XX,t(1:9:22)lp32:q34;qll) 20/20 cell
M BCRl禦 46調Fa,20(q34:ql D 20/20∝H M BCR b2a9 46.い′ば92'(q34:ql D 18/20∝H
M BCR 46,XX,ば 920(q34:010 20/20 cen
M―BCR ,XX,t(9:22)(q34:qll) 6/20 cen M BCR ″ 46 XY t(,22)(q :qll) 20/20 cn
M―BCR b2″ 46,pF,t(922)(q34:qll) 19/20 ∝」
M―BCR b&2 46,XY,t(9:22)(q34:qll) 10/20 cell
*:POX(+)芽球は23%で ,表面形質はmyeloidお よ』ymphoid markerが 陽性でさらにCD7(+)で あった
**:CML BC(しmphOld BC), ■:聰ЭR―ジ8544,NAD:no abnormaniけ detected, S:M― BCR,m―bcrのみ検索しともに陰性
R2AI MLL/´
『
lp t(1;11)(q23:p13)
R2B:MLL/J17 11:1つ02aq21) υC MLLex5 9/r10 く1●lo 012q20 R2DN]」しex6 9/J10 t(101D012q20 R2EI ML ex6‑9/AF10 t(10:11)(p12:q23) Rtt MLLex6 9/ハF4 t :lD●21,20 R5BI MLLex6 9/EヽL t(11,19)(q23,p133) R5Ci卜■■c(6‑9/AF9 イ9;,2,●22o2の R5D MLLcx6 9′A用 911)022q29 R5EIMユ /Arlq t(1:11)(p21lq23)
Makcr M41or BCR miner bcr 4LL関連,加α
MLL Rl MLL R2 MLL R5 E2ヘ
Marker τ七 ゴるL
PBX1/E2ヽ TEL/ABL
πL/AML‑1 H『/E2ヽ E2A
T4LID
t(1,19)(q23:p13) t(9:12)(q34:p13) t(12;21)(p13:q22) t(17:19)(q23,p13)
図2 Mulutiplex RT PCR法の実際1.MLL遺伝 子 を同定 し得 た症例 (case 12)
bpに特異 なバ ン ド位置が出現 す る1).本例 の場 合 は,
200 bp前 後 にバ ン ドが あ り,MLLの ex 7/AF9 t
(9:11)(p22;q23)と 同定 された。
図 3に はTAL1/SILを同定 した (表2 case 20) 症例 の泳動像 を示 す。本例 の芽球 の形態学形状 は,
小型 で核 不整,核クロマチ ンは凝集 し,N/C比が高 く,ペルオ キシダーゼ染色 (POX)陰性,酸性 フォ ス フ ァターゼ はゴル ジ野 に局在性 に陽性 を示 した.
FCMで はT細胞 性 マー カーが 陽 性 で,さ ら に CD4+CD 8+分画 の存在 もあ り,形 態学 的所見 と表 面形質 か らT‐ALLと診 断 された。multiplex RT‐
図 3 Mulutipttx RT‐ PCR法の実際2.TAL 1/S:L
遺伝子 を同定 し得 た症例 (case 20)
PCR法で は,ALL関連m破primerに 明瞭 なバ ン ド が出現 した。さらに 5コ のALL関連遺伝子 をspl■‐ out analysisを 行 った ところ, レー ンの上段か ら2
段 目に明瞭 なTAL1/SIL(183 bp)の バ ン ドが検 出 された.
3)残存 白血病細胞 のFnI定
図3で示 したTAL1/SIL症例 を,同 じpHmerを
用 い てnested PCR法で残 存 白血 病細 胞 の検 索 を 行 った.治療後約 1カ 月後 の骨髄 で は,初診時 に見
multiplex RT―PCR 艤蟻饉鷺尋爾鐵餞
一→
sDlit out malysis 蓼
▲Ｔ
VOL 24 N0 1 2004
られ たTAL1/SILの明 瞭 なバ ン ドは検 出 され な か った (図4上).
図4下にはCML症例 で血縁 ドナーか らの同種 造 血幹細胞移植 を施行 した症例 を提示 す る。移植後28 日にはnested PCR法を用 いて検索 して も,M―BCR
は検 出で きなか った。本例 は,移植後4年を経過 し てい るが,分子生物学 的完全寛解 を維持 してい る.
DNA marker
初 診時BM 2004/07/07 E2A
治療後BM 2004/08/02 E2A
初 診時BM
移 植前BM
移植後BM:dabr 28 移植後BM:d、 62 DNA nlarker
図4 Nested RT‐PCR法を用 い た残 存 白血 病 細 胞 の検 出
4)遺伝子学 的検索 と細胞形態所見,染色体核型 お
よび表面形質 の対比
AMLでは検 索 した 14/16例 に異 常 核 型 を示 し た。病型特異 的 な核型 を示 した症例 は9例にみ られ,
mu■iplex RT‐PCR法との対比 で は8/9例で一致 し た.不一 致 で あった caSe 13は,染色 体 分 析 で はt (11:17)(q23;q12)or t(11:17)(q23:q21)を 示 し た が,multiplex RT PCR法 で はMLL ex6/
AF 10(MLLex6と 10番 染色体 との転座)を示唆 す る所見 で あつた。 また,染色体分析 で は正常核型 を 示 し た が,multiplex RT PCR法 で はMLL
ex7 8/AF9でt(9:11)を 示唆 す る所 見が得 られた 症例 も存在 した (case 4)。
ALLでは,6/9例が異常核 型 を示 した.その内,
病 型 特 異 的 な核 型 は3例 に認 め られ,mu■iplex
RT‐PCR法の結 果 とも完 全 に一 致 した。 しか し, case 20,24は正常核型 で あったが,muldplex RT‐
PCRでは そ れ ぞ れTAL1/SILと m bcrが検 出 さ
れた。また,case 19は der(19)Pt(1:19)(q23:p13) を 1/20細 胞観察 してい るが,muldplex RT PCRで はE2A/PBX lを検 出 した。
静岡赤十字病院研究報 表面形質 との関連 で は,muluplex RT PCR法で
m‐bcrを 検 出 した症例 は全例 KOR‐SA 3544が陽性 で あ り,CD 25の発現 も認 め られ る症例 も存在 した. CD 10陰性 の症例 は今 回の分析 で2例存在 したが,
その内の1例にはMLLの関与が認 め られた。KOR‐
SA 3544が 陰 性 で,CD 25の 発 現 やmyeloidと lymphoid markerが ともに陽性 の症例 には,multi plex RT‐PCR法でM BCRが証 明 され る比 率 が 多
い傾 向が あつた.
CMLでは,核型所見 とmuhiplex RT‐PCR法の 結果 は完全 に全例一致 した。
5)cyclin D lの検 出 と臨床応用
リンパ 節 生検 を施 行 し病 理組 織 でMLと診 断 さ れた症例 で,FCMに よる表面形質 の検 索 と染色 体 核型が分析 された検体 を用 いて,cychn D l,D2,D3
を競合RT PCR法で検 索 しcydin D lの過剰 発 現 の有無 を検討 した。図5は,CD 5+CD 19+分画 が CD 20の 8割以 上 を占め る症 例 の競 合RT PCR法
の泳動像 で ある。Cyclin D 1 483 bp,D2354 bp, D3247 bp2)に 泳動 され るが,case lは明 らか なDl
のバ ン ドが観察 され る。一方,case 2,3はDlには バ ン ドは検 出されず,D2が過剰 に発現 していた。
DNA marker ML case l G2③ H ML case 2 C.APDH
NIL case 3
GzmH
図 5 Cyclin D:Competitive‐ PCR
病 理 所 見 とFCM,染色 体 分 析 お よ び競 合RT‐
PCR法の結果 の異 な った症 例 の検 査 所 見 と泳 動像 を表3,図6に 示 す。Case 4は,FCMの表面形質 で CD 5の増 多 を示 し病理診 断で もMCLであ ったが,
競合RT PCR法で はCychn D lの過乗」発現 はな く
(図6の上段 ),染 色体分析 で もMCLの特異的 な核 型 t(11;14)(q13:q32)は 認 め られ なか った。Case 5 は染色体 分析 で分裂 像 が得 られ なか ったが,case 6 で はMCLに特徴 的 な核型 が観察 され,と もにCD 5 の著増 が観察 され るた。競合RT PCR法で はcychn
M―BCR nested RT― PCR case 28
‑9‑
TAl 1/SII nested RT― PCR case 20
↑ ￨
D3 D2 Dl
l↑
一一一 一一一一一一 一・
．
・・一一一一
・一
・一一一一一一一
▲
Dlの過剰発現 が観察 され るが,病理診 断 はdiffuse
mediam B ceH lymphOma:DNIBLと FoHicular
lymphOma:FLで あった.
表3 Cyclin D l発現 およびFCM所見 と病理所 見が 異 な った症例
ML case 4
ML case 5
ML case 6
D3 D2 Dl
図 6 Cyclin D i Competitive‐ PCR
静岡赤十字病院研究報
Ⅳ 考 察
造血器腫瘍 の診 断 は,従来 か らの形態学 的 な検索 に加 えFCMによる表面形質,さ らに染色体分析,遺 伝子学的 な解析 に よ りな され る。 その中で も染色体 異常 と遺伝子異常 の解析 は,自血病 や リンパ腫 の病 型分類 に重要 な貢献 を して きた。最近報告 された新
WHO分類 で は,責任遺伝子 の異常 を亜型分類 の基 礎 に置 いた積極 的 な試 み を している。急性骨髄性 自 血病 にお いて は,特定 の遺伝 子異常 を有 す るAML
として, 1)t(8:21)(q22;q22)あ るいはAML1/
ETOを有す るAML, 2)inv(16)(p13;q22)あ る い はCBFβ/MYH llを有 す るAML, 3)APL,t
(15:17)(q22:q22)あ る い はPML/RARα を有 す るAML, 4)1l q 23(MLL)異常 を伴 うAMLを
独立 した病型 としている。他 にバ ーキ ッ トリンパ腫/
白血病や5qを伴 うMDSも独立 した病型 として捉 え られ ている。 また,責任遺伝子 の異常 が高頻 度 で あ る ことが記載 されてい るが,それ を亜型定義上 の 要件 としていない病型 として はCML,濾胞性 リン パ腫 :FL,MCLがあげ られ てい る。.
F'0'「甲■■r●●■,,・,■11■ ,￨■11‐●■￨■￨,■
'、
●ヽ1‐■11■￨,‐,口￨■.'‐●
Ｗ 円
＝
FAB…M4,M5 M2(mono含)
●●
●ｒ 一■
●■
一一 一一一 一一一 一一 一一一 一一 一一 一一 一一・一一一一一一
一一
・一
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・一一一一一一一
・一一 一■
M…BCR,m●研,ALL sd**]
FrS″ r ML■/静BCP MLL set*(Rl,R2,R5)]↓
M…BCR,m‐ bcr,AMLl′ETO,AML1/EVil, PML/RAR,CBF/MYHll,AML set*ホ *
AMLlノETO
PMLノRAR CBF/MYHll
* :MLL(1,q23)′AFX(Xq13)、 MLL(1lq23)′ AFlq(lq21) MLL(1lq23)′ AFlp(lpセ)、 MLL(1lq23)′AF4(4q21)MLL(1lq23)′AF6 16q2η
MLL(1lq23)′AF9 1ep22)MLL(11●23)′AF10(lop'2)MLL(1lq23)′ MLL(1lq23) MヒL(1lq23)′AF17(17q21)MLL(1lq23)′ EL(19,131)MLL(1lq23)′ ENL(19p133)
** SL l p341′ TALl o p341 E2A●
"101′
PBXl q231 TEL 12p131/ABL(鮮 4)TEL o2p131′AML1 21q221 E2A 19P131′ HLF o 7q22)
***:NPM(5q351′MLFl(3q251x TEL o2p131′ PDOFR 6qo3)DEK(6p231′ CAN 19q34)、 SET(9q341′CAN 19q34)TLS 16Pll)′ ERG 121q22)
図7 形態所見 お よびFCM結果 か らみたMuLiplex RT‐PCR法を用 いた効率的 な白血病診断の フ ローチ ャー ト 闇‐BCR
,{r, r} il)i
■ ‐￨￨■‐ ‐￨￨11■‐
FAB‐M2 M3 or
M4Eo POX(―)
TAL1/SiL m-bcr
VOL 24 N0 1 2()04
本邦 で は,1998年には造血器腫瘍核酸増幅 同定検 査 が制 限つ きで保険承認 された.当院 で も遺伝子検 査室 が新設 され,本年 9月 か らは保険診療上 での造 血器腫瘍 の遺伝子検査 を実施 してい る.我々は,前
述 した新WIIO分類 で責 任 遺 伝 子 が 明確 に され た 病型 を対象 に,測定 系の確立 と効率的 な遺伝子診 断 システム を構築す る準備 をして きた。測定系におい て は特異性 と感度 を高 める日的でnested PCR法 を 採 用 した。 また,いくつかのパ ー トナー遺伝子 と転 座 す るMLL遺伝子 の検 出や初診時 か ら効 率 的 に複 数個 の遺伝 子異常 をス ク リーニ ングす る ことを目的 にmuldplex RT PCR法 を採用 した.初診 時 に検 出 で きた キメラ遺伝 子 は,同様 のpHmerを用 い る こ とで残存 白血病 の検 索 に も経時的 に用 い る ことがで き有用 で あ る.また,効率的 な遺伝子診 断 システム として,当院 で実施 してい るFCMや特殊染色,形 態 診 断 も合 わせ て図7のよ うに 目的 の遺 伝 子 異 常 を 絞 った検索 も有用で あ ろ うと考 えてい る.現在 は ま だ検 討 中で あ るが,FISH法を用 いてMLL遺伝 子 やM BCRを検 索 す る ことで更 に効率的 な運用が可 能 と考 え られ る。MLL遺伝 子 を有 した症例 は予後 不 良例 が多 く,初診時か らその有無 を知 るこ とは極 めて重要で あ る。また,Ph(十)の有無 は,特にCMIン の確定診 断や予後不良群 であ るPh(+)ALLの診 断 に も不可欠 であ る.従来 か らの染色体分析 は,培養 お よび核型分析 に時間 を有 す る ことか ら,I)CR法の 導入 によ り確定診 断 まで に要す る時間短縮 が可能 と な り利 点 の 1つ で あ る.当院 で は以 前 か らPh(+) ALLの鑑 別 には KOR SA 35445)を 用 い て ス ク リー ニ ング してい る。今 日1の検 討 で も,m bcr(十)ALL
症例 は全例KOR SA 3544陽性 で,その有 用性 が確 認 で き た.さ ら にCD 25の 発 現 やmyeloidと lymphoid markerが ともに陽性 な所 見 を重視 す る
こ とで初診時急転 のCML症例 も考慮 で き,遺伝 子 学 的 な ア プ ローチ を効 率 的 に運 用 で き る と思 わ れ た。 またALL症例 のCD 10の発現 の有無 も注 目す べ き所見の 1つ である。今 回検討 した case 21は ,表 面形質 で はCD 10, CD 19+, HLA‐ DR十 (Early B precursor ALL)で , multiplex RT― PCR法￨こよる 遺伝 子検査 で はMLL ex 7/AF4を示 し,MLL遺伝 子 の関与 が示 唆 された症例 で あった。森 ら5)の報 告 で は, Early B precursor ALLで KOR‐SA 3544陽 性 は 1/21例 であったが,その1例は1l q 23の転座 を有 していた と述 べてい る。 この ように表面形質の 検 索 も含 めて 目的 とす る遺伝子異常 を推測 し,効率
静岡赤十字病院研究報 的 に遺伝 子検査 を行 うこ とはp五merの無駄 を省 く
Lからも重要であ る。
multiplex RT PCR法 で異常 を示 す頻度 は文献 的 に39%〜45%1'・つとされてい る.当 院での検討では,
急性 急性 白血病 全体 で 20/25例 :800%(AML14/
16例 :875%,ALL 6/9例 :66.7%)と従来 の報告 に比 し,高率 で あった.それ は,今回の検 討が,当
初染色体核型 で異常 を示 す症例 を多 く選択 し,遺伝 子学 的検 索 を行 なった こ とに よる と思われ る。 しか
し,病 型特異的 な核型 を示 し,multiplex RT‐ PCR法
で も異常 を示 した症例 は,AMLでは8/9例 にALI´
で は全例一致 していた点 は注 目すべ き所見 であ る。
特 にAMLにお い て は形 態 学 的 に診 断 が 容 易 な
FA13 M 2t(8:21),M3,M4Eoは,全例染色体核型 と遺伝 子型 が一致 した.CMLに おいて も同様 に染 色体核型 と遺伝子型 が一致 し,遺伝子 の異常が病型 や亜型 と完全 に一致 す る ことが確 か め られた。また, 今 回の検 討 で は,正常核 型で あ るに もかかわ らず,
遺 伝 子 学 的異常 が観 察 され た症 例 が3例に見 られ た.特にその傾 向 はALLに多 く認 め られ た。ALL
で は,核型解析 に必 要 な分裂像 が得 られ ない ことを よ く経験 す るが,採 取 されたRNA量が 1分 にあ り,
さ らにキメラ遺伝子が明 らか にされてい る症例 で は multiplex R′「 PCR法にて スク リーニ ングす る こと は極 めて有用であ る ことを示す所 見 と思われた。 ま た,case 19では,t(1;19)(q23:p13)の 存在 が不明 確 で あった が,multiplex RT‐PCRで はE2A/
PBX lを検 出 してい る.Case 13は染色体核 型 も遺 伝子表現型 もともにMLLの関与 を示唆 す る所 見で あったが,転座先 にて相違が見 られた.この ような 相違 は染色体分析 において ク リプテ ィクな異常 と判 断 され るが,今後症例 を増 や し検討 すべ き課題 で あ る.
multiplex RT‐I)CR法で 同定 され た 遺 伝 子 異 常 は,前述 した よ うに検 出 に使 用 した primerを 用 い て残存 白血病細胞 のチ ェ ックが可能 であ る。今I国の 検討 で も,図4に 代表例 を示 したが,有用性 が確認
で きた。今後 は,real time PCR法 の導入 によ り,
現在 の定性 か ら定量 へ と検 査技術 の向上 を図 り,治
療後 のモニ ター リングをよ り精度 の高 い もの に した
い .
悪性 リンパ腫 において は,今回MCLと の鑑別 を 有 す る症例 を中心 に検 討 した。MCL細胞 の形 態学 的所見 として は リンパ芽球様 の繊細 な核 クロマチ ン を示 し,核不整 (く びれ)を有 した特徴 あ る細胞像
‑11‑
で あ る.我々 は,表面形質 のCD5(十 )B細胞集 団の 存在 とCD 10,CD 23‑の 所見 も合 わせてMCLの診 断根 拠 の1つに して い る.さ らにCD 5(+)DLBL
を考慮 して,CCND lの有無 を簡便 な競合RT PCR
法 を用 いて検 索 した.今回の検討 で は, 3例に病理 診 断 と遺伝子 お よび表面形質 の所見 との解離が見い だ された。PHmerの設定か らPCR条件 のすべて を Uchimaruら2)の方法 に準 じたが,CCND lの過剰発 現 の判定 にはD1/D3比を用 いてはお らず,今回 は あ くまで cyclin D l(483 bp)の バ ン ド位置 と濃 さで 判 断 しているに過 ぎない.病理所見 との解離 には,
い くつかの要因 も考 えられ る。 まず病理側 の要因 と して免疫組織 学的 な検 索 にお ける固定不良や用 いた
CCND lモノクローナル抗体 の クロー ン,切片作成
後 の放 置 時 間 な どに よって も染 色 性 が異 な る (私 信)。 また遺伝子検査 において は,定性 的判定法で な く,定量PCR法の導入 が よ り客観 的 で あ る.今後 は,一致率 の向上 に努 め るよう,個々の検査室 の情
報 のや り取 りが大切 であ ろ う。
V.結 語
1)造血 器腫瘍 の遺 伝 子 学 的 な検 索 を目的 にnest ed RT‐PCR法とその応用 で あ る multiplex RT‐
PCR法を導入 し,その有用性 を検 討 した。
2)AMLで は FAB‐M2:t(8:21),M3,M4Eo
は,形態学 的診 断 と染色体核型,遺伝子学 的 な所 見 が完全 に一致 した.ま た,CMLにお いて も同様 であ った。
3)mul百plex RT‐PCR法の導入 に よ りMLL遺伝 子 やPh(+)ALLな ど予後不 良 な白血病症 例 をス ク リーニ ング可能 で あった.効率的 に遺伝子検 査 のp五merの選択 には,FCMによる表面形質 の検 索やFABの病型 が参考 にな る と考 え られた.
4)リ ンパ節生検 において は,FCMの表面 形 質 所 見 と合 わせ て競合RT PCR法でCCNDlを検 索 す る こ とはMCLの診 断 にお い て極 め て有 用 で あった.
文 献
1)Panisgaard N,Hokland P,R五 sh DC,et al Multiplex Reverse Transcription‐ Polymerase Chain Reaction for sirnultaneous screening of 29 translocations and chromosomal aberrations in Acute Leukenlia Blood 1998;92(2):
574‑588
2)Uchimaru K,Taniguchi T,Yoshikawa M,et al Detection of Cyclin D l(ιιノー1,PRAD l)
Overexpression by a Silllple Competitive Reverse Transcription― Polymerase Chain Reac―
tiOn Assay in t(11; 14)(q13; q32)‐Bearing B‐
CeH 1/1alignancies and/or ルlantle CeH Lymphoma Blood 1997:89(3):965974 3)Kim YJ,Kim D W,Lee S,et al Comprehen―
sive comparison of FISH, RT‐ PCR,and RQ―
PCR for monitoring the BCR―ABL gene after hematopoietic stem cell transplantation in
CML Eur」 Haemato1 2002;68:272280.
4)森 茂 郎 。 新WHO分 類 に よる 自血 病・ リンパ 系 腫 瘍 の 病 態 学 。 東 京 :中外 医 学 社 :2004P
l‑7
5)Mori T,Sugita K,Suzuki T,et al A novel monoclonal antibody, KOR‐ SA 3544 which reacts to philadelphia chromosome‐ positive acute lymphoblastic leukenlia cens v′ith high sensitivity Leukelllia 1995:9:1233‑1239 6)StrehI S,Konig NI,A/1ann G,et al ⅣIultiplex
reverse transcriptase‐polymerase chain reac‐
tion screening in childhood acute myeloblastic leukemia Blood 2001;97:805‑808
7)Eiia L,Mancini M,Moleti L,at al Amulti‐
plex reverse transcription‐polymerase chain reaction strategy for the diagnostic molecular screening of chilneric genesi a clnical evalua‐
tion on 170 patients with acute lymphoblastic
leukernia Haematologica 2003:88(3):
275‑279
VOL 24 N0 1 2004 静岡赤十字病院研究報
Usefulness of Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Method for
Routine Molecular Diagnostic Hematopathology Practice
Masahiko Ohata, Kumie Ohmune, Yoshifumi Kuroyama, Hiroyuki Fujita'r
Department of Clinical Laboratory, Shizuoka Red Cross Hospital
1 ) Department of Hematology, Shizuoka Red Cross Hospital
Abstract : The purpose is to develop a multiplex reverse transcription polymerase chain reaction (multiplex RT-PCR) assay for detection and quantification of leukemia-specific chimeric transcripts that identify the genetic subgroups of acute leukemias proposed by the World Health Organization (WHO) classification. To determine the incidence of leukemia-specific rearrangements, 16/25 cases of acute leukemia andg/9 cases of chronic myelogenous leukemia (CML) were screened with a novel multiplex RT-PCR assay, and the results were correlated with the cytogenetic findings. The views that a mor- phologycal diagnosis and chromosome karyotype, cytogenetic were completely agreed French-American-British (FAB) classification -M 2 t(8;21), M 3, M 4 Eo among acute myeloid leukemia, and similar in CML. Cytogenetic analysis reveals a much broader range of abnormalities, multiplex RT-PCR provides the essential information for mini- mal residual disease studies.
Key words : polymerase chain reaction (PCR) method, multiplex reverse
transcription-PCR (multiplex RT-PCR) method, acute leukemia, chronic myelogenous leukemia, malignant lymphoma, cyclin D 1
連絡先 :大 畑雅彦 :静 岡赤十字病院 検査部
〒420‑0853 静岡市追手町82 TEL(054)2544311(2318) e‐mail:m Oohata@qa 2.so‐ net ne.jp
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