非結核性抗酸菌（

非結核性抗酸菌（Mycobacterium chelonae chemovar niacinogenes）に よる院内感染事例の発生と拡大原因の考察

1）（公益財団法人）結核予防会結核研究所抗酸菌部結核菌情報科，^2）結核予防会複十字病院検査課

鹿住 祐子

村瀬 良朗

石井加津恵

前田 伸司

（平成 24 年 9 月 4 日受付）

（平成 25 年 4 月 16 日受理）

Key words : Mycobacterium chelonae, outbreak, acid-fast staining, nontuberculous mycobacterium

要 旨

病院内で発生する Outbreak の原因菌として多剤耐性緑膿菌の様な一般細菌が数多く報告されているが，

抗酸菌の例も少なくない．抗酸菌には結核菌群と非結核性抗酸菌があり，非結核性抗酸菌の多くは非病原性 菌であるが，一部ヒトに対して病気を起こさせる菌種が含まれている．そして抗酸菌の検出は一般細菌と異 なり，染色性・発育に要する培養日数，温度，さらに栄養分など様々な要因に影響を受ける．

2007 年 3 月から 2009 年 1 月までの間，某医療機関にて発生した院内感染患者 73 例（感染患者 60 例，感 染疑い患者 13 例）のうち，5 例の患者からMycobacterium chelonaechemovarniacinogenesが検出された．こ の事例の感染拡大と原因菌特定が困難であった要因は，院内感染発生の医療機関・菌の特性・感染後に対応 した医療機関相互が関係したと思われる．さらに本菌種は ZN 染色では明らかな抗酸性を示したが，Gram 染色では不明瞭な染まり方であった．また発育温度域は 28℃ で良好な発育を示したが，37℃ 培養において 被検株 8 株のうち 6 株は陰性であった．そして薬剤に対する MIC 値は Cefmenoxime，Tosufloxacin に対し て 128μg!mL 以上であり，他の薬剤に対しても自然耐性を持っている．

〔感染症誌 87：424〜430，2013〕

序 文

病院内で発生する Outbreak の原因菌として多剤耐 性緑膿菌やメシチリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）

など多く報告されているが，抗酸菌（Mycobacteria）

も少なくない．そして抗酸菌の臨床材料からの検出手 法は一般細菌と異なり，染色性・発育に要する培養日 数や培養温度など様々な要因に影響を受ける．

培養可能な抗酸菌は大きく結核菌群と非結核性抗酸 菌（Nontuberculous mycobacterium：以下 NTM）に 分かれ，NTM の中にはヒトに対して病原性をもつも のもあるが，多くは土壌，河川水，家庭浴水など自然 界に分布している非病原性菌である^１）．また抗酸菌は 培養日数によっても 2 つに分けられ，ひとつは結核菌 群やMycobacterium avium，Mycobacterium gordonae，

Mycobacterium kansasiiなど培養に 7 日以上要する遅 発育菌（Slow growers）であり，他は 7 日以内に発

育する迅速発育菌（Rapid Growers）である．迅速発 育菌の主な菌種としてMycobacterium fortuitum，Myco- bacterium abscessus，Mycobacterium chelonae，Mycobac- terium mucogenicumなどがあげられ，M. chelonaeの chemovar として 1956 年にドイツの R. Bonicke が胃 洗浄液から分離した抗酸菌をMycobacterium chelonae chemovarniacinogenes（ATCC19237：以下，M. chelo-

nae niacinogenesあるいは本菌種）として発表した．

今回，我々は眼科で発生したM. chelonae niacino-

genesによる院内感染の経験からその発生と拡大の要

因を考察する．

材料と方法 1．被検株と対照株

ある医療機関において 2007 年 3 月から 2009 年 1 月 までの間，手術を受け，後に手術部位の二次感染（角 膜感染症）と診断された患者が 60 例とその疑い 13 例 の計 73 例が発生した（Fig. 1）．そのうちの 5 例の潰 瘍擦過物から分離された患者サンプル 5 株（結核研究 所 番 号 1047，1048，1049，1055，1089）と 手 術 時 に 原 著

別刷請求先：（〒204―8533）清瀬市松山 3―1―24

（公益財団法人）結核予防会結核研究所抗酸菌

部結核菌情報科 鹿住 祐子

Fig. 1 Number  of  the  corneal  infection  patients  and  sterilization  methods  at a specific ophthalmology clinic

Numbers in parentheses denote patients including suspected cases.

使用された器材から分離された器材サンプル 3 株（結 核研究所番号 1093，1094，1095）計 8 株がM. chelonae

niacinogenesと同定され，これらを被検株とした．さ

らにM. chelonaeの ATCC 基準株（ATCC35752），M.

chelonae niacinogenesの ATCC 株（ATCC19237）と本 研究と関連のない他の施設から分離されM. chelonae niacinogenesと同定された（結核研究所番号 164，357，

374，405）4 株計 6 株を対照株とした．

2．染色・培養

被検株と対照株 14 株をブロスミック 7H9 液体培 地，28℃，3 日間培養し，発育菌の McFarland0.5 を 10⁻⁴まで滅菌蒸留水にて希釈した．その 10⁻⁴希釈液に Gram 陽性コントロールとしてStaphylococcus aureus

（ATCC6538：以下，S. aureus）を希釈して混合した．

その 1 エーゼをスライドグラスに滴下し，Gram 染色 を行って顕微鏡写真を撮り，次にその Gram 染色を 行った標本を脱色・乾燥させた後に Ziehl-Neelsen 染 色（以下，ZN 染色）を行い，同じ場所を撮影した．

発育速度と温度域は上記 10⁻⁴希釈菌液を 10⁻⁶まで 希釈し，その 0.1mL を 1％ 小川培地に接種し，15℃・

28℃・37℃ にて培養した．

3．同定試験^２）

同定は 1％ 小川培地 28℃5 日培養菌から DNA を抽 出，16S r RNA（428bp），rpoB（306bp），hsp65（419 bp），dnaJ（365bp），ITS（259bp）領域の塩基配列を 分析し，患者サンプル 1047 と他 13 株との間の相同性 を比較した^３）．

4．薬剤感受性検査

患者サンプル 1047 を使って某医療機関にて手術後 に 感 染 予 防 と し て 使 用 さ れ て い た Ofloxacin，

Cefmenoxime，Moxifloxacin，Tobramycin，Tosuflox- acin，Levofloxacin，Gatifloxacin， Erythromycin 計 8 薬剤について MIC 測定を 行 っ た．方 法 は Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）^４）に従い，

Mueller-Hinton broth にて 28℃5 日間培養した．対照 として用いたS. aureusは 37℃ 培養で翌日判定した．

5．Biofilm 形成能

Jaime らの方法^５）に従ったが，培養温度は 28℃ でウ エル内で被検株と対照株の 14 株を 7 日間培養した．使 用したウエルの材質は polystyrene で，24 穴平底マ イクロプレート（Corning，USA）である．培養後，

ウエル内側を蒸留水にて洗浄し，直接ウエル内にて ZN 染色を行い，菌が壁面・底に付着しているか確認 した．陰性対照として菌陰性の液体培地を使用した．

6．消毒薬の効果

一般的に病院内で使用されるグルコン酸クロルヘキ シジン（5％ ヒビテン：大日本住友製薬）と両性界面 活性剤（エルエイジー 10 液：吉田製薬）を用い，患 者サンプル 1047 に対する効果を青野ら^６）の方法に従 い，消毒薬濃度はそれぞれ 0.5％ とし，2.5 分，5 分，10 分，15 分，30 分，60 分，120 分間作用させた．

結 果 1．Gram 染色性と ZN 染色性

Fig. 2．のように被検株と対照株の 14 株は ZN 染色 ではフクシンによって抗酸性陽性（赤色）を示した．

Gram 染色ではS. aureusはクリスタルバイオレット で濃紫色（陽性）に染まるが，被検株と対照株は c）

のように Gram 陰性に染まった，あるいは a）と b）

のように難染性を示した菌体が多かった．

2．培養

Fig. 2 Isolate 1047 stained by Gramʼs and Ziehl-Neelsen methods Isolate 1047 was found in a), b), and c). Staphylococcus aureus was used  as  a  positive  control  for  Gram  staining.  Gram:  Gram  staining;  Z-N: 

Ziehl-Neelsen staining

Table 1 Comparison of DNA sequences similarity (%) in several re- gions  among  isolate  1047,  other  isolates  and  the  related  ATCC  type strains

Strain 16S rRNA rpoB dnaJ hsp65 ITS

1047 (8samples) 100% 100% 100% 100% 100%

164 100% 100% 99.5% 100% 98.0%

357 100% 100% 99.5% 100% 99.2%

374 100% 100% 100% 100% 100%

405 100% 100% 100% 100% 100%

M. chelonae

niacinogenes (ATCC19237) 100% 100% 99.5% 100% 99.2%

M. chelonae (ATCC35752) 100% 97.7% 95.1% 99.8% 98.8%

被検株と対照株 14 株は 28℃ では培養後 5 日後に良 好な発育を示し，15℃ では 12 日前後かかった．37℃

における培養は被検株 8 株において発育までに 10 日 を要した 1 株，3 週間 1 株，4 週間培養しても陰性だっ た 6 株であった．発育した 2 株は 28℃ 培養と比較し てコロニー数が少なかった．対照株である他の施設か ら分離された 4 株は 37℃ では 10 日前後を要した 3 株 と培養陰性が 1 株あった．M. chelonae（ATCC35752）

は 7 日 間 か か り，M. chelonae niacinogenes（ATCC 19237）は 11 日後に培養陽性となった．

3．塩基配列分析

5 遺伝子領域の塩基配列に基づく菌種の同定を行っ たところ，患者サンプル 1047 などの被検株 8 株は 16 S rRNA，rpoB，hsp65，dnaJ，ITS でそれぞれ 100％

一致し，対照株の 374 と 405 とも 100％ 一致していた が，対照株の 164 と 357 は dnaJ と ITS で違いがあっ た．さらにこの被検株 8 株はM. chelonae niacinogenes

（ATCC19237）と 16S rRNA，rpoB，hsp65では 100％

一致していたが，dnaJと ITS とではそれぞれ 2bp 違 いであった．M. chelonae（ATCC35752）とは 16S rRNA

では 100％ 一致したが，rpoBでは 7bp，hsp65では 1 bp，dnaJでは 17bp，ITS では 3bp 違いであった．（Ta- ble 1）．

4．薬剤感受性試験 MIC 測定結果

患者サンプル 1047 は Table 2の 8 薬剤においてS.

aureusと 比 較 し て 高 い MIC 値 を 示 し た．特 に Cefmenoxime，Tosufloxacin に 対 し て 128＜μg!mL であった．

5．Biofilm 形成能

被検株と対照株の 14 株は全てにウエル内側の壁 面・底に付着した大量の菌が確認されたが，陰性対照 のウエルでは付着物が認められなかった（Fig. 3）．

6．消毒薬

患者サンプル 1047 は 0.5％ 両性界面活性剤では 30 分で発育を阻止したが，0.5％ グルコン酸クロルヘキ シジンは 2 時間作用させても菌の発育を阻止すること ができなかった．

考 察

本事例は 2007 年 3 月から 2009 年 1 月までの長期間 にわたっている．この感染拡大の原因とこの事例では

Fig. 3 Biofilm formation A: isolate 1047; B: negative control

A B

Table 2 Comparison of antibiotic sus- ceptibility  test  results  between  iso- late 1047 and Staphylococcus aureus

MIC (μg/mL)

1047 S. aureus

Ofloxacin 32 0.25

Cefmenoxime ＞128 2

Moxifloxacin 8 ＜0.06

Tobramycin 2 0.25

Tosufloxacin ＞128 ND※

Levofloxacin 16 0.13

Gatifloxacin 8 ＜0.06

Erythromycin 2 0.25

※ND: not done

原因菌が分離されたのは 5 株（5 例）のみであった．

別の微生物による感染も否定できないが，M. chelonae

niacinogenesが原因と仮定した場合，その発生要因と

感染後に対応した医療機関で原因菌を検出できなかっ た要因を院内感染の発生した医療機関，本菌種，対応 した病院のそれぞれの立場から考察した．

1．院内感染発生の医療機関側の要因 1）オゾン水による消毒効果

多和田ら^７）はオゾン水が抗酸菌に対して殺菌効果が あると発表している．オゾン水に直接菌が接触すると 効果があり短時間で殺菌できるが，オゾン水は流水で あり，消毒する器材に隙間がある複雑な構造であった 場合，この隙間にオゾン水が入らなければ効果は期待 できない．本事例の院内感染を発生させた医療機関で は手術に使用した器材の滅菌をオートクレーブにて 行っていた期間（A）に患者発生はなく，2006 年 9 月頃から 2008 年 8 月頃まで殺菌（滅菌）にオゾン水 あるいはオートクレーブを使用し，この間（B）に患 者発生は 6 例であった．2008 年 9 月頃から 2009 年 1 月までオゾン水のみで殺菌していた期間（C）に 67 例が発症した．菌が証明された 5 例の患者発生は（C）

の期間であった．（Fig. 1）．

本事例の手術に使用された器材で事例発生後結核予 防会結核研究所（当研究所）に搬入される前に別の施 設でオートクレーブ滅菌された器材があり，それを当 研究所にて液体培地培養した．培養は陰性であったが，

器材内部から残留物が検出され，この残留物を用いて 16S rRNA 法による核酸の増幅を試みたが陰性であっ た．しかし，この残留物の ZN 染色で抗酸菌が検出さ れた．これによりタンパク質などの物質に本菌種が混 入して小さな器材の狭くて奥行きのある隙間に詰まっ ていたか，あるいは内部に Biofilm が形成されていた のではないかと考えられた．

2）抗酸菌の薬剤に対する自然耐性

この医療機関では手術後に細菌感染を防ぐために抗 生剤を使用していた．S. aureusのような一般細菌で あれば効果が期待できるが（Table 2），抗酸菌の中に はM. fortuitum，M. aviumなどのように多くの薬剤に 対して自然耐性の菌がある^８）．被検株もこの医療機関 で使用していた薬剤に対して自然耐性であった．

2．M. chelonae niacinogenes側の要因 1）Gram 染色に難染性であったこと

本菌種は一般病院の細菌検査室でよく行われている Gram 染色では菌体が一様に染まらず，不均一なこと があるため検出ができなかった可能性がある^９）．抗酸 菌の細胞壁はミコール酸を中心とするロウ様物質と呼 ばれる脂質が多く含まれ，クリスタルバィオレット．

ゲンチアナバイオレットなどアニリン系色素による染 色は困難である．

2）前処理のアルカリ処理に被検菌が影響を受けた 可能性がある．細菌検査室では抗酸菌の培養を行う前 に臨床材料によっては雑菌を処理・消化するために前 処理（主にアルカリ処理）を行う．この前処理が強す ぎると抗酸菌にも影響があり，菌数を減らす，あるい は死滅させる（培養陰性）可能性がある．NTM の迅 速菌の中にはこのアルカリ処理に弱い菌があり，阿部 ら^１０）はM. chelonaeは特にアルカリ処理に弱かったと 報告している．

3）培養に 5 日以上かかること

本菌種は血液寒天培地などに発育できるが，コロ ニーが直径 1mm 程度になるには 28℃ 培養で 5 日間 以上かかる．しかし，病院の細菌検査室における通常 の細菌の培養期間は数日程度であり，この日数では本 菌種の検出は困難である．

4）37℃ では発育困難

被検株 8 株のうち 6 株は 37℃ 培養が陰性であった．

このように NTM には 37℃ 培養困難で 28℃ のような 低温の方が発育の良い菌種が他にもいくつかある．例 えば，M. marinum，M. ulcerans，M. shinshuense等で ある．臨床材料が体表面に近い臨床材料は 37℃ だけ でなく 28℃（または室温）も併せて培養することが 必要である．使用する培地は抗酸菌用の培地が好まし

いが，本菌種のように血液寒天培地やミューラー・ヒ ントン培地などに発育できる菌種もある．平板培地の 場合，ビニールテープでプラスチックシャーレをシー ルすると長期の培養でも乾燥をある程度防ぐことがで きる．

3．感染後に対応した医療機関側の要因

感染後に対応した医療機関の多くは ZN 染色を行っ ていなかった．抗酸菌は ZN 染色のような抗酸性染色 で染まる菌のグループをいい，抗酸性とは石炭酸のよ うな媒染剤に溶かしてあるフクシンのような色素で一 度染まると塩酸や硫酸のような酸によって容易に脱色 されない性質をいう．本菌種は ZN 染色や蛍光染色な どの抗酸性染色を実施しなかった場合，検出は困難で あったと思われる．

上記 1．2．3．が複合的に関係して感染を拡大させ，

原因菌を検出（特定）できなかったと考えられる．

M. chelonae（ATCC35752）は 1921 年に Friedmann によって Tortoise（ウミガメ）から分離され，1986 年の Systematic Bacteriology^１０）にはM. chelonaeの中 にM. chelonaesubsp.chelonaeとM. chelonaesubsp. as- cessusが subspecies として記載されていた．現在M.

chelonaeとM. abscessusは独立 し て い る．M. chelonae による病院内の outbreak は多く報告されており，あ る病院で 6 カ月間の間に腹腔鏡検査を受けた 145 例の うち 35 例からM. chelonaeが検出された．原因として 器材を消毒するための水が汚染されていたと考えられ た．消毒用トレイの底と再使用 す る 腹 腔 鏡 器 材 の outer sleeves の中の Biofilm に原因菌が生き延びてい たという報告がある^１１）．

また，1989 年 12 月から 1990 年 9 月までの間にあ る医療機関から 14 例の患者が発生し，内視鏡，又は 気管支洗浄器からM. chelonae（abscessus）が分離され た．この時の菌は cefoxitin に高度耐性で，器材の内 側に biofilm を形成していたのではないかと考えられ た^１２）．

Meyers^１３）らによる報告ではある病院において 6 カ 月間で脂肪吸引手術を受けた 82 例の患者のうち 34 例 が皮膚に潰瘍を生じた．うち 12 例のサンプルからM.

chelonaeが検出され，ひとりの医師の office の水道水

の biofolm からもM. chelonaeが見つかった．不十分 な滅菌と器材の消毒が汚染の原因と考えられ，この事 例では同じ日に手術を受けても菌が確認された患者，

臨床的に疑われた患者，病害のなかった患者がいた．

Naveen ら^１４）は眼科におけるレーシック手術を受けた 患者がM. chelonaeによる感染症を発症し，amikacin，

azithromycin ， clarithromycin ， ciprofloxacin ， ある いはこれらの combination が効果的であったと説明し ている．

ドイツの R. Schulze-Robbecke^１５）は下水や水槽から 集めた 50 の biofilm サンプルの 90％ から抗酸菌を検 出し，一番頻度の高かったのはM. gordonaeで，他に M. chelonae，M. flavescens，M. fortuitum，M. kansasii，

M. terrae!nonchromogenicumであったと報告している．

このとき，M. chelonaeが検出された材質はゴムとポ リウレタンであった．

Jaime らの報告^５）ではM. chelonaeを含む 15 種類 の 迅速菌の biofilm 形成能試験を行ったところ，全ての 菌種において陽性であったと述べている．M. chelonae は特別な場所に生息しているのではなく，西内ら^１６）の 92 家庭における抗酸菌の環境中分布調査ではM. che-

lonaeが浴室 13 カ所と洗面所 13 カ所の排水口から検

出された．

この他に注意すべき点は本菌種における消毒薬に対 する抵抗性である．手術に使用した医療機器だけでな く，施設の水道管，タンクなど水回りの汚染の可能性 を考えるとき，消毒薬に対する抵抗性を考慮しなけれ ばならない．M. chelonaeの中にはグルタールアルデ ヒド耐性も報告^１７）されており，本研究でもグルコン酸 クロルヘキシジンに対して抵抗性があった．西内ら^１６）

は Falkinham^１８）の文献から不十分な消毒は NTM 以外 の菌を殺して，競争相手のほとんどいない状況を作り 出し，かえって NTM を増殖させる事になると引用し，

biofilm を形成した菌は薬剤や消毒薬に対して耐性に なるためより厳しい条件で消毒する事が望ましいと述 べている．

特に手術に使用した器材はオートクレーブ滅菌やガ ス滅菌などを行わなければならないが，滅菌できない 材質で消毒・殺菌を必要とする場合，使用する消毒液 の種類を選び，洗浄にはブラッシングなども必要であ る．小川ら^１９）は抗酸菌の除去としてエタノール消毒の みでは排水口の除菌効果はなかったが，ブラッシング による物理的な除菌とエタノール処理により 3 カ月間 は抗酸菌の出現を押さえることができたと述べてい る．

本研究の染色性と薬剤感受性試験の対照としてS.

aureusを使用したのは日本眼科学会の感染性角膜炎診

療ガイドライン^２０）に 1980 年代以降ニューキノロン系 抗菌点眼薬の時代となりグラム陰性桿菌よりも黄色ブ ドウ球菌やレンサ球菌などのグラム陽性球菌の検出頻 度が高くなっていると記載されているためであり，こ れらの菌種は Gram 染色で検出できるが，抗酸菌は検 出困難である．病院の検査室で ZN 染色のような抗酸 性染色を行うに当たってバイオセーフティを考慮しな ければならないが抗酸菌を検出するために重要な検査 である．このため抗酸菌が疑われたとき，臨床医から 細菌検査室への抗酸性染色依頼が感染症対策の重要な

ポイントと思われる．

謝辞：菌株を分与して頂いた慶応義塾大学病院松本 幸裕先生と非結核性抗酸菌の院内感染についてご助言 を頂きました結核予防会複十字病院の倉島篤行先生に 深謝いたします．

利益相反自己申告：申告すべきものなし 文 献

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The Outbreak of Nosocomial Infection byMycobacterium cheolnaechemovar niacinogenesand the Cause of its Spread

Yuko KAZUMI^１）, Yoshiro MURASE^１）, Kazue ISHII^２）& Shinji MAEDA^１）

1)Molecular Epidemiology and Genetic Identification Division, Department of Mycobacteria References and Research, Research Institute of Tuberculosis, Japan Anti-Tuberculosis Association,

2)Fukujuji Hospital, Japan Anti-Tuberculosis Association

Mycobacteria consist of 2 large groups : one is the tuberculosis complex, and the other is nontubercu- lous mycobacterium (NTM). Most of the NTM are generally non-virulent bacteria, but some NTMs have pathogenicity to humans. There are many reports of nosocomial infection cases caused by common bacteria such as multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa. Also, some cases of in-hospital infection due to NTM were reported. Unlike common bacteria, detection of mycobacteria is affected by various factors, such as stainability, time for colony forming, temperature and nutritionMycobacterium chelonaechemovarniacinogenes was isolated from 5 patients in 73 nosocomial infection cases (60 patients and 13 suspected cases) at a cer- tain hospital during the period from March 2007 until January 2009. One of the reasons for the expansion of infection and difficulty in identification of the bacteria was the properties of this mycobacterium. This bacte- rium was very faintly stained with Gram-staining. Therefore, this mycobacterium could only be detected at a hospital when Ziehl-Neelsen stain and the cultivation at 28℃ for more than 5 days were performed. MICs for Cefmenoxime and Tosufloxacin of the isolates were more than 128μg!mL. The isolates and type strasin ofM. chelonaechemovarniacinogeneswere also resistant to other drugs.