序 文
我が国では，MRSA に対する治療薬として，現 在 VCM，teicoplanin（TEIC），arbekacin（ABK）
の 3 薬剤が承認されている．その中でも VCM に 対する耐性菌は報告されていなかったが，近年 VCM に対して低感受性を示す MRSA が分離さ れたとの報告がなされた1）〜5）．また，S. aureusが 原 因 の IE，骨 髄 炎 は 治 療 に 難 渋 す る 症 例 が 多 く6）7），臨床での対応に苦慮している．抗菌薬の適 切な使用を再検討する必要に迫られているばかり か，それ ら の 感 染，特 に VCM 低 感 受 性 MRSA
の場合は，使用する抗菌薬の厳選が必要である．
本症例では，VCM 低感受 性 MRSA が 分 離 さ れ，菌の経時的検査により感受性変化の経過が追 えた我が国初の報告例となるため，臨床経過とと もに分離菌株に関する細菌学的検討を加え，その 結果を報告する．
材料と方法
○症例
現病歴：62 歳男性．1983 年に糖尿病を他院で指 摘され，1985 年よりインスリン皮下注射による治 療を開始した．1989 年，慢性腎不全のため血液透 析を導入し，1998 年，腎移植希望のため当院泌尿 器科に紹介され通院中であった．1999 年 6 月 23 日，屍体腎移植施行目的で当院泌尿器科に緊急入
Vancomycin が奏功しなかった Methicillin Resistant Staphylococcus
aureus による感染性心内膜炎の細菌学的検討
北里大学医学部感染症学1），泌尿器科2）
高山 陽子
1）吉田 一成
2）山口 禎夫
1）野々山勝人
1）遠藤 忠雄
1）砂川 慶介
1）（平成 13 年 1 月 24 日受付）
（平成 13 年 3 月 6 日受理）
Methicillin resistantStaphylococcus aureus（MRSA）は，院内及び術後感染症の原因菌として最も重要 な細菌の一つである．
今回，MRSA による感染性心内膜炎（以下 IE と記す）に罹患した患者に，当初 vancomycin（VCM）
を用いて治療を行ったが，有効血中濃度が維持されていたにも関わらず，奏功しなかった症例を経験し た．本症例から経時的に分離された MRSA の 3 株を，最小発育阻止濃度（MIC），fractional inhibitory concentration（FIC）index，Mu 3 寒天培地，population analysis，パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）
を用いて検討した．その結果，3 株の PFGE は一致しており，同一の MRSA が VCM の使用に伴い感受 性が低下したと考えられ，Mu 3 寒天培地，population analysis では Mu 3 株と Mu 50 株の中間のパター ンを示した．
〔感染症誌 75：473〜479，2001〕
要 旨
別刷請求先：（〒228―8555）神奈川県相模原市北里 1―
15―1
北里大学医学部感染症学 高山 陽子
Key words： drug resistance, MRSA, vancomycin, infective endocarditis
systole diastole
院となった．
入院時現症・検査成績：血圧 16880mmHg，脈 拍 60分整，体温 35.6℃，意識清明，胸腹部には異 常を認めず，心エコーでは前壁中隔の陳旧性心筋 梗塞の所見のみを認めた．
臨床経過（Fig. 1）：6 月 24 日，屍体腎移植を施 行．同 日 よ り 免 疫 抑 制 剤 と し て prednisolone
（PSL）30mg, cyclosporin 350mg を開始した．腎機
能は Cr 2〜3mgdl 前後に保持され全身状態も良 好であったが，術後 19 日目の 7 月 12 日より 39
℃台の発熱を認め，血液培養より MRSA が検出さ れた．そのため，7 月 14 日より VCM 0.5g×2日を 開 始，15 日 よ り imipenemcilastacin（IPM CS）0.25g×2日 を 併 用 し た．し か し VCM の trough 値が 10〜15µgml であったにもかかわら ず効果が見られず，発熱は持続した．7 月 14 日に Fig. 1 Clinical course
PIPC ： piperacillin MINO ： minocycline CEZ ： cefazolin ABPC ： ampicillin IPMCS：imipenemcilastacin FOM：fosfomycin VCM：vancomycin ABK：
arbekacin RFP：rifampicin ST ： sulfamethoxazole ・ trimethoprim CYA ： cy- clospolin PSL：prednisolone
Fig. 2 Echocardiogram obtained on Aug. 4th. There was a vegetation on the Mitral valve（19×14mm）.
LA：left atrium LV：left ventricle →：vegetation
Table 1 The MICs of MRSA strains isolated from this case
ST RFP ABK TEIC VCM
0.5 0.008 2
2 1 KI-89
0.5 0.008 1
4 1 KI-90
0.5 4 1 8 2 KI-85
0.5 0.008 1
8 1 Mu 3
1
＞ 512 2
8 4 Mu 50
0.5 0.008 0.5 0.5
＜ 0.25 ATCC 6538
（µ g/ml）
施行した心エコーでは，僧帽弁閉鎖不全 2゜のみで あった．7 月 21 日に IPMCS を中止．7 月 30 日感 染症部に診療依頼となり，8 月 4 日再度心エコー を施行した結果，僧帽弁前尖に疣贅を認め，IE と診断された（Fig. 2）．以後，PSL，cyclosporin を 減 量 し，MRSA の 治 療 と し て VCM に rifam- picin（RFP）を併用したが効果は認められなかっ た．治 療 を VCM＋fosfomycin（FOM），ABK＋
IPMCS へと変更したが，血中の MRSA は消失せ ず，心不全・肝不全が悪化し，8 月 27 日永眠され た．なお，sulfamethoxazole・trimethoprim 合剤
（ST 合剤）はカリニ肺炎予防のため投与されてい た．
○使用菌株
VCM による治療開始直前の 7 月 12 日（KI-89）， VCM 投 与 開 始 20 日 後 の 8 月 2 日（KI-90），35 日後の 8 月 17 日（KI-85）に血液より分離された MRSA 3 株，順天堂大学平松教授より分与された S. aureusMu 3株及び Mu 50株8），VCM感性MSSA である ATCC 6538 株を使用した．PFGE では，
1999 年 6 月 1 日〜12 月 31 日の期間の当院入院患 者の血液分離 MRSA 株 46 株も使用した．
○MIC の測定
MIC の測定は NCCLS（National Committee for Clinical Laboratory Standards）法に従い agar di- lution 法 を 用 い た．培 地 は Mueller Hinton Agar
（MHA，Difco）を 使 用 し た．上 記 菌 株 を MHA で一晩培養後，buffered saline with gelatin（BSG）
で 0.5McFarland（約 108CFUml）相当に懸濁し，
最終接種菌量を 5×104CFUml として用いた．接 種にはミクロプランター（佐久間製作所）を用い た．判定は 35℃ で 20 時間培養後の菌の生育の有 無を肉眼で確認した．
○抗菌薬の併用効果の検討
Mueller Hinton Broth（MHB，日水製薬株式会 社）で一晩培養した KI-89，90，85 の菌液を，5×104 CFUml とし，VCM と IPM を用いたチェッカー ボード法を行った．培地は MHA を使い，菌液は ミクロプランターを用いて接種した．35℃ で 20 時間培養した後，両薬剤の相互作用を FIC index で算出した．
FIC index＝｛ 併用時 MIC 値（A 薬剤）単剤時 MIC 値（A 薬剤）｝＋｛ 併用時 MIC 値（B 薬剤）単 剤時 MIC 値（B 薬剤）｝
○Mu 3 寒天培地によるヘテロ VRSA の検出方 法
MHA で一晩培養した各分離菌を，生理食塩水 5ml を用いて 1McFarland 相当に懸濁し，滅菌綿 棒にて VCM 4µgml を 含 有 す る Mu 3 寒 天 培 地
（BBL）9）に塗布した．その上に cefixime（CFIX）， cefminox（CMNX），aztreonam（AZT）含有の pa- per disk を置き，35℃ で 24 時間培養した．
○VCM に対する population analysis
MHA で 一 晩 培 養 し た 本 菌 株 を，BSG で 0.5 McFarland 相当に懸濁し，その 10 倍希釈系列液 の 100µl を VCM 含有 Brain Heart Infusion Agar
（BHIA，Difco）に塗布した．35℃ で 48 時間培養 後に生育したコロニー数を測定した．
○PFGE による検討
（1）分離菌の PFGE 型別
KI-89，90，85 に対し，制限酵素SmaI を用い，矢 野らの方法10）に従って PFGE 型別を行った．
（2）当 院 入 院 患 者 の 血 液 分 離 MRSA 株 の PFGE 型別
本症例分離株が検出されたと同時期に相当する 1999 年 6 月 1 日〜12 月 31 日の 7 カ月間に，当院 入院患者の血液から分離された MRSA 株 46 株を 同様の方法で PFGE 型別を行った．
成 績
1．分離 MRSA に対する MIC の経時的変化 Table 1 に 示 す よ う に，患 者 か ら 分 離 さ れ た MRSA は，RFP に対しては 8 月 5 日〜12 日の 8
KI−89 KI−90 KI−85
Mu 3 Mu 50
9 8 7 6 5 4 3 2 colony forming unit (Log10) 1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 concentration of VCM (µg/ml)
＊
＊
＊
＊
＊ ＊
日間使用した後に耐性化していた．VCM，ABK，
ST 合剤の MIC 値はほとんど変化していなかっ たが，TEIC の MIC 値は KI-89 が 2µgml，KI-90 が 4µgml，KI-85 が 8µgml となり，その耐性は 4 倍上昇していた．
2．併用効果
VCM と IPM の併用効果の検討を行った結果 は，FIC index が≦0.5 を相乗，＞1.2 を拮抗，＞0.5
〜≦1.2 を 相 加・不 関 と 判 定 し た と こ ろ，KI-89 では FIC index は 0.19 と相乗効果を認めた．単剤 の MIC は，VCM で 1µgml，IPM で 16µgml であったが，両薬剤の併用により VCM は 8 倍の，
IPM は 16 倍の活性増強が確認された．また，KI- 90 の FIC index は 0.19，KI-85 は 0.14 と い ず れ も 相乗効果を認めた．
3．Mu 3 培地によるヘテロ VRSA の検出 Fig. 3 に示すように，Mu 3 株はβ―ラクタム薬含 有でディスクの周囲に菌の発育を認め，Mu 50 株
はβ―ラクタム薬に関係なく培地全体に菌の発育
Fig. 3 The comparison of MRSA strains on Mu 3 agar
a：cefixime（CFIX）5µgdisk, b：cefminox（CMNX）30µgdisk, c：aztreonam（AZT）
30µgdisk
The Mu 3 strain grew on the periphery of disk containingβ-lactam antibiotic. The Mu 50 strain grew throughout the disk with theβ-lactam. The KI-85 strain had an inhibi- tory zone in the areas of highβ-lactam concentration but grew throughout the disk with lower concentration.
Fig. 4 Population analysis of clinical isolated strains against VCM
―◆―ATCC 6538 ―■―KI-89 ―△―KI-90
―×―KI-85 ―＊―Mu 3 ―●―Mu 50
The concentration of VCM concerning the inhibi- tion of growth for ATCC 6538, Mu 50, Mu 3 were 3, 11, and 5µgml, respectively. In addition, those for KI-89 and 90 were respectively 5 and 4µgml, sug- gested similar result to Mu 3. And those for KI-85 was 7µgml, intermediate between Mu 3 and Mu 50.
MM ① ② ③ ④
を認めた．KI-89，90 は培地内に数個のコロニー形 成を認めた．一方，KI-85 はβ―ラクタム薬が高濃度 にあるところでは阻止帯を形成したが，低濃度に なると Mu 50 株同様，培地全体に菌の発育が認め られた．
4．VCM に対する population analysis
Fig. 4 に示すように，VCM で増殖が完全に阻害 さ れ る 濃 度 は ATCC 6538 株 は 3µgml,Mu 50 株 は 11µgml であったが，Mu 3 株は 5µgml で，KI- 89 は 5µgml，KI-90 は 4µgml と Mu 3 株に類似 したパターンを示した．KI-85 は 7µgml で阻害さ れ，Mu 3 株と Mu 50 株の中間の値を示した．
5．分離菌の PFGE 型別
血液由来 MRSA3 株の PFGE 型別は，Fig. 5 の ように一致したパターンを示した．
6．当院入院患者の血液分離 MRSA 株の PFGE 型別
Tenover らの分類11）に従って分類したところ，
本症例分離株と indistinguishable であった株が 1 株存在した．
考 察
我々は，VCM に抵抗性の MRSA 感染症を経験 した．NCCLS の定義によるS. aureusの VCM 耐 性は，その MIC 値が 32µgml であり，低感受性は 8〜16µgml 未満に分類されている12）．しかし，感 性に分類される 8µgml 未満の MRSA でも VCM による治療に抵抗する症例が存在する9）．その原 因として，感染菌側の要因と VCM の血中，組織内 濃度が充分に得られない体内動態の要因が考えら れる．菌側の要因としては，平松らが報告してい るヘテロ VRSA（Mu 3 株）が考えられる8）．この ヘ テ ロ VRSA で あ る Mu 3 株 の VCM に 対 す る MIC 値は 2µgml であり，NCCLS の基準では明 らかに感性に分類される．しかし Mu 3 株はその 細胞中に極少数の耐性菌を含み，VCM との接触 で 容 易 に 耐 性 化 す る こ と が 明 ら か に さ れ て い る9）．従って，このような性格を持った MRSA に 感染した場合，VCM の臨床効果は期待できない と考えられる．
Fig. 1 に示すように，本症例では MRSA が確認 さ れ た 日 か ら VCM の 投 与 が 開 始 さ れ そ の trough 値も充分な濃度を維持していたが，VCM 投与中も血中から MRSA は検出され，臨床効果も 得られなかった．しかも，分離された MRSA の VCM に対する MIC 値は 1〜2µgml であった．こ れらの結果から，VCM が奏功しない MRSA であ るヘテロ VRSA の可能性が考えられ，Mu 3 寒天 培地を用いたヘテロ VRSA の検出を行った．Mu 3 寒天培地は，ヘテロ VRSA の簡易検出培地とし て花木らによって既に報告されており9），ヘテロ VRSA が VCM とβ―ラクタム薬との併用によっ て拮抗現象を示すことを原理としている．Mu 3 培地には VCM が 4µgml 添加されているため，
VCM 感性の MRSA もヘテロ VRSA も生育する Fig. 5 PFGE banding patterns of this case and KS-16.
MWM is the molecular weight marker（concatamer of lambda-phage DNA）
MM：molecular marker ：KI-89 ：KI-90
：KI-85 ：KS-16
DNAs ofSmaI section. The restriction fragments of clinical isolates from this case coincided with each other with the MRSA（KS-16）strain isolated from DNA following exposure to restriction enzymeSma I.
ことはできないが，β―ラクタム薬含有ディスクを 置くことによって VCM とβ―ラクタム薬の拮抗 現象が起こり，ヘテロ VRSA のみディスク周辺に 生育してくる．また，更に耐性度の強い菌は培地 全 面 に 生 育 す る こ と が 報 告 さ れ て い る8）．KI- 89,90 は培地上に数コロニーが検出され（Fig. 3），
かつ population analysis においても Mu 3 株と同 等のパターンを示していた（Fig. 4）．しかし KI- 85 は上記菌株とは逆に，β―ラクタム薬含有ディス ク周囲には阻止帯が形成され，残り全体に生育が 確認された．この阻止帯は VCM とβ―ラクタム薬 との相加または相乗効果が考えられるため，VCM と臨床で使用した IPM との併用効果について検 討した結果，FIC index が 0.19 になる強い相乗効 果を示した．これが，Mu 3 寒天培地で阻止帯が形 成された理由と考えられる．しかし，VCM と IPM の併用した際の臨床的効果は認められていない
（Fig. 1）．その理由は，VCM 先行投与による菌側 の変化13）か，感染菌量とin vitroで使用した菌量と の差によるものかは不明であり，今後の検討を要 する．また，population analysis の結果で，KI-85 は Mu 3 株と Mu 50 株の中間のパターンを示し，
VCM に対する耐性度は KI-89,90 と比べて明らか に上がっていた．また，Fig. 5 の PFGE より，これ ら 3 株のSmaI 切断断片 は 一 致 し て い る こ と か ら，VCM 治療中に同一の MRSA がその感受性を 低下していったものと考えられる．
更に，この MRSA が院内感染か否かを調べる ために，当院入院患者の血液から分離された 46 株の MRSA について PFGE を行った．その結果，
KS-16 株のみが本症例の MRSA 株と一致してい た（Fig. 5）．しかし VCM と TEIC に対する MIC 値はいずれも 0.5µgml であり，Mu 3 培地を用い たヘテロ VRSA の検出も陰性であった．この結果 からだけでは本症例の MRSA が院内感染による ものか，保菌によるものか明確にできなかった．
我々の調べ得た範囲では，VCM 低感受性菌に よる感染症例で詳細な臨床経過が判明している報 告例は 5 例1）2）14）15）あり，これらを検討すると，すべ ての患者で MRSA の先行感染があり，VCM によ る治療を長期に繰り返し行っているにも関わら
ず，VCM の臨床効果が得られていないことが解 り，本症例は上記内容と全く同一の様相を呈して いた．この結果は，Mu 3 寒天培地で検出される MRSA は臨床的に VCM に対して抵抗性を持っ た菌であり，MIC 値のみの結果では臨床効果を予 測することは困難であることを示唆している．ま た IE の場合，TDM にて有効血中濃度を維持して いるにも関わらず疣贅内に抗菌薬が侵入しにくい ことも治療効果が得られない要因の一つと考えら れる．難治性 MRSA 感染症を見たとき，IE や骨髄 炎，膿瘍などの抗菌薬移行性が低下する要因を考 慮する必要があると考えられた．
VCM 療法が難航する症例の治療方針として，
VCM 低 感 受 性 の MRSA を 念 頭 に 起 き，ま ず VCM を不必要に長期投与しないことが重要であ る．特にヘテロ VRSA は VCM とβ―ラクタム薬が 拮抗するため，それらの併用には注意が必要であ る16）．しかし，VCM 低感受性の MRSA に対して，
高濃度のβ―ラクタム薬とは相加・相乗作用が認 められる14）17）との報告もあり，VCM とβ―ラクタム 薬の併用に関する統一された見解は示されていな い．治療薬としては他系統の ABK，併用効果が増 強する ABK＋SBTABPC3）9）や，TEIC＋β―ラクタ ム薬の併用などへの変更を考慮する13）18）．
VCM は，MRSA 感染症に対して効果的な治療 薬であり，現在でもほとんどの MRSA は VCM に対して感受性である．しかし，VCM 耐性もしく は低感受性 MRSA は，アメリカ，チェコスロバキ ア，ブラジル9）など，世界各地で確認されてきてい ることは事実であり，VCM の乱用によって更に 増加する危険性も考えられる．将来的に，このよ うな事態を回避するためにも，VCM を適切に使 用するガイドラインの作成が急務である．
謝辞：本検討について御助言頂きました順天堂大学細 菌学教室講師，花木秀明先生に深謝致します．
文 献
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Investigation of Infective Endocarditis Clinical Isolates of Methicillin Resistant Staphylococcus aureusNon-responsive to Vancomycin
Yoko TAKAYAMA1）, Kazunari YOSHIDA2）, Yoshio YAMAGUCHI1）, Masato NONOYAMA1）, Tadao ENDO1）& Keisuke SUNAKAWA1）
Dept. of Infectious Diseases1）, Dept. of Urology2）Kitasato Univ. School of Med.
Methicillin resistantStaphylococcus aureus（MRSA）is one of the most important strains which in- duce hospital and post-operative infection.
In cases of infective endocarditis in which VCM was not efficacious, MRSA strains were chrono- logically isolated at three different times and examined with the following parameters：minimum in- hibitory concentration（MIC）, fractional inhibitory concentration（FIC）index, Mu 3 agar, population analysis, pulse field gel electropholesis（PFGE）.
The PFGE banding patterns of the three MRSA isolates were the same, therefore, it was con- cluded that the same strain of MRSA was selected for reduced susceptibility. A pattern of Mu 3 and Mu 50 was demonstrated under population analysis.
