マイクロチップを用いた簡便・迅速・高
感度なマイクロ
RNA検出
理化学研究所
前田バイオ工学研究室
専任研究員
細川
和生
Point-of-care testing (POCT) 「その場」診断
患者治療の現場で生化学的な検査 （非POCT = 従来の典型的なやり方）病院
検査会社
検体（血液など） 結果，２－３日後 (POCT)病院，自宅，野外など
検体 結果 数秒～数十分 即座に次の手（処置・隔離・精密検査） 時間・労力・コスト・リスクの最小化 インフラのない途上国で大きな潜在市場（携帯電話が固定電話より先に普及） 病院 病院 病院 検査デバイス （血糖値センサ ーなど） 被験 者マイクロ
RNAとがん診断
長さ２０塩基程度の非翻訳性RNA
標的メッセンジャーRNAに結合して，その発現を抑制 ヒトで1000種類以上あり，60% 以上の遺伝子を調節
分泌型（循環）マイクロRNA （Pritchard et al., Cancer Prev. Res. 2012, 5, 492)
2008年の発見以来，疾患との関連200報以上 うち，血中の固形がんマーカーとして少なくとも79 種類 miR-21 卵巣がん，胃がん，肺がんなどで上昇 let-7a 乳がん，胃がんなどで下降 miR-141 卵巣がん，前立腺がんで上昇 miR-143 大腸がん，前立腺がんで下降 miR-500 肝臓がんで上昇
マイクロ
RNAの検出・定量
定量逆転写
PCR
Chen et al., Nucleic Acids Res. 2005, 33, e179
高感度 （数コピー～） 高価で複雑な装置が必要
マイクロアレイ（
DNAチップ）
高スループット（網羅的） 長時間（数時間～）今のところ，
POCTに適した方
法は確立していない
マイクロ流体チップ（マイクロチップ）を使うと
マイクロチップ 試料体積 0.5 µL 測定時間 20 分 （標識不要） 検出限界 1 pM スポット数は，今のところ６ 0.2 mmPOCTに有望
マイクロ流体チップ（マイクロチップ）とは
マイクロチップでの固相反応
測定時間
: 10~30 min
試料体積
: 約 1 L
新しい
POCTとして有望
外部ポンプが必要
装置全体としては複雑・大型・高価
ガラス マイクロ流路 PDMS （シリコーンゴム） 幅 100 m 高さ 25 mマイクロ流路を持った板
（断面図）
（マイクロアレイ）
（数時間～１日）
（約
100 L）
マイクロチップでの固相反応が速い理由
溶質が拡散すべき距離の短縮
ミリメートル流れ
マイクロ メートル拡散のスケール則
時間 ～ （距離）
2／（拡散係数
D）
水中のタンパク質
D ~ 10
-6cm
2/s
距離
1 mm -> Time ~10
4s = 2.8 h
距離
10 m -> Time ~ 1 s
拡散律速マイクロチップ
POCT 実現に向けての課題
多くの場合，現実はもっと複雑
スパゲッティ状の配管と，それにつながるポンプや電磁弁た ち．段取り時間，スペース，コスト，熟練，忍耐力本研究の最終ゴール
小型で安価なマイクロチップPOCTの実現アプローチ
機械的な外部装置を最小限にする （電気的・光学的な装置は，すでに十分小型で安価． ex. 携帯DVDプレイヤー）過去１０年，多くの人がこういう写真
にだまされてきた
今のところ，あくまで夢
自律駆動マイクロチップ
(無動力マイクロチップ，power-free microchip, degas-driven microchip) 外部ポンプ・バルブ・動力を必要としない
PDMS（ゴム）の空気溶解性を利用して溶液を注入
原理 ＰＤＭＳには，多量のガスが溶け込む．大気中では，ＰＤＭＳ 1 体積あたり約 0.1 体積（ＳＴＰ） の空気が溶け込んでいる． ガスの溶解度は，ヘンリーの法則に従う．液体と同じ． （溶解度）＝（溶解度係数）ｘ（環境のガス分圧） ＰＤＭＳを真空中に置くと，脱気される．これを大気中に戻すと，再び空気を吸い込む．→ＰＤ ＭＳチップ自身にエネルギーを蓄えることができる． 自律駆動マイクロチップ 方法 真空チャンバ 60 min 1 ～ 4 min 空気 セロテープ を貼る ～ 0.5 L
自律駆動マイクロチップの動作 0 s 10 s 70 s 80 s 空気がPDMSに 再溶解する ピペット 0.5 mm この状態で一時停 止（表面張力） 次の液を滴下する と，また流れる ピペット 液が吸い込ま れる
capturing probe DNA 1(v/v)% glutaraldehyde 310 K, 2 h 310 K, 1 h in water NH2-DNA 100 μM 3’‐GUC UUA GGA ACG GGU CCA CGU A‐5’
-N=C5=N‐C6‐TTT TTT TTT TTT TTT CAG AAT CCT TGC CCA GGT GCA T ‐ biotin
Glass Amino-modified Glass substrate DNA immobilized Glass substrate PDMS Left inlet Center inlet Right inlet
miR500a-3p (miR500) : potential diagnostic marker for liver cancer
(Yamamoto et al., Biomarkers (2009) )
hydrophobization
Blocking buffer 0.5 µL Blocking buffer 1 µL Blocking buffer 0.5 µL Target miR500 x pM, 0.5 µL Biotinylated DNA 10 nM, 1 µL Blocking buffer 0.5 µL FITC-SA 140 nM, 3 μL (7.5 μg/mL) Bio-anti-SA 170 nM, 6 µL (25 μg/mL) FITC-SA 140 nM, 3 μL (7.5 μg/mL)
Left inlet Center inlet Right inlet
Step 1 3 min Step 2 5 min Step 3 ~10 min 層流樹状 増幅法
microRNA
検出プロトコル
Laminar Flow‐assisted Dendritic Amplification (LFDA)
F-SA Bio-anti-SA Probe DNA MiRNA (18~25 bps) Glass substrate Probe DNA Biotinylated DNATwo amplification reagents, FITC-labeled strepravidin (F-SA) and biotinylated anti-streptavidin (Bio-anti-SA), were supplied from different microchannel branches to a common microchannel where a biotynylated DNA had been bound to the glass substrate via miRNA.
microRNA
蛍光シグナル
miR500 10 pM blank probe DNA1 min
100 µm 2000 probe DNA6 min
profile area 100 µm blank signal0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 0.1 1 10 100 1000 Signal Int.
/ blank Int. [a.u.]
MiRNA500 concentration [pM]
LOD of miR500a-3p : 1.3 pM (0.65 amol = 3.9 × 105 copies)
3σ line MiR500 concentration [pM] Signal int. / blank Int. [a.u.] n = 3 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 0.1 1 10
