北海道医療大学学術リポジトリ
羅布麻の機能性食品としての有効性とその開発研究
著者
香川 珠実
学位名
博士（薬学）
学位授与機関
北海道医療大学
学位授与年度
平成25年度
学位授与番号
乙第104号
URL
http://id.nii.ac.jp/1145/00006640/
羅布麻の機能性食品としての
有効性とその開発研究
平成 25 年度
香川 珠実
略 語 集
ACE：angiotensin-converting enzyme, アンギオテンシン変換酵素 ACh：acetylcholine, アセチルコリン A/G：albumin-globulin ratio, アルブミン・グロブリン比 Alb：albumin,アルブミン ALP：alkaline phosphatase, アルカリホスファターゼ ALT：alanine aminotransferase, アラニンアミノトランスフェラーゼAPTT：activated partial thromboplastin time, 活性化部分トロンボプラスチン時間
AST：aspartate aminotransferase, アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
AUC：area under the blood concentration time curve, 血中濃度曲線下面積 BASO：basophil, 好塩基球
BIL：bilirubin, ビリルビン BMI：body mass index, 肥満指数
BSA：bovine serum albumin, ウシ血清アルブミン BUN：blood urea nitorogen, 尿素窒素
Ca：calcium, カルシウム
ChE：cholinesterase, コリンエステラーゼ Cl：chloride, 塩素
Cmax：maximum drug concentration, 最高血中濃度
CMC：sodium carboxymethyl cellulose, カルボキシメチルセルロースナトリウ ム
Crea：creatinine, クレアチニン
DAB：3,3’-diaminobenzidine, 3,3’-ジアミノベンジジン
EDHF：endothelium-derived hyperpolarizing factor, 内皮由来過分極因子 EDTA：ethylenediamine-tetraacetic acid, エチレンジアミン四酸
eNOS：endothelial NO synthase, 内皮一酸化窒素合成酵素 EOSIN：eosinophil, 好酸球
Glu：glucose, グルコース
γ-GTP：γ-glutamyl transpeptidase, γ-グルタミルトランスぺプチダーゼ HCT：hematocrit, ヘマトクリット
Hgb：hemoglobin, ヘモグロビン HP：hyperoside, ハイペロサイド
HPLC：high performance liquid chromatography, 高速液体クロマトグラフィー i.d.：intraduodenal, 十二指腸内 i.p.：intraperitoneal, 腹腔内 IP：inorganic phosphorus, 無機リン i.v.：intravenous, 静脈内 IQ：isoquercitrin, イソクエルシトリン K：potassium, カリウム KET：ketone body, ケトン体 K-U：urine K, 尿カリウム
LC/MS/MS：liquid chromatography-tandem mass spectrometry, 液体クロマトグラ フィー・タンデム質量分析法
LLE：Luobuma leaf extract, 羅布麻茶葉エキス
L-NAME：NG-nitro-L-arginine methyl ester, NG-ニトロアルギニンメチルエステル LPH ：lactase phlorizin hydrolase,ラクターゼフロリジン分解酵素
LYMPH：lymphocyte, リンパ球
MCHC：mean corpuscular hemoglobin concentration, 平均赤血球色素濃度 MCV：mean corpuscular volume, 平均赤血球容積
MCH：mean corpuscular hemoglobin, 平均赤血球色素量 MONO：monocyte, 単核白血球 Na：sodium, ナトリウム NA：dl-noradrenaline, ノルアドレナリン Na-U：urine Na, 尿ナトリウム NO：nitric oxide, 一酸化窒素 OB：occult blood, 潜血
PBS：phosphate buffer,リン酸緩衝液 PLT：platelets, 血小板
PRO：protein, 蛋白
PT：prothrombin time, プロトロンビン時間 RBC：red blood cells, 赤血球数
RET：reticulocytes, 網状赤血球 Rf：retention factor, 相対移動距離
SD ：sodium deoxycholate, デオキシコール酸ナトリウム SEG：segmented neutrophil, 分葉核好中球
SGLT-1 ： sodium-dependent glucose transporter, グ ル コ ー ス ト ラ ン ス ポ ー タ ー SHR：spontaneously hypertensive rats, 高血圧自然発症ラット
SMA：smooth muscle actin, 抗ヒト平滑筋アクチン STAB：stab cell, 桿状核白血球 T-Bil：total bilirubin, 総ビリルビン T-Cho：total cholesterol, 総コレステロール TEA：tetraethylammonium, テトラエチルアンモニウム TG：triglyceride, トリグリセライド TLC：thin-layer chromatography, 薄層クロマトグラフィー
Tmax：maximum drug concentration time, 最高血中濃度到達時間 TP：total protein, 総蛋白
URO：urobilinogen, ウロビリノーゲン WBC：white blood cells, 白血球数
Abstract
Studies on the effectiveness and development of Luobuma (Apocynum venetum L.) as a functional food
Tamami Kagawa
Apocynum venetum L., commonly known as Luobuma in China, is a traditional and popular Chinese herb with a long history of use as a medicine and tea. Some studies have reported an antihypertensive effect of A. venetum leaves, but the detailed mechanism underlying its action is unclear. To evaluate the therapeutic effect of A. venetum leaf extract (LLE) as a functional food against hypertension, the author evaluated its cardiovascular effects, toxicological safety in rats, and hypotensive properties in humans.
1. Thin layer chromatography on an RP-18 plate using water-acetic acid-methanol (6:2:1) as a solvent system was employed for chemical differentiation of authentic Luobuma (A. venetum L.) from Poacynum hendersonii (Hook f.) Woodson, which is mistakenly distributed as Luobuma in some Chinese markets. High-performance liquid chromatography on a Navi C18-5 column using acetonitrile-water-acetic acid (50:350:20) as the solvent system was used for quantitative analysis of the major flavonoids, hyperoside (HP) and isoquercitrin (IQ) (Fig. 1), in raw materials, LLE, and tea made from Luobuma as the quality control.
2. The effect of LLE on blood pressure and its mechanism were examined using LLE that was chronically administered orally to unanesthetized spontaneously hypertensive rats (SHR) and to normotensive Wistar Kyoto (WKY) rats. Administration of LLE caused a decrease in blood pressure only in SHR in a dose-dependent manner. Next, under anesthesia, LLE was intraduodenaly administered to SHR or Sprague Dawley rats (SDR). In this experiment, LLE did not have an effect on either noradrenaline-induced increase or acetylcholine-induced decrease in blood pressure in SHR. LLE did not show any effect on angiotensin I-induced increase in blood pressure in SDR. The vasodilator effect of LLE on the rat mesenteric vascular bed was also tested. In a perfused mesenteric vascular bed with active tone and intact endothelium, perfusion of LLE (100 pg/ml to 100 mg/ml for 15 min) caused dose-dependent vasodilation, which was attenuated by chemical ablation of the endothelial layer. The author also performed experiments with an inhibitor of endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF) in a blood vessel relaxation reaction. The results suggested that the vasodilation induced by LLE was endothelium dependent and mediated by the EDHF pathway, which involves the activation of K+ channels. Higher concentrations of LLE may enhance nitric oxide (NO) production/release and thereby cause vasodilation.
weight) was chronically administered orally to unanesthetized SHR. A significant antihypertensive effect was observed in the [HP + IQ] group but not in the other two groups. In addition, after a 7-week administration of [HP + IQ], the thickness of the media layer decreased, whereas the endothelial NO synthase activity in the coronary artery and NO concentration in plasma significantly increased. [HP + IQ] improved endothelial function, and the
antihypertensive effect of [HP + IQ] was exerted on NO-mediated endothelium-dependent vasodilation. Furthermore, the concentration of quercetin metabolites in plasma was measured for 24 h using liquid
chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) after enzymatic hydrolysis. During administration of [HP + IQ], the concentration of quercetin metabolites in plasma did not change significantly and was mostly constant for 24 h compared with that during the single administration of HP or IQ. Therefore, it is suggested that the
antihypertensive effect of [HP + IQ] results from the differences in the plasma concentration of the metabolites HP and IQ between combined and single administrations.
4. To evaluate the toxicological safety of LLE, repeated doses were administered to male and female rats for 90 days. The 90-day administration of repeated doses of LLE at 1,000 mg/kg/day or 2,000 mg/kg/day to Wistar rats caused no abnormalities in external appearance or behavior. No significant toxic effects were observed in hematological, biochemical, and urine tests. No changes were observed in either absolute or relative weight of organs, in macroscopic findings, or in histological findings at the end of the treatment period. Consequently, oral administration of LLE at 2,000 mg/kg/day to both male and female rats did not produce any toxicologically significant effects, showing a high safety level.
5. Hypotensive properties and safety of a beverage containing LLE were examined in humans in a randomized, double-blind, placebo-controlled, and parallel-group study. The subjects were adult males and females with high normal blood pressure or mild hypertension who were not taking any hypotensive medication. The test beverage or placebo was given once a day for 12 weeks. The results revealed that the systolic and diastolic blood pressures were significantly lowered after 8 weeks of dietary supplementation in the test group, but not in the placebo group. Thus, these results demonstrated the benefits of the beverage containing LLE in subjects with high normal blood pressure or mild hypertension.
目 次
諸言 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 1 第 1 章 羅布麻の基原植物 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 4 第 1 節 羅布麻葉の確認試験・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 4 第 1 項 背景 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 4 第 2 項 実験方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 5 (1) 羅布麻茶葉及び羅布麻茶葉エキスの調製 ・・・・・・・・・・ 5 (2) 実験材料 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 5 (3) 薄層クロマトグラフ法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・ 5 (4) 羅布麻葉（A. venetum を基原）の確認試験 ・・・・・・・・・ 6 (5) P. hendersonii（白麻）を基原とする場合 ・・・・・・・・・・ 6 第 3 項 結果 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 6 (1) 確認試験 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 6 第 4 項 考察 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 7 第 2 節 hyperoside と isoquercitrin の定量 ・・・・・・・・・・・・・・ 9 第 1 項 背景 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 9 第 2 項 実験方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 9 (1) 実験材料 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 9 (2) 羅布麻葉 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 9 (3) 羅布麻茶液 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 10 (4) 液体クロマトグラフ法の測定条件 ・・・・・・・・・・・・・ 10 第 3 項 結果 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 10 第 4 項 考察 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 10 第 2 章 羅布麻茶葉エキスの降圧作用とそのメカニズム ・・・・・・・・ 12 第 1 節 ラットを用いた羅布麻茶葉エキス経口投与試験・・・・・・・ 12第 1 項 背景 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 12 第 2 項 実験方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 12 (1) 実験材料 (羅布麻茶葉エキスの調整) ・・・・・・・・・・・・ 12 (2) 実験動物 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 13 (3) 投与方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 13 (4) 測定方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 13 (5) 統計処理 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 13 第 3 項 結果 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 14 (1) 高血圧自然発症ラットにおける血圧への影響 ・・・・・・・・ 14 (2) 高血圧自然発症ラットにおける体重及び摂餌量への影響 ・・ 14 (3) ウィスター京都ラットにおける血圧への影響 ・・・・・・・・ 15 (4) ウィスター京都ラットにおける体重への影響 ・・・・・・・ 16 第 4 項 考察 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 17 第 2 節 ラットを用いた羅布麻茶葉エキス十二指腸内投与試験 ・・・・ 18 第 1 項 背景 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 18 第 2 項 実験方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 18 (1) 実験材料 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 18 (2) 使用薬物 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 18 (3) 実験動物 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 18 (4) 測定方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 19 (5) 投与方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 19 ⅰ) 十二指腸内単回投与時の降圧と用量反応性 (高血圧自然発症ラ ッ ト に お け る 検 討 ) ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 1 9 ⅱ) ノルアドレナリンによる昇圧及びアセチルコリンによる降圧作 用に対する影響 (高血圧自然発症ラットにおける検討)・・ 19 ⅲ) angiotensinⅠの昇圧作用に対する影響 (Sprague Dawley ラット に お け る 検 討 ) ・・・ ・・・ ・・ ・・・・ ・・・ ・・ ・ 20 (6) 統計処理 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 20 第 3 項 結果 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 20
(1) 十二 指 腸内 単 回 投与 時 の降 圧と 用 量 反 応 性 (高 血圧 自 然 発 症 ラ ット における検討)・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 20 (2) ノルアドレナリン による昇圧及び ア セチルコリン による 降圧作用に
対する影響 (高血圧自然発症ラットにおける検討) ・・・・・・ 21 (3) angiotensinⅠの昇圧作用に対する影響 (Sprague Dawley ラットにおけ
る 検 討 ) ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 23 第 4 項 考察 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 24 第 3 節 ラット腸間膜動脈を用いた羅布麻茶葉エキス灌流試験 ・・・・ 26 第 1 項 背景 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 26 第 2 項 実験方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 26 (1) 実験材料 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 26 (2) 使用薬物 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 26 (3) 実験動物 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 27 (4) 摘出腸間膜動脈血管床標本の灌流 ・・・・・・・・・・・・・ 27 (5) 血管内皮細胞の化学的除去 ・・・・・・・・・・・・・・・・ 27 (6) 実験プロトコール ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 28 (7) 統計処理 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 29 第 3 項 結果 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 29 (1) 羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス の 内 皮 保 持 標 本 及 び 内 皮 除 去 標 本 に お け る 血 管 弛緩作用 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 29 (2) 羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス の 血 管 弛 緩 作 用 に 対 す る 各 種 内 皮 由 来 弛 緩 因 子 阻害薬の影響 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 30 (3) 羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス の 血 管 弛 緩 作 用 に 及 ぼ す 抗 ム ス カ リ ン 薬 の 影 響 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 34 第 4 項 考察 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 35 第 3 章 羅布麻茶葉エキス含有フラボノイドの降圧作用と血管機能改善効 果 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 37 第 1 節 羅布麻茶葉エキス含有フラボノイドの降圧作用 ・・・・・・ 37
第 1 項 背景 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 37 第 2 項 実験方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 37 (1) 実験材料 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 37 (2) 使用薬物 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 37 (3) 実験動物 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 37 (4) 投与方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 38 (5) 血圧，体重及び摂餌量の測定及び一般症状の観察 ・・・・・ 38 (6) 統計処理 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 38 第 3 項 結果 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 38 (1) 羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス 含 有 フ ラ ボ ノ イ ド の 高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト に お ける血圧への影響・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 38 (2) 羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス 含 有 フ ラ ボ ノ イ ド の 高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト に お ける体重及び摂餌量への影響 ・・・・・・・・・・・・・・・ 39 第 4 項 考察 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 42 第 2 節 羅布麻茶葉エキス含有フラボノイドの血管機能改善効果 ・・ 43 第 1 項 背景 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 43 第 2 項 実験方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 43 (1) 実験材料 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 43 (2) 使用薬物 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 43 (3) 実験動物 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 44 (4) 採血及び心臓摘出 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 44 (5) 血 管 平 滑 筋 ア ク チ ン 及 び 内 皮 一 酸 化 窒 素 合 成 酵 素 の 免 疫 組 織 化 学 染色と形態計測・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 44 (6) 血中一酸化窒素濃度測定 ・・・・・・・・・・・・・・・・ 45 (7) 統計処理 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 45 第 3 項 結果 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 45 (1) 血管中膜の厚さ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 45 (2) 内皮一酸化窒素合成酵素の活性 ・・・・・・・・・・・・・・ 47 (3) 血中一酸化窒素濃度 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 47
第 4 項 考察 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 48 第 3 節 羅布麻茶葉エキス含有フラボノイドのバイオアベイラビリティー51 第 1 項 背景 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 51 第 2 項 実験方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 53 (1) 実験材料 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 53 (2) 使用薬物 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 53 (3) 実験動物 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 53 (4) 投与方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 53 (5) 血漿サンプル ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 53 (6) 血中ケルセチン代謝物濃度測定 ・・・・・・・・・・・・・ 54 (7) 統計処理 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 55 第 3 項 結果 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 55 第 4 項 考察 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 59 第 4 章 羅布麻茶葉エキスの反復投与毒性試験 ・・・・・・・・・・・ 62 第 1 項 背景 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 62 第 2 項 実験方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 62 (1) 実験材料 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 62 (2) 実験動物 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 62 (3) 投与方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 62 (4) 一般症状の観察及び体重及び摂餌量の測定 ・・・・・・・・ 63 (5) 血液学的検査 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 63 (6) 血液化学的検査 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 63 (7) 病理学的検査 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 64 (8) 尿検査 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 64 (9) 統計処理 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 65 第 3 項 結果 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 65 (1) 一般症状の観察及び体重及び摂餌量の測定 ・・・・・・・・・ 65 (2) 血液学的検査 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 66
(3) 血液化学的検査 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 67 (4) 病理学的検査 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 68 (5) 尿検査 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 70 第 4 項 考察 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 70 第 5 章 羅布麻茶葉エキスのヒト試験での降圧効果 ・・・・・・・・・・ 72 第 1 項 背景 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 72 第 2 項 実験方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 73 (1) 試験食 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 73 (2) 対象者 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 74 (3) 投与方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 75 (4) 試験スケジュール ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 75 (5) 検査方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 76 (6) 統計処理 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 77 第 3 項 結果 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 77 (1) 血圧及び脈拍数 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 77 (2) 体重及び肥満指数 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 80 第 4 項 考察 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 81 総括 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 84 謝辞 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 86 引用文献 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 87
学位論文の基礎となる報文
香川珠実，中澤慶久，高橋豊，鬼塚重則，西部三省, 羅布麻葉の確認試験とフ ラボノイド成分の定量について, Natural Medicines, 58, 295-298 (2004).
香川珠実，中澤慶 久 ，田頭栄治郎，高 橋 豊，鬼塚重則，西 部 三省, 羅布麻 (紅 麻 ： Apocynum venetum L.) 葉 エ キ ス の 降 圧 作 用 に 関 す る 研 究 (1), Natural Medicines, 58, 109-112 (2004).
香川珠実，中澤慶 久 ，田頭栄治郎，高 橋 豊，鬼塚重則，西 部 三省, 羅布麻 (紅 麻 ： Apocynum venetum L.) 葉 エ キ ス の 降 圧 作 用 に 関 す る 研 究 (2), Natural Medicines, 58, 299-302 (2004).
田川智恵，香川珠 実 ，中澤慶久，鬼塚 重 則，西部三省，川 崎 博己, 羅布麻 (紅 麻：Apocynum venetum L.) 葉エキスの降圧作用に関する研究 (3), YAKUGAKU ZASSHI, 124, 851-856 (2004).
梶本修身，中澤慶久，鬼塚重則，高橋豊，香川珠実，西部三省，薮根光晴，梶 本佳孝, 燕龍茶フラボノイド含有飲料の正常高値血圧者および軽症高血圧者に 対する降圧効果, Health Sciences, 21, 115-129 (2005).
香川珠実，田川智恵，金澤浩司，中澤慶久，西部三省，賀来 亨, 羅布麻 (紅麻： Apocynum venetum L.) 葉エキスの降圧作用に関する研究 (4) ～In Vivo ハイペ ロサイドとイソクエルシトリンの降圧作用と血管機能改善～, Health Sciences, 23, 191-199 (2007).
香川珠実，田川智恵，金澤浩司，中澤慶久，西部三省, 羅布麻 (紅麻：Apocynum venetum L.) 葉エキスの降圧作用に関する研究 (5) ～ハイペロサイドとイソク
エ ル シ ト リ ン の 体 内 吸 収 と 血 中 代 謝 物 濃 度 ～ , Health Sciences, 23, 200-209 (2007).
Kagawa T., Nishibe S., Wada K., A repeated dose 90-day oral toxicity study of Luobuma (Apocynum venetum L.) leaf extract in rats, Health Sciences, 29, 85-92 (2013).
諸
諸
諸
諸
言
言
言
言
高 血 圧 は, 別 名 サ イ レ ン ト ・ キ ラ ー と も 呼 ば れ, 自 覚 症 状 が 無 い ま ま に 脳 卒 中 や 心 筋 梗 塞 等 の 合 併 症 を 引 き 起 こ す た め, 日 本 人 の 死 因 上 位 を 占 め る こ れ ら 疾 病 の 大 き な リ ス ク フ ァ ク タ ー と な っ て い る. さ ら に, 血 圧 は メ タ ボ リ ッ ク シ ン ド ロ ー ム の 診 断 基 準 の ひ と つ に も な っ て い る. メ タ ボ リ ッ ク シ ン ド ロ ー ム は, 内 臓 脂 肪 型 肥 満 に 高 血 糖 ・ 高 血 圧 ・ 脂 質 異 常 症 が 複 合 的 に 発 症 し た 状 態 と 定 義 さ れ, 1) そ の 概 念 は, 不 適 切 な 生 活 習 慣 か ら 生 じ る 過 栄 養 を 基 盤 に 近 年 増 加 し て き た 心 血 管 病 の 予 防 や 対 策 に 効 果 的 で あ る. メ タ ボ リ ッ ク シ ン ド ロ ー ム の 病 態 は 動 脈 硬 化 を 促 進 さ せ, 血 管 変 化 の 進 行 を 促 す こ と で, 糖 尿 病 合 併 症 や 脳 卒 中, 心 疾 患 等 の リ ス ク を 高 め る. 危 険 因 子 の 重 積 に よ り 心 血 管 病 の リ ス ク が 高 ま る た め, 高 血 圧 を 予 防 す る こ と は 動 脈 硬 化 の 予 防, ひ い て は 心 血 管 病 の 予 防 に つ な が る と 期 待 さ れ る. 厚 生 労 働 省 の 2010 年 国 民 健 康・栄 養 調 査 に よ る と, 日 本 高 血 圧 学 会 の 基 準 に 基 づ く 高 血 圧 者 は 56.1%と 約 6,000万 人 と 推 定 さ れ, 収 縮 期 血 圧140-159 mmHg, 拡 張 期 血 圧 90-99 mmHg の 軽 症 高 血 圧 者 が 39.7%, 収 縮 期 血 圧 160-179 mmHg, 拡 張 期 血 圧 100-109 mmHg の 中 等 症 高 血 圧 者 が 9.8%, 収 縮 期 血 圧 180 mmHg 以 上, 拡 張 期 血 圧 110 mmHg以 上 の 重 症 高 血 圧 者 が 2.2%で あ る (日 本 高 血 圧 学 会 の 基 準 (2000年) に よ る 名 称 を 使 用). 一 方, 収 縮 期 血 圧130-139 mmHg, 拡 張 期 血 圧 85-89 mmHg の 正 常 高 値 血 圧 者 の 割 合 は 23.1%で あ り, 軽 症 高 血 圧 者 と 合 わ せ た 60%以 上 が 重 篤 な 高 血 圧 症 に は 至 っ て い な い 状 況 に あ る と い え る. こ れ ら の 人 々 に つ い て は, 薬 物 治 療 以 外 の 効 果 的 な 予 防 対 策 が 必 要 で あ り, そ の 予 防 対 策 を 実 施 す る こ と は 国 民 の 健 康 維 持・改 善 に 大 き く 寄 与 す る と 考 え ら れ る. 厚 生 労 働 省 の2010年 国 民 医 療 費 の 概 況 に よ る と, 65歳 以 上 の 高 齢 者 医 療 費 の 32.6%を 占 め て い る の が 高 血 圧 性 疾 患 (高 血 圧 ・ 虚 血 性 心 疾 患 ・ 脳 血 管 疾 患 等) で あ る. 日 本 人 に 占 め る 高 齢 者 の 割 合 は, 今 後 ま す ま す 増 加 す る と 予 想 さ れ て い る 中, 高 齢 者 の 医 療 費 削 減 は 大 き な 課 題 で あ る. し か し, 発 症 し た 疾 病 や 障 害 を 検 診 等 に よ り 早 期 に 発 見, 治 療 や 保 健 指 導 等 の 対 策 を 行 い, そ の 重 症 化 を 防 ぐ 二 次 予 防 だ け で は 限 界 が あ り, 生 活 習 慣 の 改 善 に よ り 健 康 増 進 を 図 る こ と
で 高 血 圧 の リ ス ク を 減 ら す 一 次 予 防 の 重 要 性 は さ ら に 高 ま る と 考 え ら れ る. 従 来, 食 品 の 価 値 の 評 価 は 栄 養 と 美 味 し さ と い う 面 で 論 じ ら れ て き た. し か し, 1984-1986 年 に 実 施 さ れ た 文 部 省 特 定 研 究 「 食 品 機 能 の 系 統 的 解 析 と 展 開 」 に お い て, 健 康 増 進 に 寄 与 す る 食 品 の 働 き と い う 新 た な 概 念 が う ま れ た. こ の 研 究 の 中 で, 食 品 の 一 次 機 能 (栄 養 機 能), 二 次 機 能 (嗜 好 ・ 感 覚 機 能), 及 び 三 次 機 能 (生 体 調 節 機 能) が 提 唱 さ れ, 研 究 が 進 め ら れ た. 2001 年 に は 食 品 の 機 能 性 を 強 化 し た 食 品 が 保 健 機 能 食 品 (特 定 保 健 用 食 品, 栄 養 機 能 食 品) と し て 制 度 化 さ れ, 疾 患 の 一 次 予 防 に 対 す る 機 能 性 食 品 の 活 用 が 期 待 さ れ て い る.
羅 布 麻 (Luobuma：Apocynum venetum L.) は キ ョ ウ チ ク ト ウ 科 ア ポ シ ナ ム 属 の 宿 根 性 多 年 生 草 本 で, 中 国 で は 別 名, 紅 麻, 野 麻, 野 茶 と も 呼 ば れ て い る. 2) 中 国 の 黄 河 流 域 を 中 心 に, 西 北, 華 北, 華 東, 東 北 及 び ヨ ー ロ ッ パ, ア ジ ア の 温 帯 地 区, ま た, ア ル カ リ 性 土 質 の 荒 地 や 砂 漠, 河 岸 等 に 生 育 し, 高 さ 1-3 mに な り 全 草 に 乳 汁 を 含 む. 2-3) 枝 は 通 常 対 生 で 無 毛, 紫 紅 色 ま た は 淡 紅 色 で 葉 は 対 生, 夏 に 円 錐 花 房 を つ け, 紫 紅 色 の 小 さ い 花 を 開 く (Fig. 1). 2,3) 同 じ ア ポ シ ナ ム 属 で は, 変 種 の バ シ ク ル モ ン (A. venetum L. var. basikurumon) が 北 海 道 に 分 布
4) し,A. cannabinum及 び A. androsaemifolium が 北 米 に 分 布 す る. 5) 羅 布 麻 は, 中 国 の 薬 事 古 書 に お い て 「 澤 漆 」「 澤 漆 麻 」 と 記 載 さ れ, 古 く は 紀 元 前 32-24 年 か ら 飲 用 に 関 す る 記 載 が 見 ら れ る. 6,7) 明 代 の 朱 庸 著 「 救 荒 本 草 」 (1424 年) に は“ 若 葉 を 茶 と し て 飲 む の も 良 い ”と 記 さ れ, 李 時 珍 著「 本 草 綱 目 」 (1596 年) で は,“ そ の 若 芽 は 無 毒 で 食 べ ら れ る ” と 記 さ れ て い る. 7) ま た, 内 蒙 古 で は 羅 布 麻 の 若 い 葉 を 利 用 し, バ ー ガ ス ン チ ャ イ (bargasun chai) と い う 民 族 名 の 茶 と し て 飲 用 し て い た こ と が 報 告 さ れ て い る. 8) さ ら に 羅 布 麻 葉 は, 中 華 人 民 共 和 国 薬 典 に 1977 年 に 収 載 さ れ て 以 降, 現 代 に 至 る ま で “ 解 熱 利 尿, 肝 臓 を 鎮 め 精 神 を 安 ら か に さ せ, 高 血 圧 ・ 目 眩 ・ 動 悸 ・ 不 眠 に 用 い る ” 7,9) と さ れ て お り, 古 く か ら お 茶 や 民 間 薬 と し て 利 用 さ れ て き た. 10) 日 本 で も, 羅 布 麻 茶 は 1985 年 頃 か ら 輸 入 さ れ, 現 在 も 羅 布 麻 茶 や 燕 龍 茶 の 商 品 名 で 販 売 さ れ て い る. ま た, ア メ リ カ や カ ナ ダ に お い て も 羅 布 麻 茶 の テ ィ ー バ ッ グ 及 び エ キ ス 錠 剤 が 販 売 さ れ て い る. 羅 布 麻 葉 の 効 能 と し て, 脂 質 過 酸 化 抑 制 作 用, 11-13) 低 比 重 リ ポ 蛋 白 酸 化 抑 制
作 用, 13,14) 総 コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 作 用, 15) 抗 酸 化 作 用, 16) 肝 臓 保 護 作 用, 17) 抗 う つ 作 用 18) が 報 告 さ れ て い る. さ ら に 降 圧 作 用 に 関 し て は, Kim D.W. ら が 高 血 圧 モ デ ル ラ ッ ト に 羅 布 麻 葉 エ キ ス を 経 口 投 与 し, 有 意 な 降 圧 作 用 を 認 め た こ と を 報 告 し て い る が, 19) そ の 詳 細 な メ カ ニ ズ ム は 不 明 で あ る. 今 回, 高 血 圧 の 予 防 に 役 立 つ 機 能 性 食 品 と し て の 羅 布 麻 葉 の 有 効 性 を 検 討 す る た め, 以 下 の 研 究 を 行 っ た.
Fig. 1. Luobuma : Apocynum venetum L.
第 第 第 第 1章章 章章 羅 布 麻 の 基 原 植 物羅 布 麻 の 基 原 植 物羅 布 麻 の 基 原 植 物羅 布 麻 の 基 原 植 物 第 第 第 第 1節節 節節 羅 布 麻 葉 の 確 認 試 験羅 布 麻 葉 の 確 認 試 験羅 布 麻 葉 の 確 認 試 験羅 布 麻 葉 の 確 認 試 験 第 第 第 第 1項項 項項 背 景背 景背 景背 景 緒 言 で 述 べ た よ う に, 羅 布 麻 (A. venetum) は 中 国 か ら 中 央 ア ジ ア に か け て 広 く 分 布 し, 2,3) そ の 葉 部 を 乾 燥 し て 製 し た 生 薬“ 羅 布 麻 葉 ”は, 日 本, 中 国, ア メ リ カ 等 で お 茶 製 品 や エ キ ス 製 剤 等 に 加 工 さ れ 広 く 健 康 食 品 と し て 用 い ら れ て い る. し か し, 中 国 に お け る 羅 布 麻 葉 の 基 原 の 中 に は A. venetum の 葉 部 に 代 わ り, 繊 維 採 取 用 の 原 料 植 物 で あ っ た 近 縁 植 物 Poacynum hendersonii (Hook f.) Woodson (白 麻)
20)
の 葉 部 が 流 通 し て お り, 羅 布 麻 葉 製 品 の 製 造 に あ た っ て は あ ら か じ め そ の 基 原 を 明 ら か に し て お く 必 要 が あ る.
Nishibeら は A. venetum と P. hendersonii の 葉 部 の 外 部 形 態 な ら び に 内 部 形 態 の 研 究 か ら, そ の 形 態 学 的 な 鑑 別 は 可 能 で あ る こ と を 報 告 し て い る. 21) し か し 両 者 の 葉 部 の 外 部 形 態 は 酷 似 し て お り, 茎 部 の 外 部 形 態 等 の 全 体 の 比 較 も 行 わ な い 限 り, 葉 部 の 外 部 形 態 の み か ら 一 見 し て 両 者 を 鑑 別 す る の は き わ め て 困 難 と 思 わ れ る. こ れ ま で の 成 分 研 究 か ら A. venetum と P. hendersonii の フ ラ ボ ノ イ ド 成 分 に 相 違 の あ る こ と が 明 ら か に な っ て お り, 22) 本 章 で は, そ の 指 標 成 分 hyperoside (HP), isoquercitrin (IQ), quercetin-3-O-sophorosideに 基 づ い た 簡 便 な 薄 層 ク ロ マ
ト グ ラ フ 法 (thin-layer chromatography：TLC) に よ るA. venetum と P. hendersonii の 確 認 試 験 の 検 討 を 行 っ た (Fig. 2).
Hyperosid
hyperoside isoquercitrin quercetin-3-O-sophoroside
第 第第 第 2項項 項項 実 験 方 法実 験 方 法実 験 方 法実 験 方 法 (1) 羅 布 麻 茶 葉 及 び 羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス羅 布 麻 茶 葉 及 び 羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス の 調 製羅 布 麻 茶 葉 及 び 羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス羅 布 麻 茶 葉 及 び 羅 布 麻 茶 葉 エ キ スの 調 製の 調 製の 調 製 羅 布 麻 葉 は 中 国 の 全 国 羅 布 麻 研 究 中 心 王 振 勤 氏 の 同 定 に 基 づ き, 中 国 山 東 省 河 口 区 に 野 生 す る 羅 布 麻 か ら 採 取 し (標 本20020802-1, 日 立 造 船 に て 保 存), 以 下 の 方 法 で 羅 布 麻 茶 葉 及 び 羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス (LLE：Luobuma leaf extract) を 調 製 し た. 採 取 し た 羅 布 麻 葉 を 220-280℃ の 釜 入 機 で 殺 青 処 理 し た 後, 釜 茶 方 式 に よ り 約 150℃ 約 6 分 で 焙 煎 ・ 乾 燥 さ せ, 半 加 工 製 品 と し た. そ の 後, 約 130℃ 15 分 で 一 次 焙 煎, 約 150℃ 45 分 で 二 次 焙 煎 を 行 い 羅 布 麻 茶 葉 と し た. こ の 茶 葉 100g に 対 し, 95-100℃ の 湯 で 1,000 ml, 次 に 800 mlで そ れ ぞ れ 60 分, 2 回 抽 出 し た. 抽 出 後 濃 縮 し, 遠 心 分 離 機 で 不 溶 物 を 分 離 し た ろ 液 を 230℃ で 噴 霧 乾 燥 後, 粉 砕 し て 調 製 し た 粉 末 を LLE と し た. (2) 実 験 材 料実 験 材 料実 験 材 料実 験 材 料 A. venetum (羅 布 麻) を 基 原 と す る も の ： 羅 布 麻 茶 葉, 23) LLE,23) 羅 布 麻 葉 a (2003 年 8月 中 国 新 疆, 石 河 子 の 薬 局 で 購 入), 羅 布 麻 葉 b (2003年 8 月 中 国 天 津 の 薬 局 で 購 入), 羅 布 麻 葉 c (1999 年 7月 中 国 上 海 の 薬 局 で 購 入), 野 生 品a (2003 年 8月 中 国 山 東 省, 川 口 区 で 採 集), 野 生 品 b (2003年8月 中 国 山 東 省, 川 口 区 で 採 集), 野 生 品 c (2003年 8 月 中 国 新 疆, 石 河 子 で 採 集), 野 生 品 d (2003 年8 月 中 国 新 疆, 尉 犁 で 採 集), バ シ ク ル モ ン 栽 培 品 a (2003 年 8 月 北 海 道 医 療 大 学 薬 学 部), バ シ ク ル モ ン 栽 培 品 b (2003 年 8月 千 葉 大 学 薬 学 部). P. hendersonii (白 麻) を 基 原 と す る も の ： 羅 布 麻 茶 a (2003 年 8月 新 疆, コ ル ラ で 購 入), 羅 布 麻 茶 b (2003 年 8 月 新 疆, コ ル ラ で 購 入), 野 生 品 (2003 年 8 月 新 疆, 尉 犁 で 採 集). 標 準 品：HP (常 磐 植 物 化 学 研 究 所 か ら 購 入), IQ (フ ナ コ シ か ら 購 入), quercetin- 3-O-sophoroside (P. hendersonii か ら 単 離 22) ). (3) 薄 層 ク ロ マ ト グ ラ薄 層 ク ロ マ ト グ ラ フ薄 層 ク ロ マ ト グ ラ薄 層 ク ロ マ ト グ ラフフ 法フ法法法 TLC は RP-18 (Merck) を 用 い, 第 14改 正 日 本 薬 局 方 の 一 般 試 験 法“ 薄 層 ク ロ
マ ト グ ラ フ 法 ” の 規 定 に 準 じ て 行 っ た. (4) 羅 布 麻 葉羅 布 麻 葉羅 布 麻 葉羅 布 麻 葉 (A. venetum を 基 原を 基 原を 基 原を 基 原) の 確 認 試 験の 確 認 試 験の 確 認 試 験の 確 認 試 験 材 料 葉 の 粉 末1,000 mg (LLEは200 mg) に メ タ ノ ー ル10 ml を 加 え, 水 浴 上 で3 分 間 加 温 し, 冷 却 後, ろ 過 し, ろ 液 を 試 料 溶 液 と し た. こ の 液 に つ き, TLC 法 に よ り 試 験 を 行 っ た. 試 料 溶 液 10 µl をTLC 用RP-18 に ス ポ ッ ト し た. 次 に 水 ／ 酢 酸 ／ メ タ ノ ー ル 混 液 (6 : 2 : 1) を 展 開 溶 媒 と し て 約 10 cm 展 開 し た 後, 薄 層 板 を 風 乾 し た. こ れ に 塩 化 鉄 (III) 試 液 を 噴 霧 し,相 対 移 動 距 離 (retention factor : Rf )値 0.3 付 近 の 暗 青 色 の 主 ス ポ ッ ト (HP と IQ) を 確 認 し た. (5) P. hendersonii (白 麻白 麻白 麻白 麻) を 基 原 と す る 場 合を 基 原 と す る 場 合を 基 原 と す る 場 合を 基 原 と す る 場 合 羅 布 麻 葉 のTLCに よ る 確 認 試 験 に お い て, Rf 値 0.3付 近 の 暗 青 色 の ス ポ ッ ト (IQ) に 加 え, Rf 値 0.5 付 近 の 暗 青 色 の ス ポ ッ ト (quercetin-3-O-sophoroside) を 確 認 し た. 第 第第 第 3項項 項項 結 果結 果結 果結 果 (1) 確 認 試 験確 認 試 験確 認 試 験確 認 試 験
羅 布 麻 葉 の 確 認 試 験 で, 薄 層 板 に Silica gel 60 (Merck) を 用 い た TLC [展 開 溶 媒: ク ロ ロ ホ ル ム ／ メ タ ノ ー ル ／ 水 ／ 酢 酸 (10 : 3 : 2 : 5) ] の 場 合 は, A. venetum の 指 標 成 分 HPと IQ の ス ポ ッ ト は 重 な り ワ ン ス ポ ッ ト と し て 認 め ら れ た. さ ら に, A. venetum に 含 ま れ る ク ロ ロ ゲ ン 酸 の ス ポ ッ ト の Rf 値 が P. hendersonii の 指 標 成 分 quercetin-3-O-sophoroside の ス ポ ッ ト の Rf値 と 非 常 に 接 近 し た. RP-18に よ るTLCパ タ ー ン をFig. 3に 示 す. RP-18もA. venetumのHPとIQ の ス ポ ッ ト は 重 な り, Rf値0.3付 近 に ワ ン ス ポ ッ ト と し て 認 め ら れ た. P. hendersoni で は, Rf 値 0.3 付近の スポット に加え, Rf 値 0.5 付近 の quercetin- 3-O-sophoroside の ス ポ ッ ト が 確 認 さ れ た (Fig. 3). こ れ ら フ ラ ボ ノ イ ド 成 分 は い ず れ の ス ポ ッ ト も 塩 化 鉄 (III) 試 液 噴 霧 に よ る 検 出 が 50 ng/mlの 濃 度 ま で 確 実 で あ っ た. 基 原 の 明 ら か な 各 種 実 験 材 料 で は, A. venetum を 基 原 と す る も の 及 び 日 本 で
の 栽 培 品 A. venetum var. basikurumon の 葉 部 は す べ て Fig. 3 の 3 に, P. hendersoniiを 基 原 と す る も の は 2 に 示 す TLC パ タ ー ン と な っ た (Fig. 3). ま た, 羅 布 麻 茶 葉 は 6 に 示 す TLC パ タ ー ン と な っ た (Fig. 3).
Fig. 3. TLC Chromatogram of Luobuma
Samples: 1. quercetin-3-O-sophoroside (1 mg in 2 ml MeOH) 2. origin of Poacynum
hendersonii 3. origin of Apocynum venetum 4. HP (1 mg in 2 ml methanol) 5. IQ
(1 mg in 2 ml methanol) 6. Luobuma tea leaf
Plate : RP-18 (Merck), Solvent: water - acetic acid - methanol (6 : 2 : 1), Detection: spraying the plate with FeCl3 soln.
第 第 第
第 4項項 項項 考 察考 察考 察考 察
薄 層 板 に Silica gel 60 (Merck) を 用 い た TLC [展 開 溶 媒 : ク ロ ロ ホ ル ム ／ メ タ ノ ー ル ／ 水 ／ 酢 酸 (10 : 3 : 2 : 5) ] の 場 合 は, A. venetum と P. hendersonii の TLC パ タ ー ン は そ れ ぞ れ の ス ポ ッ ト の 位 置 が 接 近 し て い た こ と か ら, フ ラ ボ ノ イ ド の 標 品 と の 比 較 を 行 わ な い 限 りA. venetumとP. hendersoniiと の 鑑 別 は 困 難
で あ っ た. 一 方, RP-18もA. venetumのHPとIQは ワ ン ス ポ ッ ト と し て 認 め ら れ た が, も う 1つ の 指 標 成 分 P. hendersoniiか ら の quercetin-3-O-sophoroside の ス ポ ッ ト Rf 値 0.5 付 近 に は A. venetum で は 全 く ス ポ ッ ト が 認 め ら れ な か っ た (Fig. 3). こ の こ と は, HP と IQ の ス ポ ッ ト が 重 な っ て も quercetin-3-O-sophoroside の 有 無 が 両 者 の 相 違 点 に な る こ と を 示 し た こ と に な る. よ っ てRf 値 0.3付 近 に の み ス ポ ッ ト を 認 め た も の はA. venetumを 基 原 と す る も の, Rf 値 0.3付 近 に 加 え てRf 値 0.5 付 近 に ス ポ ッ ト を 認 め た も の は P. hendersonii を 基 原 と す る も の と, 両 者 の 基 原 の 確 認 は 可 能 と な っ た. 次 に 基 原 の 明 ら か な 各 種 実 験 材 料 に つ い て 確 認 試 験 の 適 用 を 試 み た. そ の 結 果, 羅 布 麻 葉 でA. venetumを 基 原 と す る も の 及 び 日 本 で の 栽 培 品A. venetum var. basikurumon の 葉 部 は す べ て Fig. 3の 3に, P. hendersoniiを 基 原 と す る も の は 2 に 示 すTLCパ タ ー ン と な り, ど の 実 験 材 料 に お い て も 基 原 の 確 認 が 可 能 で あ っ た (Fig. 3). 羅 布 麻 茶 葉 の TLC もRf 値 0.3に の み ス ポ ッ ト を 認 め, Rf 値 0.5に は ス ポ ッ ト を 認 め ず A. venetum を 基 原 と す る こ と が 確 認 で き た (Fig. 3).
第 第第 第 2節節 節節 hyperoside とととと isoquercitrin の 定 量の 定 量の 定 量の 定 量 第 第第 第 1項項 項項 背 景背 景背 景背 景 羅 布 麻 葉 の フ ラ ボ ノ イ ド 主 成 分 で あ るHPと IQ に つ い て, Taubert ら は ブ タ の 冠 動 脈 を 用 い た 試 験 で 一 酸 化 窒 素 (nitric oxidide : NO) に よ る 血 管 内 皮 依 存 性 弛 緩 作 用 24) を, Schussler ら は 心 筋 活 性 作 用 25) を 報 告 し て い る. こ れ ら フ ラ ボ ノ イ ド 成 分 は 羅 布 麻 葉 の 血 圧 に 関 与 す る 成 分 の 1 つ と 考 え ら れ る. N i s h i b e ら は す で に 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ 法 ( h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d chromatography : HPLC) に よ る 羅 布 麻 葉 中 の こ れ ら フ ラ ボ ノ イ ド 成 分 の 定 量 を 報 告 し て い る. 12 ) 今 回 は エ キ ス を 原 料 と す る お 茶 製 品 の 製 造 過 程 で, お 茶 製 品 の み な ら ず, そ の 原 料 エ キ ス, エ キ ス 原 料 の 羅 布 麻 葉 い ず れ に つ い て も 同 一 条 件 で フ ラ ボ ノ イ ド 成 分 の 含 量 測 定 が で き る 方 法 を 検 討 し た. 第 第第 第 2項項 項項 実 験 方 法実 験 方 法実 験 方 法実 験 方 法 (1) 実 験 材 料実 験 材 料実 験 材 料実 験 材 料 第 1 節 の 確 認 試 験 で 用 い た A. venetumを 基 原 と す る 試 料, 及 び LLE 0.44％ を 含 有 す る よ う 調 製 し た 羅 布 麻 茶 液 を 使 用 し た. (2) 羅 布 麻 葉羅 布 麻 葉羅 布 麻 葉羅 布 麻 葉 材 料 葉 の 粉 末 約400 mg (LLE は 100 mg) を 精 密 に 量 り, 水 で 希 釈 し た メ タ ノ ー ル (1→2) 20 ml を 加 え, 還 流 冷 却 器 を 付 け て 水 浴 上 で30分 間 加 熱 し, 冷 却 後, ろ 過 し た. 残 留 物 は, 薄 め た メ タ ノ ー ル (1→2) 20 ml を 加 え, 同 様 に 操 作 し た. 全 ろ 液 を 合 わ せ, 薄 め た メ タ ノ ー ル (1→2) を 加 え て 正 確 に 50 mlと し, 試 料 溶 液 と し た. 別 にHP及 びIQを そ れ ぞ れ 約2 mg を 精 密 に 量 り, メ タ ノ ー ル 50 ml に 溶 か し, 水 を 加 え て 正 確 に 100 ml と し, 標 準 溶 液 と し た. 試 料 溶 液 及 び 標 準 溶 液 30 µ l ず つ を 正 確 に と り 定 量 を 行 っ た. HP及 び IQ の 検 量 線 は い ず れ も 標 準 溶 液 の 調 製 法 に よ り 標 準 溶 液 10-120 µg/ml で 調 製 し, 既 報 12) と 同 じ く 良 好 な 直 線 性 と 相 関 係 数 を 得 た.
(3) 羅 布 麻 茶 液羅 布 麻 茶 液 羅 布 麻 茶 液羅 布 麻 茶 液 試 料 溶 液 30 µ l を 正 確 に と り 定 量 を 行 っ た. 検 量 線 は 前 項 で 作 成 し た も の を 用 い た. (4) 液 体 ク ロ マ ト グ ラ液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ液 体 ク ロ マ ト グ ラ液 体 ク ロ マ ト グ ラフフ 法 のフ法 の法 の法 の 測 定 条 件測 定 条 件測 定 条 件測 定 条 件 第 14 改 正 日 本 薬 局 方 の 一 般 試 験 法 “ 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ 法 ” の 規 定 に 準 じ, 絶 対 検 量 線 法 に よ り 行 っ た.
装 置 ：Jasco PU-980, Jasco CO-965, カ ラ ム ：Navi C18-5 (4.6 mm×250 mm) (和 光 純 薬 工 業), カ ラ ム 温 度：45℃ , 移 動 相：メ タ ノ ー ル ／ 水 ／ 酢 酸 (100 : 300 : 20, v/v), 検 出 器：紫 外 吸 光 光 度 計 (Jasco UV - 975), 測 定 波 長：330 nm, 流 量：1.0 ml/ 分 第 第第 第 3項項 項項 結 果結 果結 果結 果 HPLC に よ る 定 量 結 果 を Table 1に 示 す. A. venetum を 基 原 と す る 試 料 及 び 羅 布 麻 茶 液 の 全 材 料 に お い て HPと IQ の 含 有 が 認 め ら れ, 羅 布 麻 茶 葉 及 び 羅 布 麻 葉 に お け る 含 有 量 は, HPが0.10-0.42%, IQが0.13-0.38%で あ っ た. ま た, 羅 布 麻 茶 葉, 及 び こ れ を 原 料 と し て 作 製 し たLLE及 び 羅 布 麻 茶 液 に お け るHPとIQは ほ ぼ 1：1 の 割 合 で 含 有 し て い た. 第 第第 第 4444項項 項項 考 察考 察 考 察考 察 HPLC を 用 い た フ ラ ボ ノ イ ド 成 分 の 定 量 は, A. venetum を 基 原 と す る お 茶 製 品, 製 造 過 程 で の お 茶 製 品 の 原 料 エ キ ス, エ キ ス 原 料 の 羅 布 麻 葉 の い ず れ に も そ れ ぞ れ 同 一 のHP及 びIQ の 標 準 溶 液 を 用 い る こ と が で き, 羅 布 麻 製 品 の 品 質 を 管 理 す る 上 で 簡 便 性 を 与 え る こ と が で き た と 考 え る.
Table 1. Content of Flavonoids in Luobuma (%)
HP IQ
Luobuma leaf tea leaf 0.24 0.22
LLE 0.66 0.66
Luobuma tea (liquid) 2.8×10-3 (w/v) 2.9×10-3 (w/v)
Luobuma a 0.23 0.24 Luobuma b 0.28 0.26 Luobuma c 0.28 0.27 Wild plant a 0.23 0.38 Wild plant b 0.32 0.24 Wild plant c 0.22 0.24 Wild plant d 0.10 0.13 Cultivated a 0.42 0.28 Cultivated b 0.35 0.32
第 第 第 第 2章章 章章 羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス の 降 圧 作 用 と そ の メ カ ニ ズ ムの 降 圧 作 用 と そ の メ カ ニ ズ ムの 降 圧 作 用 と そ の メ カ ニ ズ ムの 降 圧 作 用 と そ の メ カ ニ ズ ム 第 第 第 第 1節節 節節 ラ ッ ト を 用 い たラ ッ ト を 用 い たラ ッ ト を 用 い たラ ッ ト を 用 い た 羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス 経 口 投 与 試 験経 口 投 与 試 験経 口 投 与 試 験経 口 投 与 試 験 第 第 第 第 1項項 項項 背 景背 景背 景背 景
羅 布 麻 葉 の 高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト (spontaneously hypertensive rats: SHR) に 及 ぼ す 影 響 に つ い て は 報 告 さ れ て い る が, 19) LLEの SHR と 正 常 ラ ッ ト の 血 圧 あ る い は 摂 餌 量, 体 重 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 述 べ た 報 告 は な い. そ こ で 今 回 はSHRと, 正 常 血 圧 ラ ッ ト の 遺 伝 的 対 照 と し て 広 く 用 い ら れ て い る ウ ィ ス タ ー 京 都 ラ ッ ト (WKY) を 用 い, そ れ ぞ れ にLLEの 混 合 飼 料 を 自 由 摂 取 さ せ, SHRの 血 圧, 摂 餌 量 及 び 体 重 に 及 ぼ す 影 響, 及 び WKYの 血 圧 及 び 体 重 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 検 討 し た. 第 第 第 第 2項項 項項 実 験 方 法実 験 方 法実 験 方 法実 験 方 法 (1) 実 験 材 料実 験 材 料実 験 材 料実 験 材 料 (羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス の 調 製の 調 製の 調 製の 調 製) LLE は 第 2 章 第 1 節 第 2 項 に 準 じ 調 製 し た. 指 標 フ ラ ボ ノ イ ド 成 分 HP 及 び IQ を HPLC に よ り 定 量 し, 26) 各 6 mg/g 含 む こ と で 品 質 の 確 認 を 行 っ た. LLE の 栄 養 学 的 評 価 を Table 2 に 示 す. 23) Mgが 多 く 含 ま れ, カ フ ェ イ ン は 含 ま れ な か っ た.
(2) 実 験 動 物実 験 動 物実 験 動 物実 験 動 物 4週 齢 の 雄 性SHR及 び 正 常 ラ ッ ト と し て 同 週 齢 のWKY (船 橋 農 場) を 購 入 後, 温 度 22.5±1.5℃, 湿 度 55±15% の 条 件 下 の 動 物 室 に て 飼 育 し た. 2 週 間 の 予 備 飼 育 後, 血 圧 及 び 体 重 を 測 定 し, 各 群 6-7 匹 の 収 縮 期 血 圧 の 平 均 値 が 等 し く な る よ う に 群 分 け し た. 飼 料 は 船 橋 農 場 のSP粉 末 飼 料 (SHR用 普 通 飼 料) 及 び 水 道 水 を 24 時 間 自 由 摂 取 さ せ た. 本 研 究 は「 実 験 動 物 の 飼 育 及 び 保 育 等 に 関 す る 基 準 」 (昭 和 55年 3 月 総 理 府 告 示 第 6 号) を 遵 守 し て 行 っ た. (3) 投 与 方 法投 与 方 法 投 与 方 法投 与 方 法 SHR に お け る 試 験 で は, 予 備 飼 育 後, LLE を 1.25% (低 用 量), 2.5% (中 用 量), 5% (高 用 量) 混 合 し た 粉 末 飼 料 を 6週 齢 か ら 7週 間 自 由 摂 取 さ せ, 8 週 目 よ り 正 常 飼 料 に 置 き 換 え た. ま た, WKYに お け る 試 験 で は, 予 備 飼 育 後, LLEを5% 混 合 し た 飼 料 を 6週 間 自 由 摂 取 さ せ た. (4) 測 定 方 法測 定 方 法 測 定 方 法測 定 方 法 収 縮 期 血 圧 の 測 定 は 39℃ 前 後 の 保 湿 器 の 中 に, ラ ッ ト を 約 3 分 入 れ た 後, 無 麻 酔 状 態 で テ ー ル カ フ 法 (ソ フ ト ロ ン) に よ り 測 定 し た. LLE 適 用 期 間 中 は, 1 週 間 ま た は 2 週 間 毎 に 血 圧, 体 重 及 び 摂 餌 量 を 測 定 し た. 摂 餌 量 は 1 ケ ー ジ (3-4匹) 毎 に 測 定 し た も の を1匹 あ た り の 摂 餌 量 に 換 算 し た. LLE摂 取 量 は, 摂 餌 量 と 飼 料 へ の LLE 混 合 率 か ら 求 め, 1 匹 あ た り に 換 算 し た. (5) 統 計 処 理統 計 処 理統 計 処 理統 計 処 理 各 試 験 群 の 測 定 値 は 平 均 値±標 準 誤 差 で 示 し た. F 検 定 に よ り 分 散 分 析 を 行 っ た 後, Scheffe’s post-hoc procedure testを 用 い て 有 意 差 検 定 を 行 っ た (有 意 差 水 準 は 5%未 満).
第 第 第 第 3項項 項項 結 果結 果結 果結 果 (1) 高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト に お け る 血 圧 へ の 影 響高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ トに お け る 血 圧 へ の 影 響に お け る 血 圧 へ の 影 響に お け る 血 圧 へ の 影 響 試 験 期 間 中 の 血 圧 の 変 化 を Fig. 4 に 示 す. LLE 投 与 5 週 目 か ら, 2.5%及 び 5% 混 入 し た 群 は 非 投 与 群 に 比 べ て 有 意 な 降 圧 作 用 を 示 し た. LLE 投 与 6 週 目 か ら は い ず れ の 群 も 有 意 な 降 圧 作 用 が 見 ら れ, 安 定 し た 昇 圧 の 抑 制 作 用 と そ の 用 量 反 応 性 が 認 め ら れ た. LLE の 混 餌 を 7 週 間 適 用 後 2 週 間 休 止 し た が, 降 圧 効 果 は こ の 間 ほ ぼ 持 続 し LLE 摂 取 中 止 に よ る リ バ ウ ン ド 現 象 は 見 ら れ な か っ た.
Fig. 4. Effect of LLE on Blood Pressure
Each value represents the mean±S.E.M. (n=7 or 6). After 3 weeks, the 1 of 7 SHR in 2.5% LLE group was neglected because of its poor growth. * p<0.05 vs control group (Sheffe’s post-hoc procedure test)
(2) 高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト に お け る 体 重 及 び 摂 餌 量 へ の 影 響高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ トに お け る 体 重 及 び 摂 餌 量 へ の 影 響に お け る 体 重 及 び 摂 餌 量 へ の 影 響に お け る 体 重 及 び 摂 餌 量 へ の 影 響
LLEを 混 合 し た 飼 料 摂 取 期 間 中 の 体 重 及 び 摂 餌 量 の 経 日 変 化 をFig. 5に 示 す. 対 照 群 と LLE を 1.25-5% 混 入 し た 群 を 比 較 し た と き, い ず れ の 群 に お い て も
体 重 及 び 摂 餌 量 に 差 は 認 め ら れ な か っ た.
Fig. 5. Effect of LLE on Body Weight (A) and Food Intake & LLE (B)
(A) Each value represents the mean±S.E.M. (n=7 or 6). After 3 weeks, 1 of 7 SHR in 2.5% LLE group was neglected because of its poor growth.
(B) Each value represents the average amount of a cage of 3-4 animals.
(3) ウ ィ ス タ ー 京 都 ラ ッ トウ ィ ス タ ー 京 都 ラ ッ ト に お け る 血 圧 へ の 影 響ウ ィ ス タ ー 京 都 ラ ッ トウ ィ ス タ ー 京 都 ラ ッ トに お け る 血 圧 へ の 影 響に お け る 血 圧 へ の 影 響に お け る 血 圧 へ の 影 響
試 験 期 間 中 のWKYの 血 圧 の 変 化 をFig. 6に 示 す. 正 常 飼 料 の 摂 取 群 及 びLLE 摂 取 群 共 に, 実 験 前 の 血 圧 が 約90 mmHg, 6週 間 目 で 約120 mmHgで あ り 加 齢 に よ る 軽 度 な 血 圧 の 上 昇 が 見 ら れ た が, LLE 摂 取 に よ る 血 圧 へ の 影 響 は 見 ら れ な か っ た.
Period of treatment (weeks)
Fig. 6. Effect of LLE on Blood Pressure in WKY Each value represents the mean±S.E.M. (n=6).
(4) ウ ィ ス タ ー 京 都 ラ ッ トウ ィ ス タ ー 京 都 ラ ッ ト に お け る 体 重 へ の 影 響ウ ィ ス タ ー 京 都 ラ ッ トウ ィ ス タ ー 京 都 ラ ッ トに お け る 体 重 へ の 影 響に お け る 体 重 へ の 影 響に お け る 体 重 へ の 影 響
試 験 期 間 中 のWKYの 体 重 の 経 日 変 化 をFig. 7に 示 す. 正 常 飼 料 摂 取 群 とLLE 摂 取 群 を 比 較 し た と き, 差 は 認 め ら れ な か っ た.
Fig. 7. Effect of LLE on Body Weight in WKY Each value represents the mean±S.E.M. (n=6).
Period of treatment (weeks)
第 第第 第 4項項 項項 考 察考 察考 察考 察 LLE 1.25%, 2.5% 及 び 5.0% 混 入 し た 飼 料 をSHRに 給 餌 し た 結 果, 5週 目 か ら 降 圧 効 果 が 発 現 し, ま た 用 量 に 依 存 し た 降 圧 が 見 ら れ た. 7 週 間 適 用 後, 2 週 間 混 餌 を 休 止 し た が 降 圧 効 果 は 持 続 し, 急 激 な 昇 圧 は き た さ な か っ た. 今 回 の 血 圧 の 経 日 変 化 の 結 果 か ら, い ず れ の 用 量 の 群 に お い て も 安 定 し た 降 圧 効 果 が 見 ら れ る よ う に な る の は 投 与 6 週 間 後 頃 と 考 え ら れ た. 次 に, WKYに LLE 5.0% 混 入 し た 飼 料 を 給 餌 し た 結 果, 降 圧 作 用 は 見 ら れ な か っ た. つ ま り, LLEは SHR に 対 し て は 降 圧 作 用 を 示 す が, 正 常 ラ ッ ト で あ る WKY の 血 圧 に は 影 響 し な か っ た. こ の こ と か ら, LLE は 交 感 神 経 活 動 の 亢 進 し て い る と い わ れ て い るSHRの 血 圧 に の み 作 用 し, ホ メ オ タ シ ス を 維 持 し て い る WKY の 血 圧 に は 影 響 し な い こ と が 考 え ら れ る. ま た, 以 上 の 結 果 か ら, 今 回 用 い た LLE の 用 量 で は, 体 重, 摂 餌 量 等 一 般 症 状 に は, い ず れ も 影 響 し な い と 推 察 さ れ る.
第 第第 第 2節節節節 ラ ッ ト を 用 い たラ ッ ト を 用 い た 羅 布 麻 茶 葉 エ キ スラ ッ ト を 用 い たラ ッ ト を 用 い た羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス 十 二 指 腸 内 投 与 試 験十 二 指 腸 内 投 与 試 験十 二 指 腸 内 投 与 試 験十 二 指 腸 内 投 与 試 験 第 第第 第 1項項 項項 背 景背 景背 景背 景 第 2 章 第 1 節 の 結 果 よ り, 無 麻 酔 状 態 下 で は, LLE を 正 常 ラ ッ ト で あ るWKY に 慢 性 経 口 投 与 し て も 血 圧 に は 影 響 が 認 め ら れ な い が, SHR で の 慢 性 経 口 投 与 で は 6 週 目 か ら 有 意 な 降 圧 作 用 を 認 め た こ と を 述 べ た. 23) そ こ で 本 項 で は SHR を 用 い, 麻 酔 下 で の LLE の 十 二 指 腸 内 (intraduodenal: i.d.) 投 与 に よ る 交 感 神 経 系 あ る い は 副 交 感 神 経 系 薬 物 に よ る 血 圧 反 応 へ の 影 響 に つ い て 検 討 し た. さ ら に 現 在, 「 血 圧 が 高 め の 方 に 適 す る 食 品 」 と さ れ て い る 主 な 製 品 は ラ ク ト ト リ ペ プ チ ド, か つ お 節 オ リ ゴ ペ プ チ ド, い わ し ペ プ チ ド 等 の オ リ ゴ ペ プ チ ド を 有 効 成 分 と し, そ の 降 圧 作 用 は ア ン ギ オ テ ン シ ン 変 換 酵 素 (angiotensin- converting enzyme：ACE) の 阻 害 で あ る と 考 え ら れ て い る. こ れ ら の 製 品 は 長 期 摂 取 す る こ と に よ り, ま れ に 咳 が 出 る こ と が あ り, 注 意 が 必 要 と い わ れ て い る.
27)
LLE に よ る 降 圧 作 用 が ACE の 阻 害 に よ る も の か 否 か を 検 討 す る た め に, LLE を 麻 酔 し た Sprague Dawley 系 ラ ッ ト に i.d.投 与 し た.
第 第第 第 2項項 項項 実 験 方 法実 験 方 法実 験 方 法実 験 方 法 (1) 実 験 材 料実 験 材 料実 験 材 料実 験 材 料 LLE の 調 製 及 び 品 質 の 確 認 は 第 2 章 第 1 節 第 2 項 に 準 じ 行 っ た. (2) 使 用 薬 物使 用 薬 物使 用 薬 物使 用 薬 物
dl-noradrenaline (NA, 三 共), acetylcholine (ACh, 第 一 製 薬), angiotensinⅠ (ヒ ト 由 来, 和 光 純 薬 工 業), heparin sodium (Sigma).
(3) 実 験 動 物実 験 動 物実 験 動 物実 験 動 物
体 重 360-420g の 雄 性 SHR (船 橋 農 場) 及 び 雄 性 Sprague Dawley系 ラ ッ ト を 購 入 後, 温 度 22±2℃, 湿 度 55±20% の 動 物 室 に て1週 間 以 上 予 備 飼 育 し, 実 験 に 供 し た. ラ ッ ト に は SP 固 形 飼 料 (SHR 用 普 通 飼 料 (船 橋 農 場) ) 及 び 水 道 水 を 24 時 間 自 由 摂 取 さ せ た.
本 研 究 は「 実 験 動 物 の 飼 育 及 び 保 育 等 に 関 す る 基 準 」 (昭 和 55年 3 月 総 理 府 告 示 第 6 号) を 遵 守 し て 行 っ た. (4) 測 定 方測 定 方 法測 定 方測 定 方法法法 実 験 は, 20% Urethane 500 mg/kg及 び 2% α-chloralse 50 mg/kg の 混 合 液 (腹 腔 内 投 与, intraperitoneal : i.p.) を 用 い た 麻 酔 下 で 行 っ た. 全 身 血 圧 は 右 大 腿 動 脈 に 挿 入 し た カ ニ ュ ー レ か ら 圧 ト ラ ン ス ジ ュ ー サ ー (日 本 光 電, 血 圧 モ ニ タ リ ン グ 用 ラ イ フ キ ッ ト) を 介 し, ひ ず み 圧 力 用 プ リ ア ン プ (日 本 光 電, AP-621G) に よ り 測 定 し た. 心 拍 数 は 体 部 血 圧 の 収 縮 期 を ト リ ガ ー と し て 瞬 時 心 拍 数 用 プ リ ア ン プ (日 本 光 電, AT-601G) に よ り 測 定 し た. i.v.投 与 は 左 大 腿 静 脈 に 薬 物 注 入 用 の カ ニ ュ ー レ を 留 置 し て 行 っ た. i.d.投 与 は 腹 部 中 央 線 で 開 腹 し た 後, 胃 壁 を 一 部 切 開 し, 胃 内 か ら 十 二 指 腸 起 始 部 に カ ニ ュ ー レ を 挿 入 し て 行 っ た. (5) 投 与 方 法投 与 方 法投 与 方 法投 与 方 法 LLE は テ フ ロ ン ホ モ ジ ナ イ ザ ー を 用 い て 精 製 水 に 懸 濁 し, i.d.投 与 に 用 い た. ま た 薬 物 は, 静 脈 内 (intravenous : i.v.) 投 与 で は 生 理 食 塩 水 に 溶 解 し て 用 い た. 投 与 用 量 は i.d.用 に は 500 µl/100g (体 重), i.v.用 に は 50-100 µl/100g (体 重) と し た. ⅰ ⅰⅰ ⅰ) 十 二 指 腸 内十 二 指 腸 内十 二 指 腸 内十 二 指 腸 内 単 回 投 与 時 の 降 圧 と 用 量 反 応 性単 回 投 与 時 の 降 圧 と 用 量 反 応 性単 回 投 与 時 の 降 圧 と 用 量 反 応 性単 回 投 与 時 の 降 圧 と 用 量 反 応 性 (高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト に お け高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト に お け高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト に お け高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト に お け る 検 討 る 検 討る 検 討 る 検 討) 実 験 ⅱⅱⅱⅱ, ⅲⅲⅲⅲ を 行 う に あ た り 麻 酔 し た SHR に LLE 30, 100, 300, 1,000 mg/kg を そ れ ぞ れ 単 回 i.d.投 与 し, 降 圧 作 用 と そ の 用 量 反 応 性 を 見 た. 投 与 間 隔 は, 先 に 投 与 し た LLE に よ る 血 圧 へ の 影 響 が 消 失 す る 40-60 分 以 上 の 間 隔 を あ け, 次 の LLE を 投 与 し た. ⅱ ⅱ ⅱ ⅱ) ノ ル ア ド レ ナ リ ンノ ル ア ド レ ナ リ ン に よ る 昇 圧 及 びノ ル ア ド レ ナ リ ンノ ル ア ド レ ナ リ ンに よ る 昇 圧 及 びに よ る 昇 圧 及 びに よ る 昇 圧 及 び ア セ チ ル コ リ ンア セ チ ル コ リ ンア セ チ ル コ リ ン に よ る 降 圧 作 用 に 対 す るア セ チ ル コ リ ンに よ る 降 圧 作 用 に 対 す るに よ る 降 圧 作 用 に 対 す るに よ る 降 圧 作 用 に 対 す る 影 響 影 響 影 響 影 響 (高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト に お け る 検 討高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト に お け る 検 討高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト に お け る 検 討高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト に お け る 検 討)
影 響 に つ い て 検 討 し た. 実 験 ⅰⅰⅰ に よ り 降 圧 が 確 認 さ れ たⅰ LLEの 用 量 に つ い て 低 用 量 群 (30ま た は100 mg/kg) 及 び 高 用 量 群 (300ま た は1,000 mg/kg) を 設 定 し, 明 ら か な 降 圧 を 確 認 し て LLE を 投 与 し た. 次 に LLE 投 与 前 の 時 点 と LLE 投 与 後 の 降 圧 効 果 が 持 続 し て い る 時 点 で, NA を3ま た は5 µg/kg (i.v.), 及 びACh を 1 ま た は 2 µg/kg (i.v.) 投 与 し た.
ⅲ ⅲⅲ
ⅲ) angiotensinⅠⅠⅠⅠ の 昇 圧 作 用 に 対 す る 影 響の 昇 圧 作 用 に 対 す る 影 響の 昇 圧 作 用 に 対 す る 影 響の 昇 圧 作 用 に 対 す る 影 響 (Sprague Dawley ラ ッ トラ ッ トラ ッ トラ ッ ト に お け る 検に お け る 検に お け る 検に お け る 検
討 討討 討)
Sprague Dawley 系 ラ ッ ト に LLE (i.d.) 投 与 後, 10, 30 及 び 50 分 後 に angiotensinⅠ を 300 ng/kg (i.v.) 投 与 し て LLE 投 与 前 の angiotensinⅠ に よ る 昇 圧
の 程 度 と 比 較 し た. LLEの 用 量 は, 実 験 ⅰⅰⅰ の 用 量 反 応 性 に 関 す る 結 果 か らⅰ 300及 び 1,000 mg/kgと し た.
(6) 統 計 処 理統 計 処 理統 計 処 理統 計 処 理
各 実 験 群 の 測 定 値 は 平 均 値±標 準 誤 差 で 示 し た. 有 意 差 検 定 に つ い て は, 実 験 ⅰⅰⅰⅰ で は, ニ 元 配 置 分 散 分 析 後, Scheffe post-hoc testに よ りLLE投 与 前 後 の 比 較 を 行 っ た. 実 験 ⅱⅱⅱⅱ で は, 分 散 分 析 後, 対 応 の あ る t-test に よ りLLE投 与 前 後 の 比 較 を 行 っ た. 実 験 ⅲⅲⅲⅲ で は, 一 元 配 置 分 散 分 析 後, Fisher's PLSD post-hoc testに よ りLLE投 与 の 影 響 に つ い て 検 討 し た. 第 第第 第 3項項 項項 結 果結 果結 果結 果 (1) 十 二 指 腸 内十 二 指 腸 内 単 回 投 与 時 の 降 圧 と 用 量 反 応 性十 二 指 腸 内十 二 指 腸 内単 回 投 与 時 の 降 圧 と 用 量 反 応 性単 回 投 与 時 の 降 圧 と 用 量 反 応 性単 回 投 与 時 の 降 圧 と 用 量 反 応 性 (高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト に お け高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト に お け高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト に お け高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト に お け る 検 討 る 検 討る 検 討 る 検 討) LLE 投 与 に よ り, 投 与 量 に 依 存 し て 有 意 な 血 圧 低 下 が 認 め ら れ た. 標 準 的 な 降 圧 パ タ ー ン をFig. 8に 示 す. LLE投 与 後, 10分 前 後 か ら 緩 徐 な 降 圧 作 用 が 見 ら れ 始 め, 最 大 降 圧 は 投 与 後 約 30-40 分 後 で あ っ た. 収 縮 期 血 圧 の 最 大 降 圧 値 に つ い て は, 30 mg/kg か ら 300 mg/kg に お い て は9 mmHgか ら 21 mmHg と 降 圧 は 増 大 し た が, そ れ 以 上 の 用 量 (1,000 mg/kg) で は 降 圧 の 増 大 は 見 ら れ な か っ た (Table 3). い ず れ の 用 量 に お い て も 緩 徐 に 降 圧 し, LLE 投 与 前 と 比 較 し 有 意 な 降
圧 作 用 を 示 し た. 心 拍 数 に は 影 響 が 認 め ら れ な か っ た.
な お, 溶 媒 (精 製 水) の み の 投 与 は 血 圧, 心 拍 数 の い ず れ に も 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た.
Fig. 8. Standard Pattern of Decrease in Blood Pressure by LLE
Table 3. Dose-response Curve of Hypotensive Effect of LLE
B.P. : blood pressure. Each value represents the mean±S.E.M. (n=3-9).
(2) ノ ルノ ルノ ル ア ド レ ナ リ ンノ ルア ド レ ナ リ ンア ド レ ナ リ ンア ド レ ナ リ ン に よ る 昇 圧 及 びに よ る 昇 圧 及 び ア セ チ ル コ リ ンに よ る 昇 圧 及 びに よ る 昇 圧 及 びア セ チ ル コ リ ンア セ チ ル コ リ ンア セ チ ル コ リ ン に よ る 降 圧 作 用 に 対 す るに よ る 降 圧 作 用 に 対 す るに よ る 降 圧 作 用 に 対 す るに よ る 降 圧 作 用 に 対 す る 影 響 影 響 影 響 影 響 (高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト に お け る 検 討高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト に お け る 検 討高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト に お け る 検 討高 血 圧 自 然 発 症 ラ ッ ト に お け る 検 討) LLE の 低 用 量 及 び 高 用 量 処 置 は い ず れ も, NA に よ る 昇 圧 及 び ACh に よ る 降 300 mg/kg LLE (A) and 1000mg / kg (B) are administrated (i d.).
(A) (B) 300 mg/kg 1000 mg/kg 0 10 20 (min.) 0 20 40 (min.) （ mmHg ） 200 100 0
300 mg/kg LLE (A) and 1000mg / kg (B) are administrated (i d.).
(A) (B) 300 mg/kg 1000 mg/kg 0 10 20 (min.) 0 20 40 (min.) （ mmHg ） 200 100 0
圧 作 用 に 有 意 な 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た (Fig. 9, Table 4, 5).
A: Precontrol (Before Administration of LLE)
B: After Administration of LLE
:
Fig. 9. Effect of Pretreatment with LLE on NA-induced Increase and ACh-induced Decrease in Blood Pressure in SHR
Table 4. Effect of Pretreatment with LLE on NA-induced Increase in Blood Pressure of SHR
B.P. : blood pressure. Each value represents the mean±S.E.M. (n=3 or 4). Differences of effect between before and after treatment : not significant.
