After Administration of LLE

:

Fig. 9. Effect of Pretreatment with LLE on NA-induced Increase and ACh-induced Decrease in Blood Pressure in SHR

Table 4. Effect of Pretreatment with LLE on NA-induced Increase in Blood Pressure of SHR

B.P. : blood pressure. Each value represents the mean±S.E.M. (n=3 or 4).

Differences of effect between before and after treatment : not significant.

Table 5. Effect of Pretreatment with LLE on ACh-induced Decrease in Blood Pressure of SHR

B.P. : blood pressure. Each value represents the mean±S.E.M. (n=6 or 4).

Differences of effect between before and after treatment : not sigificant.

(3) angiotensinⅠⅠⅠⅠ の 昇 圧 作 用 に 対 す る 影 響の 昇 圧 作 用 に 対 す る 影 響の 昇 圧 作 用 に 対 す る 影 響の 昇 圧 作 用 に 対 す る 影 響 (Sprague Dawley ラ ッ ト に お け る 検ラ ッ ト に お け る 検ラ ッ ト に お け る 検ラ ッ ト に お け る 検 討

討 討 討)

LLE前 処 置 し た と き のangiotensinⅠ の 昇 圧 作 用 に 対 す る 経 時 変 化 に お い て は,

い ず れ の 時 点 に お い て も LLE 投 与 前 と 比 較 し て 有 意 な 昇 圧 の 抑 制 は 認 め ら れ な か っ た (Fig. 10, Table 6). す な わ ち, angiotensinⅠ か ら angiotensinⅡ へ の 代 謝 に 関 与 す る ACE の 阻 害 に 基 づ く 昇 圧 の 抑 制 作 用 は 見 ら れ な か っ た. な お LLE 前 処 置 は い ず れ の 量 に お い て も Sprague Dawley 系 ラ ッ ト の 血 圧 に 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た. 生 理 食 塩 水 の み の i.v.投 与 も 血 圧 に 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た.

Fig. 10. Effect of Pretreatment with LLE on AngiotensinⅠⅠⅠⅠ-induced Increase in Blood Pressure in Sprague Dawley Rats

Table 6. Effect of Pretreatment with LLE on AngiotensinⅠⅠⅠⅠ-induced Increase in Blood Pressure of Sprague Dawley Rats

B.P. : blood pressure. Each value represents the mean±S.E.M. (n=6 or 4).

Differences of effect between before and after treatment : not significant.

第 第 第

第 4項項 項項 考 察考 察考 察考 察

麻 酔 し た SHR を 用 い た 本 実 験 で は, LLE 単 回 i.d.投 与 時 の 降 圧 に お い て, 100 mg/kgま で は 用 量 に 依 存 し た 降 圧 が 見 ら れ る が, 300 mg/kg以 上 に 用 量 を 増 大 し

て も 最 大 降 圧 は 増 加 し な か っ た (Table 3). こ れ はLLEが 腸 管 か ら 一 度 に 吸 収 さ れ, 血 中 に 移 行 す る 量 に は 限 界 が あ る 可 能 性 や 作 用 部 位 で の 反 応 の 天 井 効 果 が 考 え ら れ る. ま た, 降 圧 の 持 続 時 間 は 300 mg/kg で は お よ そ 10 分, 1,000 mg/kg で は お よ そ 30 分 と 高 用 量 で 長 く な る 傾 向 が あ っ た (Fig. 8) こ と か ら, i.d.投 与 時 LLE は ゆ っ く り 吸 収 さ れ, 緩 徐 に 降 圧 す る と 考 え ら れ る.

本 実 験 で LLE は, SHR へ の 単 回 投 与 で 有 意 な 降 圧 作 用 を 示 し た が, 本 章 第 1 節 の 慢 性 経 口 投 与 で は, LLEは SHR に 対 し 5ま た は 6 週 目 か ら 有 意 な 降 圧 作 用 を 示 し (Fig. 4),²³⁾ 効 果 の 発 現 ま で の 時 間 に 差 が 認 め ら れ た. こ れ は, 前 者 で は LLE投 与 時 の SHR血 圧 が 約 150mmHgだ っ た の に 対 し, 後 者 で は LLE投 与 開 始 時 の SHR は 6 週 齢 （ 血 圧 約 120mmHg） で あ っ た た め, す ぐ に 降 圧 は 見 ら れ ず, 徐 々 に 血 圧 が 上 が っ た 5 週 間 目 頃 か ら 降 圧 作 用 が 認 め ら れ た と 考 え ら れ る. ま

た, 前 者 は 麻 酔 下, 後 者 は 無 麻 酔 下 で あ っ た た め, 後 者 は よ り 交 感 神 経 が 働 い て い る と 考 え ら れ, こ の こ と も 降 圧 発 現 時 期 の 差 に 影 響 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る.

ま た LLE の i.d.投 与 はNA やACh の 血 圧 反 応 に 影 響 し な か っ た (Fig. 9, Table 4, 5). 従 っ て LLE 摂 取 後 に 交 感 神 経 系 あ る い は 副 交 感 神 経 系 に 作 用 す る 薬 物,

食 物 あ る い は 飲 料 水 と 同 時 に 摂 取 し て も 相 互 作 用 は 見 ら れ な い こ と が 示 唆 さ れ た.

LLE の i.d.投 与 後 の NA に よ る 昇 圧 作 用 に は 影 響 が な か っ た (Fig.9, Table 4)

こ と か ら, α 受 容 体 や β 受 容 体 遮 断 に 基 づ く 降 圧 で は な い と 考 え ら れ る. ま た, 麻 酔 し た Sprague Dawleyラ ッ ト に お け る angiotensinⅠ か ら angiotensinⅡ に 代 謝 さ れ た 後 昇 圧 す る 作 用 に 対 し て, LLE は 抑 制 し な か っ た (Fig. 10, Table 6) こ と か ら, LLE の 降 圧 作 用 は ACE 阻 害 作 用 に 基 づ く も の で は な い と 考 え ら れ る.

第第第

第 3節節 節節 ラ ッ ト 腸 間 膜 動 脈 を 用 い たラ ッ ト 腸 間 膜 動 脈 を 用 い た 羅 布 麻 茶 葉 エ キ スラ ッ ト 腸 間 膜 動 脈 を 用 い たラ ッ ト 腸 間 膜 動 脈 を 用 い た羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス 灌 流 試 験羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス灌 流 試 験灌 流 試 験灌 流 試 験 第第第

第 1項項 項項 背 景背 景背 景背 景

第 2 章 第 1 節 及 び 第 2 節 の 結 果 よ り, LLE は, 無 麻 酔 状 態 で も 麻 酔 状 態 で も SHR で は 有 意 な 降 圧 作 用 を 有 し,^23,28) そ の 降 圧 作 用 は, 少 な く と も 麻 酔 し た Sprague Dawley ラ ッ ト で は ACE 阻 害 に よ る も の で は な い こ と が 確 認 さ れ た.²⁸⁾

血 管 内 皮 細 胞 は 血 管 ト ー ヌ ス 及 び 血 圧 の 主 要 な 調 節 組 織 で あ る. 太 い 動 脈 で は NO が 主 な 血 管 ト ー ヌ ス の 規 定 因 子 で あ り, 抵 抗 血 管 で は 内 皮 由 来 過 分 極 因 子 (endothelium-deprived hyperpolarizing factor：EDHF) が 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る こ と が 示 唆 さ れ て い る.²⁹⁾ Kwanら は 羅 布 麻 葉 エ キ ス を ラ ッ ト の 摘 出 冠 動 脈 に 投 与 し, 内 皮 由 来 弛 緩 因 子 で あ る NO に よ る 内 皮 依 存 性 の 血 管 弛 緩 作 用 を 有 す る こ と を 報 告 し て い る.³⁰⁾ 本 項 で は, さ ら に 血 管 へ の LLE の 作 用 を 調 べ る こ と を 目 的 に, 血 圧 調 節 の 主 要 部 位 で あ る 抵 抗 血 管 の 細 動 脈 を 含 む 腸 間 膜 動 脈 血 管 床 の 摘 出 標 本 を 用 い て LLE の 血 管 拡 張 作 用 と そ の 発 現 機 序 に つ い て 検 討 し た.

第 第第

第 2項項 項項 実 験 方 法実 験 方 法実 験 方 法実 験 方 法 (1) 実 験 材 料実 験 材 料実 験 材 料実 験 材 料

LLE の 調 製 及 び 品 質 の 確 認 は 第2 章 第 1節 第 2 項 に 準 じ 行 っ た.

(2) 使 用 薬 物使 用 薬 物使 用 薬 物使 用 薬 物

各 種 試 薬 は 次 の も の を 使 用 し た. ACh (第 一 製 薬), methoxamine hydrochloride (日本新薬 ), papaverine (大日 本製薬), sodium deoxycholate (SD, Sigma), N^G-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME, Sigama), indomethacine (和 光 純 薬 工 業), KCl (和 光 純 薬 工 業), tetraethylammonium (TEA, Sigma), atropine sulfate (和 光 純 薬).

indomethacin 及 び SD を 除 く 全 て の 試 薬 は 蒸 留 水 に 溶 解 さ せ, 2-7 µ M methoxamine を 含 む Krebs-Ringer bicarbonate 液 (以 下 Krebs液 と 称 す る. 組 成 ; KH₂PO₄ 1.2 mM, NaCl 120.0 mM, KCl 5.0 mM, MgSO₄ 1.2 mM, NaHCO₃ 25.0 mM, ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA)-2Na 27 nM, CaCl₂ 2.4 mM, glucose (Glu)

1.0 mM (pH 7.4))で 調 製 し た. indomethacin は 98% エ タ ノ ー ル に 溶 か し, 7 µ M methoxamineを 含 む Krebs液 で 希 釈 調 製 し た. SDは0.9%生 理 食 塩 水 に 溶 か し た. ACh は 内 皮 保 持 標 本 に 注 入 す る 際, methoxamineを 含 む Krebs 液 で 調 製 し た.

(3) 実 験 動 物実 験 動 物実 験 動 物実 験 動 物

9-11 週 齢 の Wistar 系 雄 性 ラ ッ ト (体 重 280-350g) は 清 水 実 験 材 料 よ り 購 入

し, 室 温 23±2℃, 湿 度 45±5%, 照 明 時 間(8 : 00-20 : 00) の 条 件 下 で 飼 育 し た. 固 形 飼 料 (オ リ エ ン タ ル 酵 母 工 業) 及 び 水 道 水 を 24時 間 自 由 に 摂 取 さ せ た.

(4) 摘 出 腸 間 膜 動 脈 血 管 床 標 本 の 灌 流摘 出 腸 間 膜 動 脈 血 管 床 標 本 の 灌 流摘 出 腸 間 膜 動 脈 血 管 床 標 本 の 灌 流摘 出 腸 間 膜 動 脈 血 管 床 標 本 の 灌 流

ラ ッ ト に pentobarbital-Na を i.p.投 与 し て 麻 酔 下 に て 開 腹 し, Kawasaki ら の 方

法

31)

で ラ ッ ト 腸 間 膜 動 脈 血 管 床 を 摘 出 し て 灌 流 標 本 と し た. 上 腸 間 膜 動 脈 内 へ ポ リ エ チ レ ン 製 カ ニ ュ ー レ を 挿 入 し, Krebs 液 を 注 入 し て 血 管 床 内 の 血 液 を 除 去 し た 後, 腸 間 膜 動 脈 血 管 床 を 腸 管 ご と 摘 出 し た. 摘 出 し た 血 管 床 は 4 本 の 主 動 脈 を 残 し, そ れ 以 外 の 動 脈 は 結 紮 後 切 断 し, 4本 の 主 動 脈 か ら 出 る 動 脈 分 岐 を 腸 管 側 の 近 く で 切 り 離 し て, 腸 間 膜 動 脈 血 管 床 の 灌 流 標 本 と し た. 標 本 を 灌 流 装 置 に 設 置 後, Krebs 液 を peristaltic pump (AC-2120, ATTO製) で 一 定 流 量 (5 ml/分) で 灌 流 し た. ま た, 標 本 の 乾 燥 を 防 ぐ た め, Krebs 液 (0.5 ml/分) で 標 本

の 表 面 を 灌 流 し た. Krebs 液 は あ ら か じ め 95 % O₂, 5 % CO₂ の 混 合 ガ ス を 飽 和 さ せ, 37℃ に 保 温 し た ガ ラ ス 製 蛇 管 内 を 通 過 さ せ た. 標 本 と ポ ン プ の 間 に 置 い た 圧 ト ラ ン ジ ュ ー サ ー (TP-200T, 日 本 光 電 製) に て 灌 流 圧 を 測 定 し, 灌 流 圧 の 変 化 を 血 管 緊 張 度 変 化 と し て, 記 録 計 (model U-228, 日 本 電 子 化 学 製) 上 に 記 録 し た.

(5) 血 管 内 皮 細 胞 の 化 学 的 除 去血 管 内 皮 細 胞 の 化 学 的 除 去血 管 内 皮 細 胞 の 化 学 的 除 去血 管 内 皮 細 胞 の 化 学 的 除 去

血 管 内 皮 細 胞 の 除 去 は, Krebs液 と 共 に 5 ml/分 で SD (1.8 mg/ml) を 30秒 間 灌 流 し て 行 っ た.^32,33) SD の 灌 流 に よ っ て, 一 過 性 の 灌 流 圧 上 昇 (20-30 mmHg) が 見 ら れ た. そ の 後, SD を 含 ま な い Krebs 液 で 60 分 間 標 本 を 洗 浄 し た 後, methoxamine (2 µ M) を 含 む Krebs 液 で の 細 動 脈 血 管 平 滑 筋 の 収 縮 に よ り 灌 流 圧

を 上 昇 さ せ, ACh (1 nM) 注 入 に よ っ て 生 じ る 内 皮 依 存 性 の 平 滑 筋 弛 緩 反 応 に よ る 灌 流 圧 低 下 が 消 失 す る こ と で, 血 管 内 皮 細 胞 の 除 去 を 確 認 し た.

(6) 実 験 プ ロ ト コ ー ル実 験 プ ロ ト コ ー ル実 験 プ ロ ト コ ー ル実 験 プ ロ ト コ ー ル

LLE を 内 皮 保 持 標 本 及 び 内 皮 除 去 標 本 に 灌 流 し た.

1) 内 皮 保 持 標 本内 皮 保 持 標 本内 皮 保 持 標 本内 皮 保 持 標 本 ; 腸 間 膜 動 脈 標 本 に Krebs 液 を 5 ml/分 で 灌 流 し, 弛 緩 反 応 を 観 察 す る た め に methoxamine (7 µ M) で 血 管 を 収 縮 さ せ 灌 流 圧 を 一 定 レ ベ ル ま で 上 昇 さ せ た. 灌 流 圧 が 安 定 し た 後, ACh (100 pmol) を 注 入 し, 血 管 内 皮 細 胞 依 存 性 の 弛 緩 が 起 こ る こ と で, 正 常 内 皮 の 存 在 を 確 認 し た. そ の 後, LLE を 7 µ M methoxamine を 含 む Krebs 液 で 各 濃 度 (100 pg/ml, 1 ng/ml, 3 ng/ml, 10 ng/ml, 30 ng/ml, 100 ng/ml, 300 ng/ml, 1 µ g/ml, 3 µ g/ml, 10 µ g/ml) に 調 製 し, 15 分 間 隔 で

標 本 内 に 灌 流 さ せ, 血 管 弛 緩 反 応 を 観 察 し た. な お, LLE 作 用 間 隔 時 間 は LLE の 作 用 が 平 衡 に 達 す る 時 間 を 考 え て 設 定 し た. 血 管 弛 緩 反 応 は, 実 験 の 最 後 で papaverine (100 µ M) を 灌 流 し て 起 こ る 最 大 弛 緩 を 100 %と し,こ れ に 対 す る 弛

緩 率 で 評 価 し た.

ま た, LLE の 血 管 内 皮 由 来 弛 緩 因 子 の 関 与 及 び 内 皮 細 胞 の ム ス カ リ ン 受 容 体 へ の 作 用 に つ い て 検 討 し た. 内 皮 保 持 標 本 を 用 い て, Krebs 液 の み を 灌 流 後, Krebs 液 に 各 薬 物 (L-NAME 100 µ M, indomethacin 1 µ M, KCl 60 mM, TEA 5 mM, atropine 1 µ M) を 添 加 し て 灌 流 圧 を 安 定 さ せ, さ ら に methoxamine (2-7 µ M) を

含 む Krebs 液 に 各 薬 物 を 添 加 し て 標 本 を 灌 流 し た. 灌 流 圧 を 一 定 レ ベ ル ま で 上 昇 さ せ た 後, ACh (100 pmol) を 注 入 し て 各 薬 物 の 内 皮 弛 緩 へ の 作 用 を 観 察 後, こ の Krebs 液 で 各 濃 度 の LLE を 調 製 し, 灌 流 す る こ と で 各 薬 物 の LLE に 対 す る 作 用 に つ い て 観 察 し た. た だ し, 1 標 本 で 検 討 し た 薬 物 は 1種 類 で あ る.

2) 内 皮 除 去 標 本内 皮 除 去 標 本内 皮 除 去 標 本内 皮 除 去 標 本 ; 内 皮 保 持 標 本 と 同 様 にLLEの 各 濃 度 溶 液 を15分 間 隔 で 灌 流 し, 弛 緩 反 応 を 観 察 し た.

(7) 統統 計 処 理統統計 処 理計 処 理計 処 理

得 ら れ た 実 験 値 は 平 均 値 ± 標 準 誤 差 で 表 し た. 統 計 学 的 解 析 で は 2 群 間 の 比 較 を 対 応 の な い Student’s t-test を 用 い た(有 意 差 水 準 は 5%未 満).

第 第第

第 3項項 項項 結 果結 果結 果結 果

(1) 羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス の 内 皮 保 持 標 本 及 び 内 皮 除 去 標 本 に お け る 血 管 弛 緩 作 用羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス羅 布 麻 茶 葉 エ キ スの 内 皮 保 持 標 本 及 び 内 皮 除 去 標 本 に お け る 血 管 弛 緩 作 用の 内 皮 保 持 標 本 及 び 内 皮 除 去 標 本 に お け る 血 管 弛 緩 作 用 の 内 皮 保 持 標 本 及 び 内 皮 除 去 標 本 に お け る 血 管 弛 緩 作 用 ラ ッ ト 腸 間 膜 動 脈 灌 流 標 本 (内 皮 保 持 標 本) の 特 徴 と し て, methoxamine (7 µ M) 含 有 Krebs 液 で 血 管 を 収 縮 さ せ て 灌 流 圧 を 上 昇 さ せ, 2 時 間 半 の 灌 流 で 灌

流 圧 は 徐 々 に 低 下 し, 当 初 の 20%の 圧 ま で 低 下 し た (Fig. 11(A) コ ン ト ロ ー ル) . 内 皮 除 去 標 本 で は こ の 低 下 は 軽 微 で あ っ た(Fig. 11(B)).

LLE を 内 皮 保 持 標 本 及 び 内 皮 除 去 標 本 に 灌 流 し た と き の 血 管 弛 緩 反 応 を Fig.

11 に 示 す. 内 皮 保 持 標 本 に お い て, LLE の 灌 流 に よ り 濃 度 依 存 的 な 灌 流 圧 の 低

下, す な わ ち 血 管 弛 緩 反 応 が 観 察 さ れ, コ ン ト ロ ー ル と 比 較 し て そ の 弛 緩 の 程 度 は 有 意 に 大 き か っ た. 一 方, 内 皮 除 去 標 本 で は, LLEに よ る 弛 緩 は 内 皮 保 持 標 本 と 比 べ て 顕 著 に 抑 制 さ れ, コ ン ト ロ ー ル と 比 較 し て 有 意 に 小 さ か っ た. こ れ ら の こ と か ら, ラ ッ ト 腸 間 膜 動 脈 血 管 床 に お け る LLEの 血 管 弛 緩 作 用 に は 内 皮 依 存 性 弛 緩 機 序 が 関 与 す る こ と が 明 ら か に な っ た.

(A) with endothelium

without endothelium

Fig. 11. Concentration-dependent Vasodialtion by LLE in Rat Perfused Mesentric Vascular Beds with Intact Endothelium (+E ) or without Endothelium (-E) in the Presense of Active Tone Produced by Methoxamine (7 or 2 µM)

Krebs’ solution containing methoxamine (7 µ M) which does not contain LLE was used as control. The vasodilation is expressed as a percentage of the maximum relaxation induced by 100 µ M papaverine at the end of the experiment. Each value represents the mean±S.E.M. *p<0.05, **p<0.01 vs responses in control.

(2) 羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス羅 布 麻 茶 葉 エ キ ス の 血 管 弛 緩 作 用 に 対 す る 各 種 内 皮 由 来 弛 緩 因 子 阻 害 薬 のの 血 管 弛 緩 作 用 に 対 す る 各 種 内 皮 由 来 弛 緩 因 子 阻 害 薬 のの 血 管 弛 緩 作 用 に 対 す る 各 種 内 皮 由 来 弛 緩 因 子 阻 害 薬 のの 血 管 弛 緩 作 用 に 対 す る 各 種 内 皮 由 来 弛 緩 因 子 阻 害 薬 の 影 響

影 響 影 響 影 響

LLEに よ る 血 管 弛 緩 に 関 与 す る 血 管 内 皮 由 来 弛 緩 因 子 に つ い て 各 種 阻 害 薬 を

用 い て 検 討 し た. LLEに シ ク ロ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ 阻 害 薬 で あ る indomethacin, 過 分 極 を 阻 止 す る た め に 高 KCl を 添 加 し て 同 時 灌 流 し た 実 験 結 果 を Fig. 12 及 び 13 に 示 す. 高KClを 添 加 し たKrebs存 在 下 で は, LLEに よ る 弛 緩 反 応 は 有 意 に 抑 制 さ れ た. し か し, 高 濃 度 の LLE に よ る 弛 緩 反 応 は 完 全 に 抑 制 さ れ な か っ た. こ の こ と か ら, LLE の 内 皮 依 存 性 血 管 弛 緩 作 用 に は EDHF が 関 与 し て い る こ と が 推 察 さ れ た. ラ ッ ト 腸 間 膜 動 脈 血 管 等 の 抵 抗 血 管 で は 内 皮 依 存 性 の 弛 緩 反 応 の ほ と ん ど がEDHFを 介 し た 反 応 で あ る こ と が 報 告 さ れ て い る.³⁴⁾ 従 っ て, LLEの 弛 緩 反 応 は EDHF を 介 す る 弛 緩 で あ る と 考 え ら れ る. ま た, シ ク ロ オ キ シ ゲ ナ

Log [LLE] (mg/ml) Log [LLE] (mg/ml)

control (+E) (=5) LLE (+E) (n=7)

control (-E) (=5) LLE (-E) (n=5)