論 文 内 容 の 要 旨
論文提出者氏名 朱 凱 論 文 題 目
NADPH oxidase NOX1 is involved in activation of protein kinase C and premature senescence in early-stage diabetic kidney
論文内容の要旨
高血糖による活性酸素種（ROS）産生の亢進は糖尿病性腎症の発症・進展に関与すること が知られている。近年、生体内における ROS の主要な産生源として NADPH オキシダーゼが 注目されている。本酵素の触媒サブユニットである NOX には複数の分子種が存在し、腎臓 では NOX1, NOX2, NOX4 の発現が認められる。NOX1 は他の分子種に比し発現レベルは低いも のの、刺激を受けると誘導される特徴がある。興味深いことに NOX1 は 2 型糖尿病患者に おいて腎症の疾患感受性候補遺伝子であることが報告されている。また慢性腎臓病の発 症・進展因子であるアンギオテンシン II により NOX1 の発現が誘導されることから、NOX1 由来の ROS が糖尿病性腎症に関与している可能性が考えられる。そこで本研究ではNox1 遺伝子欠損マウス（KO）を用いて糖尿病性腎症における NOX1 の役割を明らかにすることと した。 実験には７週齢の KO と同腹野生型マウス（WT）を用い、尾静脈からストレプトゾトシン を 2 回投与（初回 75mg/kg、5 日後 150mg/kg）することにより１型糖尿病モデルを作製した。 実験開始点から 1 週間に１－2 回血糖チェックを行い、高血糖（＞ 300ｍｇ/ｄｌ）のマウ スのみ使用した。 体重、血中および尿中の腎機能の指標を測定した後、腎臓を摘出し、cortex、inner str ipe of outer medulla と inner medulla に分画した。また糸球体および皮質尿細管標品を 調整して NOX ア イ ソ フ ォ ー ム の mRNA 発現量を測定した。
非糖尿病群に比べると、高血糖誘発 3 週後の WT 群の腎臓、特に腎 cortex における NOX1 mRNA の有意な発現増加が認められたが、NOX2 と NOX4 mRNA の発現に変化は認められなかっ た。インスリン投与群では血糖値の回復とともに NOX1 mRNA の発現増加は抑制された。高
血糖誘発 8 週後には NOX1 mRNA の有意な発現変化は認めなかった。
NOX1 mRNA の有意な発現増加を認めた高血糖誘発 3 週後の時点において、腎障害の指標と なるアルブミン尿（urinary albumin）および血清尿素窒素（serum BUN）の上昇、炎症に 関わる MCP-1、PAI-1、ICAM-1、Osteopontin や線維化に関わる TGF-β、CTGF、TIMP-1 など の遺伝子発現、炎症性細胞（CD45、CD68 陽性細胞）の浸潤については両遺伝子型マウス間 に差は認められなかった。しかし HE 染色による組織学的解析では WT 群の腎臓で認められ る糸球体体積およびメサンギウムマトリクス領域の拡大は KO で有意に抑制されていた。 一方、酸化ストレスの指標である腎組織中 8-ハイドロキシデオキシグアノシン（8-OHdG） とチオバルビツール酸反応物（TBARS）は WT 群で顕著に増加していたが、KO では有意に抑 制されていた。さらに WT の腎組織では protein kinase C (PKC)-αと-βの膜移行と酵素活 性の増加が認められたのに対し、KO の腎組織では PKC 活性化が有意に抑えられていた。PK C 下流の p38 MAPK のリン酸化は WT 群での顕著に増加していたが、KO では有意に抑制され ていた。p38-MAPK のリン酸化亢進に伴いサイクリン依存性キナーゼ阻害因子 p27Kip1の発現 増加が認められたが、KO 群では有意に抑制されていた。さらに WT 群の腎臓における DNA 損 傷マーカーγ-H2AX およびβガラクトシダーゼ陽性細胞の増加は KO 群で有意に抑制されて いた。
以上の結果より NOX1 由来の ROS は高血糖下において PKC を介して p38/p27 Kip1シグナル
伝達経路を活性化し、糸球体肥大とメサンギウムマトリクス領域の拡大を伴う細胞老化を 促進することが示された。
