岡 山 医 誌 (1992) 104, 721∼733
難治性 喘息の病態 と治療 に関す る研究
第1編
難 治 性 喘 息 患 者 の リ ン パ 球 お よ び 好 中球 機 能 に 及 ぼ す
選 択 的Thromboxane
A2合
成 酵 素 阻 害 剤 の 効 果
岡山大学医学部第二 内科学教室(指 導:木 村郁郎教授)
金
廣
有
彦
(平成4年4月1日
受稿)
Key words: intractable asthma, cell-mediated allergy, thromboxane
A2,
thromboxane
A2 synthetase inhibitor (OKY-046)
緒 言
成 人 喘 息 の 重 症,難 治 化 病 態 の 解 明 に あ た り, 木 村 は 中 高 年 発 症 型 難 治 性 喘 息(late onset in tractable asthma, LOIA)1)の 独 立 性 を提 唱 し, 関 与 す る ア レ ル ギ ー 反 応 並 び に 種 々 の 炎 症 細 胞 間 の 相 互 作 用 に つ い て の 一 連 の 研 究 か ら,Ⅲ 型 お よ び Ⅳ 型 反 応 い わ ゆ る細 胞 反 応 型 ア レ ル ギ ー2) が 深 く関 与 す る こ と を想 定 し て い る3).さ ら に 難 治 性 喘 息 の 病 像 に 多 くの 類 似 点 を共 有 す る遅 発 型 気 道 反 応(late asthmatic response, LAR) を 構 成 す る 諸 因 子 が そ の 発 症 に 関 与 し,抗 原 は house dust・miteよ り もCandidaが 中 心 で, IgEよ りはIgGと くにIgG1抗 体 優 位 の Ⅲ 型 と 感 作 リン パ 球 を介 す る Ⅳ 型 反 応 が 重 要 で あ り, 最 終 的 に は 末 梢 気 道 に 集 積 し た 好 中 球,好 酸 球 な ど の 穎 粒 球 か ら放 出 さ れ るmediatorが 関 与 す る こ とが 明 ら か に さ れ て い る4).従 っ て 難 治 性 喘 息 の 治 療 に は,Candida抗 原 な ど に よ る 細 胞 反 応 型 ア レ ル ギ ー を 制 御 す る こ と が 重 要 と 思 わ れ る. 各 種 炎 症 反 応 と関 係 の 深 い ア ラ キ ドン 酸 代 謝 産 物 の ひ とつ で あ るthromboxane A2 (TXA2) は 動 物 モ デ ル に お い て 抗 原5),オ ゾ ン6), platelet activating factor (PAF)7), leukotriens
(LTs)8)9)に よ る気 道 収 縮 反 応 や 気 道 過 敏 性 と か,成 人 喘 息 患 者 の ア セ チ ル コ リ ン10)やLTs11) に 対 す る気 道 反 応 性 の 亢 進,さ ら に 抗 原 吸 入 後 に み ら れ るLARの 発 現 に も 関 与 す る 可 能 性 が 報 告 さ れ て お り12), histamine, PAF, LTsな ど と並 ぶchemical mediatorの ひ とつ と考 え ら れ て い る. 一 方,選 択 的TXA2合 成 酵 素 阻 害 剤 で あ る塩 酸 オ ザ グ レ ル(OKY-046){(E)-3-[p-(1H -imidazol-1-ylmethyl)phenyl]-2-propenoic acid}は,成 人 喘 息 へ の24週 間 以 上 の 長 期 投 与 試 験 に お い て,ス テ ロ イ ドの 減 量 効 果 も含 め て 重 症 喘 息 に 対 す る有 効 性 が 認 め られ て い る13).そ こ で 今 回 著 者 は 難 治 性 喘 息 病 態 の 中 核 を成 す と考 え られ て い る 細 胞 反 応 型 ア レ ル ギ ー の う ち 特 に Ⅳ 型 反 応 に お け るTXA2の 関 与 を 明 か に す る 目 的 で,成 人 の 難 治 性 喘 息 患 者 に お け る リン パ 球 お よ び好 中 球 の 機 能 に 対 す るOKY-046の 効 果 を 検 討 し た. 対 象 と 方 法 対 象 に は 当 科 外 来 通 院 お よ び 入 院 中 の 成 人 の 難 治 性 喘 息12例(男10例,女2例,27∼63歳, 平 均47.1歳)を 選 ん だ.そ の 患 者 背 景 は,全 例 miteお よ びCandidaのRASTscoreが 陰 性 で, Candida抗 原 に よ る リ ン パ 球 幼 若 化 反 応 あ る い はinterleukin 2 (IL-2)産 生 能 の 充 進 が 認 め 721
られ た症 例 で あ る(Table 1).難
治 性 喘 息 の定
義 は,現 在 一 般 に 用 い られ て い る喘 息 治療 薬 で
は症 状 の 改善 をみ ず,ス テ ロイ ド剤 を用 い なけ
れ ば 日常 生 活 が で きな い重症 かつ 通 年 性 の気 管
支 喘 息 で,し か も病 型 判 定 時以 前 に1年 間 以上
ス テ ロイ ド療 法(プ レ ドニ ゾ ロ ン換 算平 均5mg/
日以 上)を 続 け て い る いわ ゆ るス テ ロ イ ド依 存
性 喘 息 と した.
Table 1 Characteristics of intractable asthmatics.
方 法 は 下 記 の 如 く,患 者 末 梢 血 単 核 球 にOKY -046溶 解 液 を 試 験 管 内 で 添 加 し,PHAお よ び
Candida抗 原 に よ る リンパ 球 幼 若 化 反 応, IL-2, 好 中 球 遊 走 活 性 因 子(neutrophil chemotactic factor, NCF)お よ び 好 酸 球 遊 走 活 性 因 子
(eosinophil chemotactic factor, ECF)の 産 生 能 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 した.さ らに 好 中 球 に 対 す るOKY-046の 薬 理 作 用 と して,患 者 末 梢 血 好 中 球 か らのleukotriene C4 (LTC4)お よびsuper oxide (O2-)産 生 能 に 及 ぼ す 影 響 も 併 せ 検 討 し た. 1. 末 梢 血 リ ンパ 球 幼 若 化 反 応 に 及 ぼ すOKY-046の 効 果 の 検 討 ヘ パ リ ン1ml加 患 者 末 梢 血10mlをHistopa-que1077 (Sigma)に よ る 比 重 遠 沈 法 に て 単 核 球 層 を分 離 採 取 し, RPMI 1640 (GIBCO)に て1200 回転, 3分 間 遠 沈 し血 小 板 を除 去 し た 後2回 洗 浄 し, 10%fetal calf serum (FCS)加RPMI 1640
に て1×106/mlに 調 整 し た.か か る 浮 遊 液 を96 well tissue culture cluster (Coster)に100μlず
つtripricateに て分 注 し,各 濃 度 のOKY-046 を添 加 後5%CO2 incubatorに て37℃,3時 間 培 養 し た.次 い で 各wellに5, 25, 125倍 希 釈 Candida抗 原 液(Candida凍 乾 末,鳥 居 薬 品 を RPMI1640に て10mg/mlに 溶 解),お よ びPHA (100μg/ml),対 照 と し てRPMI1640を50μlず つ 添 加 し37℃ の5%CO2 incubatorに て 培 養 し た.培 養 後 各wellに3H-thymidine (3H-TdR) 0.2μCiを 添 加 し,7時 間 培 養 後 細 胞 を 回 収 し液 体 シ ン チ レ ー シ ョ ン カ ウ ン ター に て3H-TdRの 取 り込 み 値(dpm)を 測 定 し た.抗 原 あ る い は PHA添 加 群 の 各 濃 度 に お け る 平 均dpmの う ち の 最 高 値 と 非 添 加 群 の 平 均dpm値 の 比 に よ り stimulation index (S. I.)を 求 め,リ ン パ 球 幼 若 化 反 応 と し て 表 わ し た.
2. IL-2, NCF, ECFお よ びthromboxane B2 (TXB2)産 生 能 測 定 の ため の 培 養 上 清 の作 製 法
まず ヘ パ リ ン加 患 者 末 梢 血 よ り分 離 し た 単 核 球 を, 1%FCS加RPMI1640に て1×106/mlに 調 整 し た.こ れ を1mlず つ24wellのtissue cul ture cluster (Coster)に 分 注 し,各 濃 度 のOKY -046を 添 加 後5%CO2 incubatorに て37℃ ,3
難 治性 喘 息 とTXA2合
成 酵素 阻 害 剤
723
dida抗 原 はl50μg/ml, PHAは10μg/mlに な る よ う に 添 加 し,対 照 はRPMI 1640の み 添 加 後,5 %CO2 incubatorに て37℃,48時 間 培 養 し,こ の 培 養 上 清 を 採 取 してIL-2,NCFお よ びECF 産 生 能 の 測 定 用 検 体 と し た.一 方TXB2産 生 能 は, EDTA, indomethacin加 患 者 末 梢 血 よ り単 核 球 を分 離 し,同 様 に し て 得 ら れ た 培 養 上 清 を 検 体 と し た.な おNCFお よ びECF産 生 能 は, 検 体 を56℃,30分 間 の 熱 処 理 に て 非 働 化 して 測 定 した. 3. 末 梢 血 単 核 球 のIL-2産 生 能 に 及 ぼ すOKY -046の 効 果 の 検 討 末 梢 血 単 核 球 のIL-2産 生 能 は,宮 川 ら の 方 法14)に 準 じて 測 定 し た.す な わ ち,ま ずIL-2 assayに はIL-2 dependent cell line.で あ る CTLL-2 (cytotoxic T cell line)15)を, recombinant IL-2 (TGP-3,武 田薬 品)を 含 む 10%FCS加RPMI 1640に て 継 代 培 養 し て 用 い た.次 いで 上 記 の 検 体(培 養 上 清)を96 well tissue culture cluster にtripricateに て100μl/wellの希 釈 系 列(21-28倍)を7%FCS加RPMI1640 に て作 製 し,その 各wellに1×105/mlに7%FCS 加RPMI1640に て 調 整 浮 遊 させ たCTLL-2を 100μlず つ 添 加 後, 5%CO2 incubatorに て 37℃,24時 間 培 養 し た.培 養 後 各wellに3H-TdRO. 2μCiを 添 加 し18時 間 培 養 後,リ ン パ 球 幼 若 化 反 応 と 同 様 に 液 体 シ ン チ レー シ ョン カ ウ ン ター に て3H-TdRの 取 り込 み 値(dpm)を 測 定 し, S. I.を 求 めIL-2産 生 能 と し て 表 わ し た. 4. 末 梢 血 単 核 球 のNCF産 生 能 に 及 ぽすOKY -046の 効 果 の 検 討 末 梢 血 単 核 球 のNCF産 生 能 は 宮 川 ら14), Har vathら16)の 方 法 に 準 じて, Multiwell micro chemotaxis chambar (Neuroprobe)を 用 い
Modified Boyden's methodに て 測 定 し た.す な わ ち,デ キ ス トラ ン を 用 い た 比 重 遠 沈 法 に て 得 られ た好 中 球 比 率95%以 上 の 同 一 健 常 人 好 中 球 をHanks' balanced salt solution (HBSS, GIBCO)に て2×106/mlに 調 整 し,か か る 浮 遊 液 を上 室 に200μl,下 室 に は 検 体(培 養 上 清)を 25μlず つ 注 入 し た.上 室 と下 室 の 間 は ヌ ク レ オ ポ ア フ ィ ル ター(pore size 5μm)で 仕 切 り, 5 %CO2 incubator に て37℃, 30分 間 静 置 後,フ ィ ル タ ー を 取 り出 しGiemsa染 色 を 行 い,光 学 顕 微 鏡400倍 に て 下 室 側 に 遊 走 した 好 中 球 の10視 野 の 合 計 をNCF産 生 能 と して 表 わ し た. 5. 末 梢 血 単 核 球 のECF産 生 能 に 及 ぼ すOKY -046の 効 果 の 検 討 末 梢 血 単 核 球 のECF産 生 能 は 河 田 らの 方 法17) に 準 じ て,NCF産 生 能 と 同 様 にModified Boyden's methodに て 測 定 し た.す な わ ち,ま ず 同 一 健 常 人 末 梢 血 よ りフ ロー サ イ トメ ト リー18) を 用 い て 好 酸 球 を 分 離 し,90%以 上 の 高 純 度 で 得 られ た 好 酸 球 をHBSSに て2×105/mlに 調 整 し,か か る 浮 遊 液100μlを 上 室 に,検 体(培 養 上 清)50μlを 下 室 に 入 れ5%CO2 incubatorに て37℃,30分 間 静 置 後,フ ィ ル タ ー を取 り 出 し eosin染 色(エ オ ジ ノ ス テ イ ン,烏 居 薬 品)を 行 い,400倍 に て 下 室 側 に 遊 走 し た 好 酸 球 数 の10視 野 の 合 計 をECF産 生 能 と した. 6. 末 梢 血 単 核 球 か らのTXB2産 生 能 に 及 ほ す OKY-046の 効 果 の 検 討 TXB2は-80℃ で 保 存 して い た 検 体(培 養 上 清)をNew England Nuclear (NEN)社 製 〔125I〕 -RIA Kitを 用 い て 型 の ご と く測 定 し た. 7. 末 梢 血 好 中 球 か らのLTC4お よ びTXB2産 生 能 に 及 ぼ すOKY-046の 効 果 の 検 討 LTC4産 生 能 の 測 定 は,高 橋 ら の 方 法19)に 準 じて 行 な っ た.す な わ ち,ヘ パ リ ン1ml加 患 者 末 梢 血12mlに デ キ ス ト ラ ン2mlを 加 え 室 温 に 30∼60分 間 静 置 後,得 られ たbuffy coatを Histopaque 1077に よ る 比 重 遠 沈 法 に て 好 中球 分 画 を 採 取 し た.蒸 留 水1mlを 加 え て 溶 血 処 理 後, 1mlの1.8%NaClに よ り等 張 に 戻 し再 度 遠 沈 後 Tris buffer(ヒ トア ル ブ ミン, Ca2+, Mg2+添 加, pH 7.38)に よ り好 中 球 比 率95%以 上 の 好 中 球 浮 遊 液(7×106PMNs/ml)を 作 製 し た.か か る 浮 遊 液1mlに 各 濃 度 のOKY-046を 添 加 し1 時 間 前 処 置 後, 5μg/mlのcalcium ionophore A23187 (CaI)あ る い はCandida抗 原 を最 終 濃
度l50μg/mlに な る よ うに 添 加 し37℃,15分 間 反 応 さ せ た 後, 4倍 量 の 純 エ タ ノー ル を加 え て 反 応 を 停 止 し た.そ の 上 清 をSEP-PAKC18 (Waters社 製)で 処 理 後, Concentrator TC-8(太 陽 科 学 工 業 社 製)に て 蒸 発 乾 固 さ せ50%ア セ トニ ト リ ル500μlで 再 溶 解 した .こ の150μlを
TSK-GELODS-120T(東 ソ ー 社 製)カ ラ ム を 用 い た 高 速 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー(High performance liquid chromatography, HPLC, Water社 製)
に 注 入 し 定 量 し た.LTC4産 生 能 はng/7×106 PMNsに 換 算 し て 表 わ し た.ま た, TXB2は 同 様 に し て 作 製 し た 上 清 を 〔125I〕-RIA Kit (NEN) に て 測 定 し た.
8. 末 梢 血 好 中 球 か ら のsuperoxide (O2-)産 生 能 に 及 ぼ すOKY-046の 効 果 の 検 討 O2-産 生 能 の 測 定 は,高 橋 ら の 方 法19)に 準 じ て 以 下 の ご と く行 な っ た.す な わ ち,患 者 末 梢 血 よ り分 離 し た 好 中 球 のKrebs ringer phos phate buffer (KRP, pH 7.4)浮 遊 液(1×106 PMNs/ml)20μlを65μMの 酸 化 型cytochrome Cを 含 むKRPに 加 え,こ れ に 各 濃 度 のOKY-046 を 添 加 し15分 間preincubate後, concanavalin A(10mg/ml)20μlとcytochalasin E(2mg/ml) 20μlを 添 加 し,産 生 さ れ るO2-に よ り 還 元 さ れ るcytochrome Cの 吸 光 度 の 変 化 をdouble beam spectrophotometer UV-210A(島 津)を
用 い てUV550nmで 測 定 し た.な おO2-産 生 能 はnmol/min/106PMNsで 表 わ し た. 9. 各 種 薬 剤 のcytotoxicityに 関 す る検 討 添 加 に 用 い たOKY-046は,各 種bufferに て 溶 解 後 ミ リ ポ ア フ ィ ル タ ー(MillexHA 0.45μm) で 濾 過 す る こ とに よ り作 製 し た.ま た, OKY-046 添 加 に よ る 単 核 球,好 中 球 お よ びCTLL-2の viabi1ityを, trypan blue dye exclusion test お よ び 培 養 上 清 中 のlactate dehydrogenase (LDH)値 に よ り測 定 し た 結 果,対 照 に 比 し有 意 差 が な か っ た こ と か ら,OKY-046に は 直 接 的 なcytotoxicityが な い こ と を あ ら か じめ 確 認 し た. 10. 薬 理 効 果 の 評 価 と推 計 学 的 検 定 添 加 薬 剤 の 効 果 の 評 価 は 〔(薬剤 非 添 加 時 の 値-薬 剤 添 加 時 の 値)÷ 薬 剤 非 添 加 時 の 値 〕× 100=抑 制 率(%)で 表 わ し た.ま た そ の 推 計 学 的 有 意 差 検 定 はstudent's testを 用 い, Pvalue はp<0.05を 有 意 し た.
Fig. 1 Effect of OKY-046 on TXB2 production from peripheral blood mononuclear
cells stimulated by
PHA and Candida antigen in intractable
asthmatics.
(n=12)
結 果
1. TXB2産 生 能 に 及 ぼ すOKY-046の 効 果 1) 末 梢 血 単 核 球 か ら の 産 生:患 者 末 梢 血 単 核 球 か ら のPHAお よ びCandida抗 原 刺 激 に
難 治 性 喘 息 とTXA2合
成 酵 素 阻 害剤
725
よ るTXB2産 生 能 お よ びOKY-046添 加 に よ る 抑 制 効 果 を検 討 し た.そ の 結 果, Fig. 1の ご と くま ず 非 刺 激 群 に 比 し てPHAお よ びCandida 抗 原 の い ず れ の 刺 激 で もTXB2産 生 能 は 同 程 度 の 有 意 な増 加 を 示 し た(P<0.01, P<0.01).か か るTXB2産 生 能 はOKY-046の1μM添 加 に よ り有 意 に 抑 制 さ れ(P<0.01, P<0.01),ま た 非 刺 激 群 で も濃 度 依 存 性 に 有 意 な 抑 制 効 果 が 認 め ら れ た.Fig. 2 Effect of OKY-046 0n TXB2 production from peripheral blood neutrophils stimulated by calcium
ionophore in intractable
asthmatics. (n=12)
Fig. 3 Effect of OKY-046 0n lymphocyte blastogenesis from peripheral blood mononuclear cells
stimulated by PHA and Candida antigen in intractable
asthmatics.
(n=12)
PHA
Candida
* p<0.05,
** p<0.01.
Significantly different from
control.
2) 末梢 血 好 中球 か らの 産 生:患 者 末 梢 血 好
中球分 画か らのCaI刺
激 に よ るTXB2産
生 能
た.そ の 結 果, Fig. 2の ご と くCaI刺 激 に よ り TXB2産 生 能 は 有 意 に 増 加 し た が(P<0.01), OKY-046の1μM, 10μM添 加 に よ り濃 度 依 存 性 に 有 意 な 抑 制 効 果 が 認 め ら れ た(P<0.01). ま たOKY-046はCaI非 刺 激 群 で も 濃 度 依 存 性 にTXB2産 生 能 を 抑 制 し た.
Fig. 4 Effect of OKY-046 on IL-2 production from peripheral blood mononuclear cells stimulated by
PHA and Candida antigen in intractable
asthmatics.
(n=12)
PHA
Candida
* p<0.05, ** p<0.01. Significantly different from control.
Fig. 5 Effect of OKY-046 on
NCF-and
ECF production from peripheral blood mononuclear cells
stimulated by Candida antigen in intractable asthmatics.
(n=8)
NCF
ECF
2. 末 梢 血 単 核 球 に 及 ぼ すOKY-046の 効 果 1) リンパ 球 幼 若 化 反 応 お よびIL-2産 生 能: 非 特 異 的 刺 激 で あ るPHAと 特 異 抗 原 刺 激 で あ るCandidaに よ る 患 者 末 梢 血 リ ン パ 球 の 幼 若 化 反 応 お よ びIL-2産 生 能 に 及 ぼ すOKY-046の 抑 制 効 果 を検 討 し た.そ の 結 果,ま ずFig. 3に 示 すPHA刺 激 に よ る リン パ 球 幼 若 化 反 応 の 抑 制 率 はOKY-046の1μM, 10μM, 100μM添 加 で は 濃 度 依 存 性 に 有 意 な抑 制 効 果 が 認 め られ(P< 0.05, P<0.01, P<0.01),ま たCandida抗 原難 治性 喘 息 とTXA2合
成 酵素 阻 害 剤
727
Fig. 6 Effect of OKY-046 on LTC4 production from peripheral
blood neutrophils stimulated by calcium
ionophore and Candida antigen in intractable
asthmatics.
(n=10)
Ca-ionophore
Candida
* p<0.05,
Significantly
different
from
control.
Fig. 7 Effect of OKY-046 on superoxide (O2-)
production from peripheral blood
neutrophils stimulated by concanavalin
A and cytochalasin E in intractable
asthmatics.
(n=10)
* p<0.05, ** p<0.01, Significantly different from control.
刺 激 に よ る リ ンパ 球 幼 若 化 反 応 もPHAと 同 様 に 濃 度 依 存 性 に 有 意 な 抑 制 を 示 し た(P<0.05, P<0.01, P<0.01).一 方Fig. 4のPHAに よ るIL-2産 生 能 の 抑 制 率 は10μM以 上 で 濃 度 依 存 性 に 有 意 な 抑 制 効 果 が 認 め ら れ た(P< 0.05).ま たCandida抗 原 刺 激 の 際 の 抑 制 率 も, 10μM以 上 で 濃 度 依 存 性 に 有 意 な 抑 制 効 果 が 認 め られ た(P<0.05). 2) NCFお よ びECF産 生 能: Candida抗 原 刺 激 に よ る 患 者 末 梢 血 単 核 球 のNCFお よ び ECF産 生 能 に 及 ぼ すOKY-046の 抑 制 効 果 を 検 討 し た.そ の 結 果, Fig. 5の ご と くNCFお よ びECF産 生 能 はOKY-046添 加 に よ り濃 度 依 存 性 に 抑 制 さ れ る傾 向 が 認 め ら れ た. 3. 末 梢 血 好 中 球 に 及 ぼ すOKY-046の 効 果 1) LTC4産 生 能:患 者 末 梢 血 好 中 球 分 画 に OKY-046溶 液 を1μM, 10μMお よ び100μM添 加 し た 際 のLTC4産 生 能 の 抑 制 率 を検 討 し た と
こ ろ, Fig. 6の ご と くCaIお よ びCandida抗 原 の い ず れ の 刺 激 に よ るLTC4産 生 能 もOKY -046に よ り濃 度 依 存 性 に 有 意 に 抑 制 さ れ た(P< 0.05, P<0.05). 2) O2-産 生 能:患 者 末 梢 血 好 中 球 分 画 に OKY-046溶 液 を0.1μM, 1μM, 10μMお よ び 100μM添 加 し た 際 のO2-産 生 の 抑 制 率 は, Fig. 7の ご と く濃 度 依 存 性 に 有 意 な 抑 制 効 果 が 認 め ら れ た(P<0.05, P<0.01, P<0.01, P<0.01).
考
察
近年,抗 ア レル ギー 薬 開 発 の 進 歩 は 目 ざま し
くそ の 薬 理 作 用 は 多 岐 に わ た り,病 態 に 応 じ た 治 療 薬 の 選 択 が 可 能 と な っ て い る20).し か し こ れ ら は,IgE系 の 反 応 が 主 体 を 成 す 軽 症 の ア トピ ー 型 喘 息 症 例 に は 有 効 性 を認 め,ま た 通 年 性 の 非 ア トピ ー 型 喘 息 で も あ る程 度 の 効 果 が 認 め ら れ て い る が,い ず れ も重 症 例 に は 有 効 率 が 低 く 多 く を 期 待 で き な い.特 に 成 人 の 難 治 性 喘 息 発 作 の 機 序 はCandida感 作 に よ るⅢ 型 お よ び Ⅳ 型 反 応 す な わ ち細 胞 反 応 型 ア レ ル ギ ー2)で あ り, そ の よ う な症 例 の 多 くは 種 々 の 治 療 に 抵 抗 性 を 示 し,そ の 治 療 薬 も ス テ ロ イ ド剤 に 勝 る 薬 剤 は い ま だ 見 い だ し難 い の が 現 状 で あ ろ う. 一 方,近 年 開 発 さ れ た 各 種 抗 ア レ ル ギ ー 剤 の 中 で選 択 的TXA2合 成 酵 素 阻 害 剤 で あ る塩 酸 オ ザ グ レ ル(OKY-046)は,LARに 対 す る 抑 制 効 果12)や 成 人 の 重 症 喘 息 に 対 す る 長 期 投 与 で の 有 用 性,さ ら に は ス テ ロ イ ドの 減 量 効 果 の あ る こ とが 報 告 さ れ て い る13).そ こ で今 回 著 者 は,成 人 難 治 性 喘 息 病 態 へ のPGsお よ びTXA2の 関 与 を 明 か に す る 目的 で,細 胞 反 応 型 ア レ ル ギ ー の う ち 特 にIV型 反 応 を担 当 す る リン パ 球 に 対 す るOKY-046の 抑 制 効 果 お よび 好 中 球 の 各 種 反 応 性 に 及 ぼ すOKY-046の 抑 制 効 果 を検 討 した.そ の 結 果,OKY-046は 難 治 性 喘 息 患 者 末 梢 血 リン パ 球 のPHAお よ びCandida抗 原 に よ る幼 若 化 反 応 並 び にIL-2産 生 能 を 濃 度 依 存 性 に 有 意 に 抑 制 し,さ ら にCandida抗 原 に よ るNCFお よ びECF産 生 能 も抑 制 す る傾 向 が 認 め ら れ た. ま た 患 者 末 梢 血 好 中 球 か ら のLTC4お よ びO2-産 生 能 も濃 度 依 存 性 に 有 意 に 抑 制 し た. ヒ トに お い て,抗 原 吸 入 後 に み られ るLARの 際 に 血 中TXB2がpeakを 示 し,OKY-046が そ れ を 抑 制 す る こ とに よ り,TXA2はLARの 誘 導 及 び 発 現 に 重 要 な 役 割 を担 っ て い る こ とが 想 定 さ れ て い る12).さ ら に 著 者 ら は, Cadida抗 原 吸 入 に よ りLARが 誘 発 さ れ る 症 例 で は,そ の リ ン パ 球 由 来 のCandida抗 原 特 異 的IL-2, NCFお よ びECF産 生 能 の 著 明 な 充 進 を,ま た
house dustに よ るLAR症 例 で はmite抗 原 特 異 的IL-2お よ びECF産 生 能 の 有 意 な 充 進 を 認 め,細 胞 反 応 型 ア レル ギ ー の ー 環 と して のLAR 発 現 にTリ ン パ 球 由 来 の 諸 因 子 が 関 与 し,か か るLARは 喘 息 の 重 症 難 治 化 の 機 序 に 深 く係 わ っ て い る 可 能 性 を報 告 して い る21).ま た 難 治 性 喘 息 症 例 の 気 管 支 肺 胞 洗 浄 液(bronchoalveolar lavag efluid, BALF)中 の リン パ 球 はCandida
に 強 く感 作 さ れ22),さ ら に 末 梢 血 で も 同 様 の 所 見 が 得 られ て お り23),従 っ て 喘 息 の 難 治 化 病 態 に は TXA2を 介 す る リ ン パ 球 機 能 の 調 節 機 序 が 深 く 関 与 す る 可 能 性 が 想 定 さ れ る. か か る 観 点 か ら,今 回 リ ン パ 球 に 対 す る選 択 的TXA2合 成 酵 素 阻 害 剤 を検 討 し た と こ ろ, Candidaに 感 作 さ れ た 難 治 性 喘 息 患 者 末 梢 血 リ ンパ 球 のCandida抗 原 に よ る幼 若 化 反 応 並 び に IL-2産 生 能 の 充 進 を,OKY-046が 濃 度 依 存 性 に 有 意 に 抑 制 し た.さ ら にOKY-046は,患 者 末 梢 血 リン パ 球 のCandida抗 原 刺 激 に よ るNCFお よ びECF産 生 能 の 充 進 を抑 制 す る傾 向 が 認 め ら れ た.以 上 よ りOKY-046は,ス テ ロ イ ドの ご と き 強 力 な 免 疫 抑 制 作 用 で は な く,む し ろ 抗 原 特 異 的 な サ イ トカ イ ン 産 生 を 中 心 とす る細 胞 反 応 に 対 す る 抑 制 効 果 を 介 し てLARと か 成 人 の 難 治 性 喘 息 に 有 効 性 を 示 す も の と考 え ら れ た. 一 方,TXA2合 成 酵 素 を10-8Mと い う低 濃 度 で 抑 制 し, cyclooxygenaseやPGI2合 成 酵 素 に 対 して は10-4Mで も 抑 制 し な い特 異 性 の 高 い 阻 害 剤 で あ るOKY-046に よ りTXA2の 合 成 が 阻 害 さ れ る と, prostaglandin I2 (PGI2)24)25)や prostaglandin E2 (PGE2)26)の 産 生 が 相 対 的 に 促 進 さ れ る と い う報 告 が あ る.か か る 影 響 に 関 し てLeungら は ヒ トspleen cellにTXA2合 成 酵 素 阻 害 剤 で あ るimidazole, PGI2合 成 酵 素 阻 害 剤 のtranylcypromineお よ びPGE2を 添 加 し て 幼 若 化 反 応 を 検 討 し,imidazoleに よ る抑 制 作 用 にtranylcypromineは 影 響 せ ず,PGE2 も相 加 的 抑 制 効 果 しか 認 め な か っ た と報 告 して お り26),従 っ て 今 回 の 検 討 に お い て か か るPGI2 の 関 与 は 少 な い も の と思 わ れ る が,PGE2の 影 響 に つ い て はthromboxane A2 receptor anta gonist,あ る い はanalogueな ど を用 い て さ ら に 詳 細 な 検 討 が 必 要 で あ る. 気 道 平 滑 筋 や 血 管 系 の み な ら ず リ ン パ 球 な ど の 白 血 球 機 能 に も 強 い 影 響 を 及 ぼ す と考 え ら れ るTXA2は,ア ラ キ ドン 酸 のcyclooxygenase 系 代 謝 産 物 の 一 つ で あ り,強 力 な 気 管 支 収 縮 作 用 を 有 し,そ の 生 物 活 性 半 減 期 は 約30秒 と非 常
難 治 性 喘 息 とTXA2合
成酵 素 阻 害剤
729
に 不 安 定 で 自 然 に 加 水 分 解 さ れTXB2に 変 換 さ れ る27).Wintherら はTXA2合 成 酵 素 阻 害 剤 に よ り細 胞 内 のcAMPが 増 加 す る こ と を報 告 し て お り28),TXA2はCa2+の 転 送,細 胞 内 cAMPの 低 下 に 関 与 し て い る可 能 性 が あ る が, TXの 薬 理 作 用 な ら び に 機 序 に は 未 だ 不 明 解 な 点 が 多 い.小 林 ら は イ ヌ に お い て オ ゾ ン に よ る 気 道 炎 症 時 にTXA2合 成 酵 素 阻 害 剤 の 前 処 置 に よ り気 道 反 応 性 亢 進 が 減 弱 す る こ と か ら, TXA2が 気 道 反 応 性 の 亢 進 に も重 要 な 役 割 を 担 っ て い る こ とを 示 唆 して い る29).さ ら に 成 人 の 喘 息 患 者 の ア セ チ ル コ リン やLTD4に 対 す る気 道 反 応 性 亢 進 に も 同 じ くTXA2が 関 与 して い る 可 能 性 が 報 告 さ れ て い る10)11).ま たHoltzmanら は オ ゾ ン 吸 入 後 の イ ヌ の 気 管 の 生 検 を行 い,気 道 上 皮 内 に 遊 走 し て き た 好 中 球 数 と気 道 反 応 性 に 相 関 が あ る こ と30),ヒ トで もSeltzerら は オ ゾ ン吸 入 後 に 気 道 反 応 性 亢 進 とBALFの 好 中球 増 加 を認 め て い る31).ま た 相 沢 らは 気 道 に 炎 症 が 発 症 す る こ とに よ り浸 潤 し た 好 中 球 よ り遊 離 さ れ たTXA2の 働 き に よ っ て 気 道 過 敏 性 が 成 立 す る と報 告 し て お り6),気道 炎 症 部 位 で のTXA2の 主 た る産 生 細 胞 で あ る 好 中 球 の 動 態 は 重 要 と考 え ら れ る.また,か か る観 点 か ら木村 らは,重 症 難 治 性
喘息 お よび抗 原 吸入 によ るLAR後
のBALFに
お いて好 中球 が 高率 に出 現 す る こ と を報 告 して
お り32)33),こ
の機 作 にCandida抗
原 に感 作 され
た リンパ球 由 来 のNCF産
生 充 進 に よ る好 中球
の局 所集 積 を想定 してお り,さ らに 重症 難 治 性
喘 息 で は末 梢 血好 中球 のLTC4お
よびO2-産
生 能 の有 意 な亢進 を認 め て い る3)4)19).従
って 喘
息 の 難 治化 病 態 に は,感 作 リンパ 球 由 来 のNCF
に よ り気 道 局所 に集 積 す る好 中球 か ら産 生 され
るTXA2が
関 与す る可 能性 が 想 定 され る.さ ら
に今 回 の 難 治 性 喘 息 に お け る好 中球 に 及 ぼ す
OKY-046の
直 接作 用 の 検 討 で は,LTC4お
よび
O2-産 生 能 が 濃度 依 存 性 に有 意 に 抑制 され て お
り,本 剤 の 多面 的 な薬効 が判 明 した.
な お,LTとTXA2の
相 互 作 用 に つ い ては,
モ ル モ ッ トにLTC4,
LTD4を
静 注 した際 の 気
道 内圧 亢 進がTXA2合
成 酵素 阻害 剤 で抑 制 され
た とい う報 告や34),臨床 的 に も成 人 気 管支 喘 息 患
者 のLTD4に 対 す る気 道 反 応 亢 進 をOKY-046 が 有 意 に 改 善 し た と い う報 告 が あ り11),LTの 作 用 の 一 部 がTXA2を 介 して い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ て い る.ま たOKY-046はO2-産 生 能 に 対 し て,よ り 強 い 抑 制 効 果 が 認 め ち れ た が,か か る 抑 制 効 果 が 細 胞 内Ca2+の 低 下 や プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼCの 不 活 化 を 介 し たO2-生 成 酵 素 で あ るNADPHオ キ シ ダ ー ゼ の 抑 制 に よ る可 能 性, あ る い はO2-産 生 抑 制 作 用 を 有 す るPGE235)お よ びPGI236)の 産 生 亢 進0によ る可 能 性 な どが 考 え ら れ,今 後 更 に 詳 細 な 検 討 が 必 要 と思 わ れ る. 以 上,今 回 著 者 は 成 人 の 難 治 性 喘 息 患 者 を 対 象 に リン パ 球 に 対 す る 作 用 と し て 幼 若 化 反 応 並 び にIL-2, NCFお よ びECF産 生 能 を,好 中 球 に 対 す る 作 用 と し てLTC4お よ びO2-産 生 能 を 指 標 と してOKY-046の 作 用 機 序 を 検 討 した 結 果,本 剤 に はIV型 反 応 お よ び 好 中 球 か ら の mediator releaseに 対 す る 抑 制 効 果 が 認 め ら れ, 本 剤 は 難 治 性 喘 息 の 病 態 に 基 づ い た 治 療 薬 と し て 有 用 で あ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た. 結 論 成 人 難 治 性 喘 息 患 者 を 対 象 に 細 胞 反 応 型 ア レ ル ギ ー に 対 す るTXA2の 関 与 を 明 か に す る 目 的 で,選 択 的Thromboxane A2合 成 酵 素 阻 害 剤 塩 酸 オ ザ グ レ ル(OKY-046)を 用 い,末 梢 血 リ ン パ 球 お よ び 好 中 球 の 各 種 反 応 性 に 対 す る効 果 に つ い て 検 討 し,以 下 の 結 果 を 得 た. 1. 患 者 末 梢 血 単 核 球 か ら のPHAお よ び Candida抗 原 刺 激 に よ るTXB2産 生 能 は 有 意 に 増 加 し(P<0.01, P<0.01), OKY-046は こ れ を 有 意 に 抑 制 し た(P<0.01, P<0.01). 2. 患 者 末 梢 血 中 球 か ら のCaI刺 激 に よ る TXB2産 生 能 は 有 意 に 増 加 し(P<0.01), OKY -046は こ れ を有 意 に 抑 制 し た(P<0 .01). 3. 患 者 末 梢 血 単 核 球 のPHAお よ びCan dida抗 原 に よ る リ ンパ 球 幼 若 化 反 応(P<0.01, P<0.01)並 び にIL-2産 生 能(P<0.05, P< 0.01)はOKY-046に よ り濃 度 依 存 性 に 有 意 に 抑 制 さ れ た. 4. 患 者 末 梢 血 単 核 球 のCandida抗 原 に よ る NCFお よ びECF産 生 能 はOKY-046に よ り抑 制 さ れ る 傾 向 が 認 め ら れ た.5. 患 者 末 梢 血 好 中 球 か ら のLTC4お よ び O2-産 生 能 はOKY-046に よ り濃 度 依 存 性 に 有 意 に 抑 制 さ れ た(P<0.05, P<0.01). 以 上 よ り気 管 支 喘 息 の 難 治 化 の 病 態 にTXA2 の 関 与 が 認 め ら れ,OKY-046は 難 治 性 喘 息 治 療 薬 と し て の 有 用 性 が 示 唆 さ れ た. 稿 を終 え るに あ た り,御 指 導 御 校 閲 を賜 わ りま し た 恩 師 木 村 郁 郎 教 授 に深 甚 の 謝 意 を表 わ しま す と共 に 直接 御 指 導 御 助 言 を頂 き ま した 高橋 清 講 師 に深 謝 致 し ます. (本論 文 の 要 旨 は 第3回 日本 ア レル ギー 学会 春 季 臨 床 集 会 に て 発 表 した.)
文
献
1) 木 村 郁 郎:喘 息 の病 型 とそ の 本 質 論-中 高 年 発症 型 難 治 性 喘 息 の独 立性,日 胸 疾 患 会 誌 (1983) 21, 181 -182 . 2) 木 村 郁 郎:気 管 支 病 変 に お け るア レ ル ギー と リ ンパ球.ア レル ギ ア (1990) 19, 12-16. 3) 木 村 郁 郎:遅 発 ア レル ギー の発 症 機 序-細 胞 反 応 を 中心 に-:第3回 免 疫 薬 理 シン ポ ジウム 記録 集,デ ー エ ム ベ ー ・ジ ャパ ン,東 京 (1985) pp. 23-40 . 4) 高 橋 清:中 高 年 発 症 型 難 治性 気 管 支 喘 息 の機 序;第4回 免 疫 薬 物 療 法 研 究 会 記 録 集,医 薬 ジ ャー ナ ル社, 大 阪 (1987) pp. 110-130.5) Chung KF, Aizawa H, Becker AB, Frick O,
Gold WM and Nadel JA: Inhibition of antigen-induced
airway hyperresponsiveness
by a thromboxane
synthetase
inhibitor (OKY-046) in allergic dogs. Am
Rev Respir Dis (1986) 134, 258-261.
6) Aizawa H, Chung KF, Leikauf GD, Ueki I, Bethel RA, O' byrne PM, Hirose T and Nadel JA:
Significance of thromboxane
generation
in ozon-induced airway hyperresponsiveness
in dogs. J Appl
Physiol (1985) 59, 1918-1923.
7) Chung KF, Aisawa H, Leikuf GD, Ueki I, Evans TW and Nadel JA: Airway hyperresponsiveness
induced by platelet-activating
facter;
Role of thromboxane
generation.
J Pharmacol
Exp Ther
(1986) 236, 580-584.
8) O'
byrne PM,
Leikauf GD,
Aizawa H,
Bethel RA,
Ueki I,
Holtzman
MJ and Nadel JA:
Leukotriene
B4 induces airway hyperresponsiveness
in dogs. J Appl Physiol (1985) 59, 1941-1946.
9) 堂 前 真理 子,広 瀬 隆 士,石 橋 正 義,池 田 東吾,重 松信 昭,松 本 法 親,長 野 準:感 作 モ ル モ ッ トの 気 道 攣 縮に あ ず か るSRS-Aの 作 用 機 序 に つ い て.呼 吸(1982) 1, 235-240.
10) Fujimura M, Sasaki F, Nakatsumi Y, Takahashi Y, Hifumi S, Taga K, Mifune J, Tanaka T
and Matsuda T: Effect of thromboxane synthetase inhibitor (OKY-046) and a lipoxygenase in
hibitor (AA-861) on bronchial responsiveness to acetylcholine in ashmatic subjects. Thorax (1986)
41, 955-959.
11) 湯 川 龍 雄,山 井 孝 夫,渡 辺 茂 男,福 田 充,寺 師義 典,福 田 健,牧 野 荘 平:選 択 的Thromboxane A2合 成 酵 素 阻 害 剤(OKY-046)が 気 管 支 喘 息 患 者 の 気 道 過 敏 性 に 及 ぼ す 影 響.日 胸 疾 患 会 誌 (1987) 25, 1309 -1319. 12) 岩 本 逸 夫,羅 智 靖,佐 藤 俊 子,富 岡玖 夫,吉 田 尚:ア レ ル ゲ ン吸 入 誘 発 即 時 型 お よび 遅 発 型 喘 息 反 応 に お け る トロ ン ボ キ サ ンA2産 生.ア レ ル ギ ー (1986) 35, 437-446. 13) 長 野 準,広 瀬 隆 士,吉 田 稔,石 橋 正 義,田 丸 紀 子,安 武 敏 明,直 江 弘 昭,工 藤 秀 雄,井 上 謙 次 朗,鬼 塚 れ い 子:気 管 支 喘 息 に 対 す るThromboxane合 成 酵 素 阻 害 剤(OKY-046)の 長 期 使 用 経 験.診 療 と新 薬 (1990) 27, 1065-1076. 14) 宮 川 秀 文,難 波一 弘,白 石 高 昌,名 部 誠,槇 本 晃,佐 藤 恭,武 田 昌,多 田慎 也,高 橋 清,木 村 郁 郎:重 症 難 治 性 喘 息 に お け るIV型 ア レル ギ ー の 関 与 につ い て-カ ン ジ ダ 抗 原 に よ るIL-2産 生 能 と好 中球難 治 性 喘 息 とTXA2合
成 酵 素 阻 害剤
731
遊 走 能 一.ア レ ル ギ ー (1988) 37, 12-18.
15) Gillis S, Marry MF, Winny OU and Smith KA: T cell growth factor:
Parameters
of production
and
a quantitation
microassay
for activity. J Immunol (1978) 120, 2027-2032.
16) Harvath
L, Falk W and Leonard EJ: Rapid quantitation
of neutrophil
chemotaxis.
Use of a
polyvinylpyrrolidonate-free
polycarbonate
membrane
in multiwell assembly.
J Immunol Methods
(1980) 37, 39-45.
17) 河 田一 郎:気 管 支 喘 息 の 発 症 機 序 に お け る好 酸 球 の動 態 に 関す る研 究,第2編 カ ン ジダ抗 原 に よ る末 梢 血 単 核 球 由来 好 酸 球 遊 走 因 子 に つ い て.岡 山医 誌 (1990) 102, 745-755. 18) 河 田一 郎:気 管 支 喘 息 の 発 症 機 序 に お け る好 酸 球 の動 態 に 関 す る研 究,第1編 フ ロー サ イ トメ ト リー を用 い た好 酸 球 分 離 法 と好 酸 球 遊 走 因 子 に つ いて.岡 山 医誌 (1990) 102, 733-743. 19) 高 橋 清,清 水 一 紀,難 波 一 弘,中 山 堅 吾,岡 田千 春,辻 光 明,中 藤 研 一,周 藤 真 康,多 田慎 也,谷 崎 勝 朗,木 村 郁 郎:重 症 難 治 性 喘 息 に おけ る末 梢 血 好 中球 分 画 か らの ロ イ コ トリエ ン産 生 能 に 関 す る検 討.ア レ ル ギ- (1988) 37, 5-11. 20) 木 村 郁 郎,高 橋 清:気 管 支 喘 息-最 近 の考 え 方 と治 療 の 進 歩-.診 断 と治 療 (1989) 7, 1669-1673. 21) 金 廣 有 彦,古 藤 直 紀,岡 本 章 一,猪 木 篤 弘,難 波 康 夫,宗 田 良,多 田慎 也,高 橋 清,谷 崎 勝 朗,木 村 郁 郎:抗 原 特 異的 感 作 リ ンパ球 か らみ た 気 管 支 喘 息 の 病 態 につ い て.日 胸 疾 患 会 誌 (1991) 29, 142. 22) 武 田 昌:気 管 支 喘 息 に お け る リンパ 球 機 能 に 関 す る研 究,第1編 気 管 支 喘 息 に お け るBAL液 中並 びに 末 梢 血 中 リンパ 球 の 吸 入 抗 原 に 対 す る幼 若 化 反 応 の 検 討.岡 山 医 誌 (1991) 103, 387-397. 23) 金 廣 有 彦,江 田 良 輔,小 栗 栖 和 郎,小 塚 明 子,猪 木 篤 弘,木 村 五 郎,宗 田 良,多 田 慎 也,高 橋 清,木 村 郁 郎:気 管 支 喘 息 の病 態 に お け る感 作 リンパ 球 の 関 与 につ い て.ア レル ギー (1990) 39, 422.24) Hiraku S, Kawasaki A and Ujiie A: Pharmacological studies on the TXA2 syntetase inhibitor (E)
-3-[p-(H-imidazol-1-ylmethyl)
phenyl] -2-propenoic acid (OKY-046) . Jpn J Pharmacol (1986)
41, 393-401.
25) Kitamura S, Ishihara Y and Takaku F: Effect of thromboxane synthetase inhibitors (OKY-046,
OKY-1580) on the action of bronchoactive agents in guineapig tracheal strips and, on arachidonate
metabolism in ginea pig lung lobes. Prostaglandins Leukotrienes Med (1984) 14, 341-350.
26) Leung KH and Enrico M: Prostaglandin modulation of development of cell-mediated immunity in
culture. Nature (1980) 288, 597-600.
27) Hamberg M, Svensson J and Samuelsson B: Thromboxanes; A new group of biologically active
compounds derived from prostaglandin endoperoxides. Proc Natl Acad Sci USA (1975) 72, 2994
-2998.
28) Winther K, Knudsen JB, Malling HJ, Skov PS and Norn S: Leukocytes, specific thromboxane
inhibition and histamine release. Acta Pharmacol Toxicol (1982) 51, 46.
29) Kobayashi H, Adachi M, Satoh H, Okada Y and Takahashi T: The effect of thromboxane (TX)
A2 synthetase inhibitor on airway hyperresponsiveness induced by ozone exposure in beagles. Jpn J
Allergol (1985) 34, 469-473.
30) Holtzman MJ, Fabbri LM, O' byrne PM, Gold BD, Aizawa H, Walters EH, Alpert SH and Nadel
JA: Importance of airway inflamation for hyperresponsiveness induced by ozone. Am Rev Respir
Dis (1983) 127, 686-690.
31) Seltzer J, Bigby BG, Stulbarg M, Holtzman MJ, Nadel JA, Ueki I, Leikauf GD, Goetzer Ej and
Boushey HA: O3-induced change in bronchial reactivity to methacholine and airway inflamation in
humans. J Appl Physiol (1986) 60, 1321-1326.
33) 難 波 一 弘,高 橋 清,多 田慎 也,清 水 一 紀,中 藤 研 一,岡 田千 春,辻 光 明,沖 和 彦,谷 崎 勝 朗,木 村 郁 郎: House dustに よ る気 管 支 喘 息 患 者 遅 発 型 気 道 反 応 の発 症 機 序 に 関 す る検 討-気 管 支 肺 胞 洗 浄 法 を中 心 に-.ア レ ル ギー (1988) 37, 67-74.
