ヒトCYP1A2：塩基配列，遺伝子構造，マウスおよびラット遺伝子との比較と肝臓でのmRNA発現の個体差について

．原

_著

〔書略画、第職劉君〕

ヒトCYPIA2：塩基．配列，遺伝子構造，マウスおよびラット

遺伝子との比較と肝臓でのmRNA発現の個体差について

東京女子医科大学

      イケ

      池

小児科学教室（主任

 ヤ    キ    ヨ    コ

谷 紀 代 子

福山幸夫教授）

（受付 平成3年9月19日）

Human CYPIA2：Sequence， Gene Structure， Comparison with the

     Mo“se and Rat Orthologous Gene， and Differences in

       Liver IA2 mRNA Expr6ss蓋on

       Kiyoko IKEYA

Department of Pediatrics（Director：Prof． Yukio FUKUYAMA）

         Tokyo Women’s Medical College

   The human CYPIA2（cytochrome P3450）gene with 1906 basepairs（bp）of the 5’flanking region

and 113 bp of． the 3ダflanking region was sequenced． The gene spans almost 7．8 kilobases， comprising

seven exons and six introns． The transcript童onal start site was determined by both primer extension

and S I mapping． Including the first nohcoding exon of 55 bp， the entire mRNA is 3121 bp in lengthρnd

the open reading frame， starting with nucleotide 100f exon 2， encodes 515 amino acids（mol

wt＝58，294）． The CYPIA2 and CYPIA1（cytochrome P1450）genes in humans and rodents were

compared． Exons 2−6 were strikingly conserved， suggesting the encoded protein domain might be

important in the function of these enzymes． Although highly conserved regions were found in the

upstream sequences， exon l and intron l of human and rodents CYPIAI genes， human and rodents

CYPIA2 genes revealed similarity only in intron 1． It suggests the location of regulatory elements

might differ from each gene．

   The IA2 mRNA levels were different among 12 human liver samples． It may．reflect signif圭cant

genetic differences in CYPIA2 gene expression that could play an important role in individual risk of

enVirOnmental tOXiCity Or CanCer．

      緒  言

 P450遺伝子のsuperfamilyは現在14 families

よりなるとされ，うち9familiesは今までに検索

されたすべての哺乳類に存在している1）2）．P450・1

遺伝子family「は，ヒト，マウス，ラット，ウサギ

では2つの分子種よりなり，それぞれCYPIA1お

よびCYPIA2と名付けられている．

 1A1酵素はbenzo〔a〕pyreneや他のpolycyclic

hydrocarbonの代謝に3）∼6），1A2酵素は2−

acetylamino舳orene，己acetanilide， aHatoxin B、，

4・aminobiphenylや他のarylamineの代謝

に7）∼9），より強く関わっている．これら．のpolycy−

clic hydrocarbonやarylamineの多．くは1A1や

1A2酵素により代謝されて強い発癌性をもつ中

間産物となる．そのため，個体がこれらの．化学物

質にさらされたときに癌を生じる危険性は，これ

らの酵素の遺伝子が組織においてどの程度発現し

ているか，そのレベルと関係すると考えられ

る3）10）．

 CYPIA1遺伝子の調節については多くの研究が

なされてきたm12）． tetrachlorodibenzo−p・dioxin

（TCDD）， benzo〔a〕pyrene，βnaphthofiavone

R5一

などのインデューサーは芳香族炭化水素（Ah）受

容体に結合してインデューサー・レセプター複合

体をつくる．このインデューサー・レセプター複

合体には染色体結合能があり，染色体上のAh反

応部位に結合する．このAh反応部位はmRNA

のキャップ部位の上流，一1190と一880の間に存在

するAh反応領域のなかにある12）13）．一245と一50

の問にもまた近位反応部位があり，これは非誘導

性およびTCDD誘導性CYPIA1遺伝子の発現に

必須なものとされている．すなわち，TCDDによ

るCYPIA1の誘導が完全に行われるためには，遠

位反応部位に結合したタンパクと近位反応部位に

結合したタンパクとの相互作用が必要である14）．

これらタンパクの相互作用の結果，CYPIA1の転

写水準が一気に上昇して，mRNAのレベルが急

上昇し15）16），1A1タンパクが新たに生成され15）17），

1A1酵素の活性が誘導される18）．これらの研究の

多くは，CYPIA1の誘導が起こっている培養細胞

を使った実験で行われてきた2）19）．

 これに対し，CYPIA2遺伝子発現の調節機構に

ついてはまだ不明の点が多い．CYPIA2遺伝子の

誘導にはCYPIA1と同じAh受容体が必要であ

るが，一般に調節部位が存在するといわれている

5’側領域内でのマウスやラットのCYPIA1と

CYPIA2の相同性は高くない20）∼22）．肝臓における

1A2 mRNAのレベルは，薬物により誘導される

前でも最大誘導後の1AI mRNAのレベル程度は

ある15）．転写後の調節も誘導後の1A2 mRNAの

レベルに影響を与えている．インデューサー処理

により実際にCYPIA1やCYPIA2遺伝子の転写

速度が上昇するという報告がある15）23）24）が，CYPl

A2遺伝子の転写水準はラットの肝臓や肝細胞で

はまったく上昇しないという報告25）や，成熟ラッ

トの肝細胞の初代培養でわずかな上昇を認あたと

いう報告26）もあった．現在のところなぜこのよう

に結果に差異が生じたのか，その理由は明らかで

ない．ネズミについては肝臓や肝臓以外の組織で

のCYPIA1， CYPIA2遺伝子の転写および転写後

調節にちがいがあることが報告されている23）24）．

結局のところ，1A2タンパクも1A2酵素活性もと

もにインデューサーに反応した結果として存在し

ている．

 ヒトCYPIA2 cDNAの一部27）および全塩基配

列28）の報告の後，Quattrochiらはこの遺伝子に7

つのexonが存在することと， exon−intron接合

部，および5■側43bpの塩基配列を発表した29）．今

回著者はヒトCYPIA2の遺伝子構造とexon，

intron，5ノおよび31側の塩基配列，さらにヒトとネ

ズミのCYPIA1とCYPIA2遺伝子について比較

検討した．また，12例のヒト肝生検サンプルにつ

いて1A2 mRNAレベルを検討し，15倍以上とい

う著しい差異を認めた．二のようなCYPIA2遺伝

子発現の大きな差異は外来性の化学物質により生

ずる癌の発症に強く関与していると思われる．

        材料と方法

 1．ヒトCYPIA2遺伝子のクローニングと塩基

配列決定

 正常ヒト成人の肝臓のSau3A部分分解DNA

より作製したλEMBL3ライブラリーは， Umeno

博士（National Cancer Institute， NIH）の好意

によった30）．このライブラリーをexon 2の終りか

らexon 7の始めまでのヒトP3450部分cDNAで

ある700bpのプローブphP3450．2−7（図1）によ

りスクリーニングした．このプローブはexon 2の

5’部分とexon 7の3ノ側の非翻訳部位にある4つの

Alu配列を除いて作製したものである28）29｝31）．こ

れらから，互いに異なった酵素分解パターンを示

すファージクローンを2個得た．1つはCYPIA2

の5ノ側，他は3〆側のもので，どちらもintron 5に一

端があるが互いに重なりあってはいない．これら

のBamHIおよびBamHI／Sa11 fragment（この

Sall部位はλEMBL3のarmの1inker position

からのもので1ある）をpUC9にサブクローニング

し，M13にshot gunクローニングして32）， dideoxy

chain termination法33）により塩基配列を決定し

た．二重鎖のどちらも最低1回，平均4．6回行い，

塩基配列データおよびタンパクのデータは標準的

なコンピュータープログラムで検討した34）35）．

 2．プライマーエクステンションとS1ヌクレ

アーゼマツピング

 転写開始部位はプライマーエクステンションと

S1ヌクレアーゼマッピングの両者で確認した．

一36一

0

2

4

Kibbases

   6

8

1冨§謡§羅

   目 H一

斗 奎羅

LL

_{『’”†r†一「一}

一1，906bP

1

_2  3

 ■  腫

45 6

11 ■

  7 ＋7・8kb

蜀   phP3450．2−7

    probe

      図1 ヒトCYPIA2遺伝子の構造

7個のexonを黒塗り部分で示した．実線は塩基配列の決定されたintronと3’および

5’領域，点線はintron 3，5，6内の塩基配列未決定部分を示し，サザンハイブリダイゼー

ションにより0。1kb以内の誤差でそれぞれおよそ650，150，100bpと計算された．サザ

ンハイブリダイゼーションに用いたプローブphP3450．2−7はexon 2の3’端からexon

7の5’端までのcDNAプローブである．

Applied Biosystem 380B DNA synthesizerで作

製した24−merのオリゴヌクレオチドをプライ

マーエクステンションに，51−merのオ’リゴヌクレ

オチドをS1マッピングに使用した36）．どちらのプ

ローブもその5〆一端を〔γ32P〕dATP（New England

Nuclear）でT4ポリヌクレオチドキナーゼにより

ラベルし，ヒト肝臓poly（A）一RNAと・・イブリダ

イズして，S1ヌクレアーゼ処理や逆転写酵素反応

を行った．反応産物は8％ポリアクリルアミド

喝0％尿素ゲルにより分析した．マーカーとして

M13塩基配列を用いた．

 3．その他．

 今回の実験に用いたすべてのヒトDNAおよび

RNAサシプルは， Frank J． Gonzalez博士

（National Cancer Institute， NIH）の好意により，

正常ヒト成人の肝臓から得られたものである．

pheh32プローブはGonzalez博士より， pMA

actinはBruce Paterson博士（National Cancer

Institute， NIH）より頂いた． pheh32プラスミド

はヒトepoxide hydrolaseの1．8kbのfull length

cDNAを含み37）， pMA actinプラスミドはマウス

β・actin geneの一部，1．15kbを含んでいる38）．サ

ザンプロッティング39）は種々の制限酵素によりヒ

トDNAを処理し，それぞれ20μgを0．7％アガ

ロースゲルで電気泳動し，ナイロンフィルター

（Biotrace RP， Gelman Sciences Inc．）セこプロッ

ティングしてphP3450．2−7プローブとハイブリ

ダイズした．

 ハイブリダイゼーションはHybrisol（Oncor）

を用い，42℃で行った．フィルターの洗浄は3×

SSC−0．5％SDSを用いて65℃で行った．

 RNA分析はそれぞれ10μgのtotal RNAを

1％アガロースー2．2Mホルムアルデヒドゲル40）

で電気泳動し，ナイロンフィルター（Nytran，

Schleicher and Schuell Inc．）にプロッティング

して，Churchらの方法により41）， phP3450．2−7プ

ローブとのハイブリダイゼーショソを行った．

フィルターは2×SSC−0．5％SDSを用い，65℃で

洗浄した．

         結  果

 1．ヒトCYPIA2遺伝子と構造と塩基配列

 図1と図2にヒトCYPIA2遺伝子の構造と5〆

側，exon， intron，および3〆側の塩基配列を示した．

この遺伝子は現在までに調べられた哺乳類の

CYPIA1とCYPIA2遺伝子すべてと同様19），7つ

のexonよりなる． exon 2−6はヒトのCYPIA1と

CYPIA2の比較においても，ヒトとマウスの

CYPIA2の比較についても，高い相同性を示した

（表1）．ヒトとラットあるいはウサギのこれらの

遺伝子を比較した場合も同様に高い相同性がみら

れた．exonの相同性の高さは，これらのexonの

コードする部分のタンパクがIA1あるいは1A2酵

lqee LLAICLCAC-LITIICICAIJTTCAGCAATAAAAGCCCACTCCAgTCTAAATCAAAACTTCCCTCTCACATCCATGCCGCGCACA6TGeC leee ICALALCILTAAICCLAuCACIITGGuACOLCAAGGCACAAGGAJrGCTTCGGCCCAGAAGTTCAAGACCAACCTCCCCAACATCGCAAC

17ee

AtCrCCrCTLTACAAAkAAATtsITTAAAAATAAAkAAATTAGCCAGeCATGGIeCACACACCTC16AI16JCGTCCCAGCTACTCACGAG 16ee LCT.ALCCAACACCATIGTTTgAGCTCACGACCTCGAaaC;GCAGT6ACCCATCATGTCCCCACATaAACCCCAACCTGGGIGCACACAG

lsee

CASCACICILT-ICIAAAAAAAAAAAAAAAAGATACCAAALTTCCTITTCACATCCAATTTAACGCTTeTCCTCCTCCTCCTCTTACATC

14ee

TtsALICACAILTCtGTCCATATTAAACACTCCTTTAGTACAACAAACACCATATATCCTCAC6TAAGICCATGAATATCTCACATTTCTC

IJee

ATATCTACTTTLICTCGATTIATTCATACAIAGGTATACATICTTITAATIITATGGGTACATAGTACGTGTATATAIgTATOGGeTACA

12ee

ICAAAIGTTTTCATACAGGCATCCAATAIGAAATAAGCATICAJGGAGAATCCAGTAICCATCCCCTCAAaCAAGeAT4AACCJITeACT

1lee

TACAAACAATCCAATTACACTCTTTAAAGGTGIACAITTTTTTTTTTTTTTCACACGaAaTCTCACTC16TCGCCCAGGCTaGACTGGAG IGLLACGATLTI[gLTCACTCLAGCCTCCACCTCCCAACTTCAAeCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCCAGTAGCT6GGATCACAGGCAC leee ACCACCATGLCTGGCTAMTITTGTAIJTTTAGTAGAGACGGAGTTTCACCAGGTTGCCCAGGCIGCTCTTCAACACCTGATCTCAGG goe IGATCCaCCLilCTCeGCCT[TCAMGT( GGGAITACACGTGC6AGCCATCGCGCCTGGCCTSGACGTGTACAITJITTAACAG"CC

see

-TTLAAAACGAGCITGIGLGCATC-TCACACIILCATocTACACCATTAATCICCTAACAAIAAGgATACACTCC[ACATACCAICACAC

7ee

ICIuTTCACACLTAAAAAAAITTACATITATTCCAGAATATCATCTAAICTCCAGTCCGTGCTTACATGTCCCCAAITSTCCCCCAAAAC

6ee

ATCVJTAIACAJTTTTTTAAAATTTTglllAAATTGACCCATATCCAATCGATATGGCAATCAAATaCAAATCCAIATIGCAIrTGGIT

-see

ATGTrTCTTACTCTJTITGCATAAGGGGGCCCICTCITTASgATCAAAATTTTATCATCTeTTCTTTICCACTIGGGGACTTeaeCTGAA

iee

AAI.ACCAAGTGGCIGCAACAGCCATJTACIGITTCCTTITGCACGITGTTGCAGGGTACTACAGAAGAACATCCCTCTGGAGAGGCCCC

]ee

CJgACCCIGGTTGGCCTAGACTGACIGCCCTGCCAGAGCTCTTCCTCATGTGTGCAGTCCCAAACAAGCCCAGATCACJCCAAAGGCCTA

2ee

ACCLCCACTCCCAGACCCTACCCTACTCTICACAGAAATACCCTCCCTACCCTGAACCCTAAACACATCIACCTTCATCCCCAGGGACCC AaLiCCCCIICTCCCCTAJCCCCAAAaAGTCACCCTGGGTCJTAGGTAGTAGGTGGAGCTaACocATAAIQGCCCAAGGCCAA6AGTTCA

lee -se

}CCITCCAACTTTTICAGTGATCCAGCTTTCMATCAGGT6ATCAGGACAACCAGGCCAATCTCATAGaGGGCCaTGTTTATAAAAAGGC

+1 lnt[ent

CACTCACCTAGAaCCA aAAGCTCCACACCACCCATTACAACCCTGCCAMCTCAAGCACCTCCCTCTACAC CTACCITTCTTGGGACCAA

+lee

JTTACAATCT[TgGGATCCCCAACIATACAACCICGAAGCTAGTCGGGACACAAACACGGOGAGCCTGGGCTAGGTCTAGCGaTCCTGAG

2ee

TTCrGGGCITIGCTACCCAGCTCTTGACTTCTgTTICCCGAJTTTAAAIGAaCACITTCGACTAAGCCATTTTTAAGGAGAGCGATGGGC

see

AGGCCITCCCCLTIAGCACkAG[CCACCCCTGaCCCTGaCIGAAgCCCAACCCCAACCTCCAAaACTGTCACAGGAIGGeCACTCATCCC

4ee

GSAGGACGIGCCCTCCTCCTATTCATAAACAAIGCCCTGCGCACGGCGCATCACAGGCTATTIGMCCACCCCTCCCACCTTCCCCAC

see

CICAGrCTCSCTGGCTAuGGGCAACTCCTGalCCCTTGGGIATATGCAACGTATCAGCAaAAACCCAGCACJGGCACCCACTCTTTCGTA

6ee

CAATACCCAGCATCCAICCTGTCCCAOCGGCTGACAACCCJGCTGTCCTTGGCTTCCCCATTTIGGAGTGCICACTTGCCTCTACTCCAC

7ee

CCCCAaAAGTCaAAACTaACATGATCTGTGCAGGAGAGAOCCACCglTCATGTIaCGAATCTTCAGGCTCCITTCCAGCTCTCAGATTCT GTGAIGCTCAAAGCGTaAaCICTCTCCCCCCAGGACGCATCGTAGAIGGAGCTTAGTCTTTCTGGTATCCAGCTGCeACCCAACCACAGA

see

ACACGCATCAGTGTTTATCAAAAICACTCAGGAAATGAATGAMCAATelCTCCATCTCAACCCTCACCCTCGTCCCTCCITITTTCCCT

Exen2 9ee

CCAGITCCTACACATGGCATTglCCCACTCTGTICCCITCJCCGCeACAaAGCTTCICCICCCCTCTCCCAICTTCTGCCTGCTAITCTG

M A L S Q S V P F S A T E L L L A S A ] F C L V F vr

leee eCTGCTCAAGGCTTTGACCCCTCGGGJCCCCAAACGCCTGAAAACTCCACCAGAGCCATGGCGCIaaCCCTTCCTCCGGCATGTGCTGAC

vLKGLRPRVPKGLKSPPEPWGWPLLGHVLT

tlee

CCJGGGCAAGAA[CCCCACCTGGCACTGTCAAOGATGAGCCAGCCCIACGGGGACCTCCTaCAGATCCGCAJTGGCTCCACCCCCCTGCT

L G K N P H L A L S R M S O R Y G D V L a l R ] C S T P V L

12ee

GGIocTGAGCCGCCTGGACACCAICCGGCAGCCCCTGGTCCGgCAgGGCGACGAITTCAAGGGCCGGCCTGACCTCTACAeCTCCACCCTCA

v L S R L D T I R O A L v R a G O D F K C R P D L Y T S T L

lsee

_{rCACTCATGGCCAGAGCTTGACCTTCACCACAGACTCTCCACCGGTGTaGGCTCCCCCCCGGCCCCTGGCCCACAATCCCCTCAACACCT}

I T D C O S L T F S T O S G P v - A A R R R L A e H A L N T

14ee

TCTCCATCGCCTCTCACLCAGCTTCCTCATCCICCT.CTACCICGAGCAGCATGTGAGCAACCAeGCTAAGGCCCIGATCAaCAaCITGC

FSJASDPASSSSCYL[EHVSKEAKALISRL

lsee

ACeAGCJGATGGCAGGCCCTGGGCACTTCGACeCITACAATCAGCTGGTGGTCTCAGTGGCCAACCTCATTGGTCCCklGTGCTTCGGAC

O E L M A G P G H F D P r N e V V V S V A N V ] G A M C F C

16ee

_{AeCACJrCCCJGAGAGTAGCGATCAGATGCTCACCCTCGTGAAGAACACJCATGACTTCCTCaACACTgCCTCCTCCCCGMCCCCCTCC}

OHFP[SSDEMLSLvKNTHEfvETkSSGNPL

AclTCTTCCCCATCCITCGCTACCTGCCTAACCCTGCCeTCCAGACCTTCAAGGCCTTCAArCAeAGGTrCCTCIGGTTCCTGCACAAAA

OFFP[LRYLPNPALaRFKAFNQRFL-fLaK

t7ee ]ntren2

CAGTCCSGgAGCACTATCAeOACITTGACAACCTGACCCCGGGCTGCAGCTGGCAACGGGCACCTTGCAGgGCCTGGGTGCAGCCCCTCC

T V O E H Y O O F D K

lsee CICCCAGCTCCAGCATGCCCACACAGCTCCTGIGTTGCCAAGGCCTAGCAAGGCTCTGGACACCTCAGACCAGCTCTGTGACCTGGAGCC

lgee

GACTCTTCCCCTTCICTGCCCCTCAGITTCCTcATCCTTGAAGCCcCCTTCTCAGGGCICCTCAAACCCCCCAAGAAAAAAGCCCTGGAA

2eee

ATGGGGCCCTGAGCAGAGTCCTGCAAJGTGGCGGGCCTATaAGTGAOeCAAAGCTJTCATTCTGCAGAAACCTMACCCCAACAGACGCT

21ee

AATCCCCAOCTCIGSTGTeACCTTGCTTCCCTGTcTrCACACTAACCTTTTCCTJCTTTCGCAAMTC6ACCCCTGGTGTTATTGCGAGC

22ee

AAGCGTCASTGGGGCATAAAATGACACTITAAGCCATACCCAGGGCTGCTACCAGCTCCCTCGTCAACCTCCAACCCCTCCCATSCACCC

2see

AACTTGGCACCArACGGGGTACCCAGCCACCAGCTACAGGCcAGCGGACTGCAGCAACGTTCACCCTTTGACCTTGaAAelCCCAeAGTC

2 ltF

5'Ngthbl1,906bp fiftLVZ

utYUei .kO=-F S58,

bon3 t4ee

LCCCTAAGCTTCTGCCCCfTCASAACAtsTGTCCCaGACAIfACSeGTGCCCTaTTCAACCAeA.CAArAA"CfCttliCAGrCAeCc4cA

N S v R b l T e A L F K H S E K G P P A S G

;ntren) ?5ee

ACCTCAICCLACACCAGAAGATTGT[AACCTIGICAATSACATLTTTGSAGCAGGAGGAA(CACAACCT10Cff(TCCATrCACMCLC

N L I P O E K ] v N L V N D ] F G A

?59e

TGCIGTTCACCCACAGCCTTGCCCAGCCLCTCAeTCCATCAAATAACCCACCkACCCTAfATCACATCGTNAtATA"CAGAICTG"1

J 1 leb

TGG< 65e bp gop >OATCCTCCCCTAGGCTrCACITICCCGAICIeAACAATAAGCJGTTCICIGGCCTGTAAalcrA

GGCCCCIATAAIICCAGCAGCTAAICTCAAACCTGIATCTCAGTTTATGTTGAAGAgACCCAaeCTtlSTfTrfAGGAANTCACMGcl

S4

AGCGrCA6AGAAACCTAAJCCTGGATACATACATAGCAGAIACTTGGCAAATGATGGTTTCCTTGTTTCTVfTTCrTICrTJCCTCACC

j5 [xen4

1TACACTACACGeTICACGATTIGACACAGICACCACAGCCAICTfCTGGAGCCICATGTACCTTGI-NfAACCCTeAGAIACAgAgCA

G F D T V r r A ] S W S L M Y L v T K P E I e R

[ntren i ACATCCAGAAGCAGCTaCGTACATeGGLCCCCCCAACCCIATACCCAGGAGAAeCCITGAAACCCAGGTTCITTCTICAGTCTACAAS"

K ] e K E L

37

LCICTTATGTaeCTCCTGIGT6CAAeCCCTGGGCACACAGTAGrGCCTGCCCITGCCTAGAAGATGTCCCACGTTAGTfCGGTCGCAG-T

3e

T"JGAIAGACAGICITACATAGACICACAIGGeGTATAGAGGOtsTAITCATGGGeCAGITACGCAGCCCC16AeCTCT4CTTaTCCTCtG

[lienS 39

TLITtTACAaACACTCT-ATTGGfACGOAGCG6CGCCCCCGGCTCTCTGACAGACCCCAGCTCCCrTACTTGSAGGCCTTCAICCTGGA

D I v r G R E R R P R L S D R P O L P v L E A f ] L E

rntren5 4e

GACCTICCLACACTCCTLCTTCIIGCCCTICACCATCCCCCACAGGTSAGGCCTCCCGCTTeTGLeCICCCACCICTAAAGTeCJTaCCA

T F R H S S F L P F T i P H S

41

TCJTTTCTCTICCIGaCTICICAGCCCTGGCCCICGCTCAGCATCJCCTTCCGACCTCGTICCCCACAGATCCCGCCCTCAGTCTGCCtC

4?

CAICCAGTCCAAACATAATCTAACCCCCAGCTCTCAGCACAAACTTCCACCTGTCATCTCAGCTocTCATTCCCCTCTCITCATAITCCC TCCCTCCCACTGCCCTCJGTCCCAGTCAGGTCGGCCTCACCCTCACAAGCATCACCCTATTGGCCTrCAATCTTCCTAACGCTSAACCTT

4J

CTGCCTgCAATACCIICTAGCCJCTJCTCTCACCACCAGAATCCTACCCTTGCTCAAAGTCAATGCCGACACGAGCTTCCTCTCrCCAGA

4i 46 1b

ACCCTIITGACTCATCCAG< -- 15e bp gep--->TTCCCTGTTCCTCCCCTCCCCTCrCAGTaTAGGgATGCAGATGGCeeTa

CGCAGGCTGTCTSGATGGGGTGGAGGTAGGAGCAACACATGCCCCAocITTCCAGCCCTGAGCCTCAC-CTCCCCICTICCLTtCTCAa [ten 5 CACAACAAGGaACACAACGCrGAATGGCTTCIACATCCCCAAGAAATCCTGTGICTICCTAAACCACTGCCAGaTCAACCATbACCC

T T R D T T L N 6 F Y L P K K C C V f V N O w O V N H D P

lntrenS 4e

CTGAGTACATACCCCTCACCAAAAAAIeTGIGCAGGTTCACCAGTCA6GAAGCCTtlTTCTCCCTGrlAGCAACTGTTTATATAATGAAA

"9

GCAGGGACCTCAATCCTATAGTCTGCTCTAAgTaACGATATTTACAAAAITTACAAATTTAGTGFACAgGAATCAACTAGGATGGCCACG

se

CGCAGJGGCTCAAGCCTATAATCCCAGCAGTTTCGGAGGCAGGCACATCACTTaAGGTCAGaAGITTGAGACCAGCCTGGGCAACAT06T

51

aAAACCCTAICTCTACTAAAAATACAAAACAAAAATTAGCCGGACATGGTGGTGCGCeTATAAJCCACCTACTCCACAGGCTCAGGCAGG

52

AGAATTGCTTGAACICTGtsACGTAGAGGLTGCAGTGAGCCGAGATCCCTCCACJGCACTCCACCCTGGGTCACGGAGTGAGACTCTCeCT

55

CAAAAAAAAAAMAAAAATCAACCAAaACGITT"ITACAGGTGATGGTICCCCCAGGATICTACTGTGGTATCTAAGGIGGGuTAC[TCA

5-GCCCAIICTGAIGTCAATGGCICAGACACCTCICTTTGGAAACCCCCACTTIAGTCTATAGCTAGGGGCACCkTATATATAATTTACCAT

CCk<- - lee bp gep-- >GGTCTGCTGACTCATCCCIGTAACCCCAGCACTTTGCGAGTCCGAGaAACGgTGGATCGCTTSA

56 kb

GLTCATGAGICIGAGACCAGTGAAACCCCGTCTCTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATACAAAAATTACCrGCATATCGTGCCTGTAgT

57

_{CCtACCTACACCaCAGeCTCAGGTCGGTCGTTGCCITGAGCTGGGGAGGCAGAGAGAGTGCAGIGAGCTGAGATCGCACCACTGTACTCC}

5S

A.CCTGCGTaATACGAaCCGeAGCGTCICTCAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAACAAAAACAAAAAGAAATAAGCAICAAAGTJCAGTITG

sg

GllCCTTCCCACCTACCCTICATTGCTTTCAAAG"CCCTCACACTTGTCTTCTCAACA6AAelCICCCTCrCCCACGCACCICCTCCCA

[xon7 6e

GGCCCTCICCAGCCCTGAGgTCCCAICTCCTGCTCTTCCTCTTaCAC AGAGCTGTGaCAGaACCCCTCTGAGTTCCGCC TCACCGGTT

ELWEDPSEFRPERF

61

_{CCTCACCGCCGATGGCACTGCCATTAACAAGCCCIIGAGTGAGAACATGATCCTCTTTGGCATGSCCAAgCGCCGGTGTATCGGGGAAGT}

L T A D G T A T N K P L S E K V M L F C - C K R R C I C E V

62

_{CCTGGCCAAGTGGCAGAJCTTCCTCTJCCTGCCCATCCTGCTACAGCAACTGGACTTCAGCGTGCCCCCGGGCOTCAAAGTCGACCTGAC}

L A K - E I F L F L A I L L O O L E F S V P P G v K V D t T

CCCCATCTACCGGCTGACCATGAAGCACCCCCGCTGTGAACATGTCCAGGCGCGGCGCTTCTCCATCAAJTGAAGAACACACCACCATTC

P [ Y G L T M K H A R C [ H V O A R R F S I N .

63

TGAGGCCAGGGAGLGAGTGCGGCCCACCCACGCCGALTCAGCCCTTGTTTCTCTTCCTTICITTTITTAAAAAATAeCAGCTTTAGCCAA

64

_{alGCAaGGCCTGTAATCCCAGCATITIGGGAGCCCG6GCTTGGAGGATCATITGACCCCAGGAATTGGAAAGCACCCTGGCCAACATAGT}

65

GbGACCCTaTCTCTACAAAAAAAAAATITGCCAACACCCTGAGIGACAGAGCAAGACCCCAICTCAAAAAAASAACAAACAAACAAAAAA

66

_{AAAACCATATATATACATATATATATAGCAGCTTTATaGAGATATAAITCTTATGCCATATMTTCACCITLTTTTTJTTTIITGICTGA}

G7

GACAGAATCTCAGTCTCTCACCCAGGTIGGAGTGCAGTGGCCTCATCICAGCTCACTGCAACCTCCACCICCCACGTTCkACCAAICCTC

6e

CCACTTCAGCCTCCCAAGCACCTGGCATTACAAGCATGACTCAeTACGCCTGGCTGATTTTTGTAGTTTTAGTGGAGATGGGGTITCACC

S9

ATCTTGaCCAGGCTTGTCTCGAACICCTCACCCCAAGTTATCCACCTGCCTTCGCTTCCCAAACTCCTCGGATTACAGGIaTaAGCCkCC

7e

_{ACATCCAGCCTAACTTACAITCTTAAACTGrCGAATGACTTCTAGTCTAGAATTCTGCAACCATCACCAGAATTAATTTTATTMTCTTA}

71

TTAITTTTCAaACAeAGTCTTACTCTGIIGCCAGGCTGCAGTCCACTCCCGCGATCTCAGCTCACTACAACCTCCGCCTCCCATCTTCAA GCCATICTCCTuCCTCACCCTCCCCAGTAGCTGGGACTATAGATGCGCCACCATGGCCAGCTAATTTTJGTATTTITAGTAGAGACGACG

72

TTTCACTGTGTTGGCCACGATGGTCTCCATCTCITGACCTCGTCATCCACCCGCCTCAGCCTCCCAAAGIGCTGGGATTAACAGGTAIGA

73

ACCACCOCGCCCAGCCJTTITCTTrTTTITTTTTTCAGACACACTCITCCTCTCTCTCCTAAGCTCGAGIGCAGTGGCATCATCICAGCT

74

CACTGCSACCTCIGCCICCCAGGTTCAAGTGCTTCTCCAGCCTCGGCCTCCCMGTAGCTGAGACTACAC6CACAeACCACCACGCCTGG

75

CTAAIJTTTGTATIJTTGGTACAGACGCGTTTCACCATGTTGGCTAGACIAOTCTCAAACTCCTGACCTCAAGIGATCTGCCCGCCICCA

76

CCTCTCTCAAAGTGCTGCCATTACAGGJGTGAGCCACGCTGCCCGCCCCACAATTAATITTACAACAIITTCATCACCCCIAAAAGAAAC

77

ccTGcAcccATTAGcAGTcccTccAcAITTccccclAGccTcccTccccTGccTcAccAGcceTcccAscTscTAATcTAcTTTcTGTcl 1 Flank ng reg on CTATGGATITaCCTTCTCTAAACATTTCATATAAACTGCAATTACACAATGA GTCGTCTTTTCTCACTGGCITCTTTCACTTACCAC

lee

AMCITTCAACCCTTAGTCTeTGTTGTGGTGTGCCTCAGTAgCTCTTGGTGCTTAGTCTGGAACrGGCTAaCCTGTCC

X CYPIA2mefil iroigganyll

t3'getiwaza113bp ftftth< , exon 20eg10pt 1 tr

8 2z6515Xgo fil 2g4o rg 7.w esMwt27-29

tf Srbi6 exon 7tztS6

t31VcWk$frL(LN6.

pt o fffre tzz

L"(v6

.

X1 trcfi

JJk( g 7k U$ij ig eefc: L -( U N I) 'fiIfiE{tk ig E<

L.ft: lk 5 tza, ma VimtlZpt6!)ee7kD)lt:inpt

fil[IF･℃E> K) t F uD

7 it . f;: ivtligpt oD rEd

CYPIA2o 02 5 bg,

CYPIA2t CYPIAIX O ss, se

VinSl7klve fo6 e F k?9-O

N¥'S6 exon -s@ intron o)Fg

表1 ヒトCYPIA2遺伝子とヒトCYPIA1，マウスCYPIA2遺伝子との比較

％Similarity between

Base pairs

％Similarity between

hCYPIA2 and hCYPIA1

_hCYPIA1

_hCYPIA2

_mCYPIA2

hCYPIA2 and mCYPIA2

5ダFlank

（27） （1，604） （1，906） （1，843） （36）

Exon 1

42

90

55

51

59

Intron 1

37

1，998

833

1，067

51

Exon 2

80

851

840

836

80

Intron 2

36

556

621

589

50

Exon 3

58

127

121

118

79

Intron 3

（30）

87

（391）

653

（44）

Exon 4

80

90

90

90

81

Intron 4

51

91

262

278

52

Exon 5

91

124

124

124

83

Intron 5

（46）

145

（562）

772

（50）

Exon 6

84

87

87

87

83

Intron 6

（43）

192

（1，104）

1，464

（38）

Exon 7

41

1，227

1β04

586

68

3’Flank

（19） （113） （113） （1，249） （60）

．NUCALN program34）により比較した．ヒトとCYPIA2のexon 2を一マウスと比較するとヒトでは開始コドンの前とアミノ酸

配列の10番目にそれぞれ1個の塩基と1個のコドンが挿入されている．（）内はヒトCYPIA2遺伝子と5’および3’側領域の塩

基配列の決定された部分でのみ比較していることを示している，太字は塩基配列，塩基数のいずれも高い相同性を示したexon

である．h；ヒト， m；マウス

同性が高い．これはヒトとマウスは約8，000万年前

に分かれたが，CYPIAIとCYPIA2がその共通の

遺伝子から分かれたのはそれより古く，約3億か

ら3億5000万年前と計算されている42）こととよく

一致している，興味深いことに，exon 2，4，6そ

して特に5はこのパターンに当てはまらず（表

1），恐らくこれら相同性の高い部分が，遺伝子産

物すなわちこれらの酵素の構造や機能の上で，非

常に重要な役割を果たしているためと思われる．

あるいは，ヒトとネズミの進化上の分離の前に

CYPIA1とCYPIA2の遺伝子変換が起こったと

しても説明可能である．実際，多くのP450遺伝子

で遺伝子変換が起こったことは強く推定されてい

る19）43）ρ

 ヒトCYPIA2遺伝子はおよそ7．8kbである（図

1，2）．intron 3，5，6の塩基配列はまだ完成さ

れていないが，サザンハイブリダイゼーションに

より，塩基配列が決定されていないのはそれぞれ

のintronの中の0．1kb以下と推定される．例え

ば，BamHI処理で8．1kbのDNA断片が得られ

る（intron 1の5’側からexon 7の終わりまで）．

BamHIとSallでは6．OkbのDNA断片が得られ

る（intron 1か日exon 7まで）．同様に他の6種類

の制限酵素を単独あるいは複合で使用して検討し

た．phP3450．2−7は，特にexon 5においては，そ

の相同性の高さのため，ヒトCYPIA1遺伝子とも

・・イブリダイズするので，バンドがCYPIA1遺伝

子によるものではなく，CYPIA2遺伝子によるも

のであるとの判定には十分注意した．

 2．転写開始部位の決定

 プライマーエクステンションにはexon 2の中

から開始コドンATG（exon 2の10∼12bp）を5’端

とする24−merのオリゴヌクレオチドを使用した．

これにより88bpのDNA断片が得られ， exon 1は

55bpと推定された．

 S1マッピングには， TATAA配列より数bp下

流のAGGCCACTよりexon 1の方向へ51−bpの

オリゴヌクレオチドを使用した．S1ヌクレアーゼ

より保護されているDNA断片として31，30，29，

28bpの4種類があった（図3）．30，28，特に29bp

のDNA断片が転写開始部位のように見えるが，

プライマーエクステンションの結果を考え合わぜ

れぽ最も長い31bpのDNA断片が真の開始部位

である．他のDNA断片は恐らくその塩基配列の

一39一

エ ⊆≧ 併 出 益 臣 遷 臣

一

呈く

琶

 o

 ≡

 ま

 く

 Σ

 あ

τ

一二

∈壬

一一

・⊃ ・コ ：⊃ コ 。  o OOOO 「一一一一一1

0000

0」層一。唱▼一 く。卜σ 缶

8

5

岩 缶

8

拐 孚

一88bp

羨認、ぎ露幽

  ㌣灘

    “い一51

ミ・…

達 》．  ＋1

0

 −600

z

く

＝■1200

…一18。。

A       ／

ロコ コロロロコロコロ  ロコ 

A

      ．”1

／    1

    −  1

       1

  ；   MOU E cyp142

噌1800   −1200   −600     十1    ＋600   ＋900 ミ・18・・

達・1200

》

o ＋600

z   ＋1 《 Σ 一600 呈一12・・

B       ／！

     ’      ／

       ／

一一一一一一一一一一一ﾝで←

   ／i

，／ ・iMOUSE CYP噛A1

ノ

一31

図3 ヒトCYPIA2遺伝子のプライマーエクステン

 ションおよびS1マッピング

 左端にプライマーエクステンションで得られた88

 bpのDNA断片を示す． S1マッピングでは開始点で

 ある51−merのバンドが第3∼6レーンで見られて

 いるが，1，000単位のS1ヌクレアーゼとmRNAを

 反応させた第4レーンでのみ31，30，29，28bpのバ

 ンドが見られている．右端の4つのレーンはM13塩

 基配列によるマーカーである．

暫1500−1200−600  ＋1  ＋600 ＋1200十1800＋2400

ミ＋900

達＋600

＞

o  ＋1

を一…

α＝ 一900

c   ／

 ， ， ■     ポ

    ．．  1

       レ   

  ／MOU＄E cyp742

一1800   −1200   −600     ＋1    ＋600＋900

ミ珈．D

ミ

 一800

0

室一／／

1／ぞ

MOUSE cyp7」42

特殊性によるものと思われる．

 このようにプライマーエクステンションとS1

マッピングの両者から転写開始部位を決定し，

exon 1は55bpよりなることがわかった．

 3．CYPIA2遺伝子の調節部位

 CYPIA1とCYPIA2遺伝子はいずれもTCDD

誘導性であるから，転写調節領域は両者に共通で

あると推定される．1AI mRNAのキャップ部位

     一1200    −1000     −800     鴨600

図4 哺乳類のCYPIA1遺伝子とCYPIA2遺伝子の

 5’側領域，exon 1， intron 1のdot matrix alignment

 による比較

 25個のヌクレオチドのうち20個の相同性が見られる

 ときdotが1つ得られるようにした（80％相同性）．

 点線は5’側領域とexon 1の境界を示す．マウス

 CYPIA1およびCYPIA2，ヒトCYPIA2，ラット

 CYPIA2のすでに発表された塩基配列にもとづいて

 比較している．

より1，190bp上流に1個のnegativeおよび数個

のpositive−acting領域が存在している． CYPIA1

やCYPIA2遺伝子のようにexon 1がアミノ酸を

コードしていない遺伝子では，exon 1やintron 1

に調節領域が存在していることがある44）45）．

 そこで，ヒトCYPIA2遺伝子の5’側1，906bpと

exon 1，三ntron 1についてヒトCYPIA1遺伝子の

相当領域と比較した．ヒトとマウスのCYPIA2の

dot matrix alignmentで（図4A）， mRNAの

キャップ部位のすぐ上流域とヒトの一800および

マウスの一1，500のあたりに対角線がみられ，この

部分にいくらかの相同性があることがわかる．図

5にヒトの一800付近とマウスの一1，500付近の塩

一40一

  一841      ．      一8ee       −758

Hu恥σn   T丁T丁丁1『AACAGAACCA丁丁CAAAAGGAGGTTG丁GGGGATCATGACACT丁CCATGCTA      CAGCATTAATCTCCTAAGAATAAGGA了A

Mouse   下τTTTAAACAGAACCAACTGAAAGAAGGTTGCAGGCATCATGAAACTTCACCCCTAAAGCACACAGCAτTAATGTCCTAAGAACAAGAATA

  −1529       −15eo      −1439

  一146      一↑ea

Hurhon   AGGTGGAGCTGAGGGATAATGGCCCAAGGCCAAGAGTTGATCCTTCCAACT’rTTTCAGTGATCCAGCTTT

Mouse  AGGτGGAACTGAGGAGCCATGGCTTGAAGCCAAGAATTGATCCTTTCAGCTTTGTGCAGCA丁CCAGCTAT

  −155   ．     ．      司oo

       −50      −1

      CATA「「CAGGTGATCAGGACAACCAGGCCAATCTGATAGGGGGCGGTGTTTATAAAAAGGCCACTCACCTAGAGCCA

      GATATCAAGTGACCCGGGCACCTGGGCCAGTCCAGAGTGGGTGG−TGT−TATAAAA−GGCCCCTCG丁CGGAACCCAGAAGTCCTGG

      −5e       −1

       図5 ヒトとマウスのCYPIA2遺伝子5〆側領域の塩基配列比較

    ヒトー800付近とマウスー1500付近にみられた相同性の高い部分を示した．

基配列を示した．これら2ヵ所の塩基配列を比較

すると，一841から一758の84bpで80％以上，

mRNAのキャップ部位よりすぐ上流の146bpで

68％の相同性があった．これに対し，ヒトマウス

CYPIA2（図4A）とヒトーマウスCYPIA1（図4

B）を比較した場合，調節部位が存在するCYPIA1

の5！側領域はCYPIA2の相当部位に比べて相同

性の高さが目立っていた．このことはCYPIA2遺

伝子の調節部位が一1906よりもさらに上流か，

mRNAのキャップ部位よりもさらに下流に存在

している可能性を示す．あるいは，このようなシ

ス作用をもつ調節部位が存在するけれども非常に

短く，相同性も低くて，このようなdot matrix

alignmentでは認識されない可能性もありうる．

しかしながら，今までに報告されたすべての哺乳

類のCYPIA1遺伝子の上流に存在し，インデュー

サー・Ah受容体複合体と相互作用しているとい

われている5bpのCACGC box12）13＞は，ヒト

CYPIA2遺伝子の5■側領域1，906bpの中にはみら

れず，この領域に調節部位が存在する可能性は低

いと思われる．興味深いことに，ヒトおよびマウ

スのintron 1の相同性はCYPIA1とCYPIA2で

ほぼ同じ程度である．この結果は，これら2つの

遺伝子のintron 1の中に調節領域が存在する可能

性を示している．

 4．マウスおよびラットCYPIA2遺伝子5！側の

比較

 図6にマウスCYPIA2遺伝子の5〆側領域一

1843から一894の間を示した．マウスとラットの

CYPIA2の5’側領域， exon 1， intron 1の検討から，

マウスーラット間にはヒトーマウス間（図4A，4B）

やヒトーラット間（図省略）よりも高い相同性があ

ることがわかった（図4C）．この結果はマウスと

ラッ2トは約1，700万年前に分かれたものだがヒト

とネズミはそれより古く約8，000万年前に分かれ

たものであるという進化上のデータ46）47）とよく一

致している．マウスとラットのCYPIA2を比較す

ると（図4C），対角線は5〆側領域で3回， intron 1

で1回，中断される．図4Dは5〆側領域を拡大した

もので，中断の様子がよく観察される．これらの

領域には繰り返し配列が見られており，マウスと

ラットが分かれたのちの1，700万年前の間に遺伝

子挿入や遺伝子欠失によりこの繰り返し配列が生

じた可能性が考えられる．

 5．ヒト肝臓における1A2 mRNA発現の個体

差について

 12例の正常ヒト肝生検サンプルのノーザンプ

ロッティングは3．3kbの1A2 mRNAのレベルに

大きな個体差があることを示した（図7）．ニチジ

ウムブロマイド染色および2種のコントロールプ

ローブ（epoxide hydrolaseとβ一actin）によるハ

イブリダイゼーションの結果から，1つのレーン

に入れたRNA量に大きな差はないと思われる．

もちろん，epoxide hydrolaseやβ一actin遺伝子の

発現に個体差がある可能性もあるが，CYPIA2，

epoxide hydrolase，β一actinのmRNAが同じよ

一41一

一1840       一写80θ

CTGGTCTTGAACTCACAAAAATCCACCTCTGCCTCCGGAGTGCCCACCAC（⊃TGGCTGCCACCACGACCGCAACCACTGACACCACCCAATATCTTAAAATTGTACτTATCTA

      司70e

TTGTGTGTGAGACAGACAGAAAGAGAGG丁AGGTCAAGAGAGTACACATTTGTTAAGATGTACATGTGCCAAGGCACACATGGAGATCAAAGGACAACTCτ丁CCCACCACGTG

      −160e

AGτCCTGGGGATCCAACTCAGGTCATCAGGTTTGGTGCAGGCACCTTTACTCACTGAGCCGTCTCAACAGTCCCAAAAτGTACGCTTTTGTTτ丁TAAACAGAACCAACTGAA

 −15∈）∈｝       一14eo

AGAAGGTTGCAGGCATCATGAAACTTCACCCCTAAAGCACACAGCAT丁AATGTCCTAAGAACAAGAATATCTTCCTACATG丁GGTτTCAAlrGAGAATGGCCCCCATAGCTCA

       −15eo

TACATT丁GAτTGTTTGGTCCCCAGTTAGTGGAAC丁GCTTGGGAAGAATTAGAAGATGTGGCCTTGTTGGAGATGTGGCC了GGAGGACGTG丁GTCACTGGGGGTGGGCTTTGA

      −12②O

GGTTTCAAAACCCCATACCAGGCCCCATCT1「GGATCTCTCTGTCTGTAGCCτGAGGA丁CAGGATTCGAAGCCAACCAGGGCAGCTCATGCTCTCCACGGAGGCAGATAGGGA

       −1100

GG丁GCAT丁GTCCCCCATGAGTTGTCTTTGTTGTCTTTTAATTCCTTACCATCTTCCACAGGAGGGAGAGTGCAGAGAGAGCCTCCCTTTAGAATACAAAATTCτAAAGAAAA

      −1∈）oe

TAAAAGTTGGGAGAGGAGTTAAGACCTAAτTCAGTGGTAGAGTCCTCACCAAGTATG下TTGτGGATGTAGGTTCAGGTATGCGCTCGCGCGCGTGCGCGCACGCGCGCACAC

       −gee

_{ACACACACACACACACACACACATGGGTGTGGGGTGTGATGAGGTAGCTACAACATACATGTCATGGTTAATCTCCAGTGTCATCTTGATGGGATTTAGGATCACCTAGAAG}

      −800

GTGGTCCTCAGGGCATACCTTTCCTGAAAGGTAACTAAGGAGGGAAAGCCCAGCCTGAGTGTGGGCTATACCATACCTAGGCTGCAGTCCCTGGτTAATAACAACAACAAAA

         −70e

GACTCTAGAACTAGCAGTCCTCTCTCTCTCτCTCTCTCTCTCTCTGTG丁GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCT丁TCCTGACTGCAGATGCCATGTGAC

   −6②②      一500

CAGCCACTTCACATTCCTGCTGTTGCAACTCCTCTGCCACAATGGACτATACCCCAAAAGCATGAGCCAAAATAGτTCTTCCTTCCTCCCTCCCTT丁CTTCCTCCCτTCTTC

      −4②e

CTCCC丁TCCT丁CCT丁CCTCC丁丁CCCTCCCTTCCTTCCTTCCCTTCCTTT丁GTCAGGTAGATTGTTAATTCCAGAAAAGTCACGAGTACAATGCACCTCCCτATCTGCCTCCG

      −5②②

TGGAGAGCATGAGCTGCCCTGGTTGGCCTGGGGGCTAGGCCCGTCCATTCTCATGGGTGGAGAAGAGGττAτATCTGTTCATCCACCTAATTTT丁ACACCCτGAACCCTGCC

       −20e

CTGTCTT丁GAAAGAAGTGTATTCTTTCAAAGACATATACCTTGGCCCC丁AAAATGTCATACTTT丁TTATC丁CCATGAATATTTATCTCCATGGACCCCAAGCCAC丁TCTGAC

      −1eo

CCCAAGTGAAAGGTGGAACTGAGGAGCCATGGCTTGAAGCCAAGAAτTGATCCTTTCAGCTTTGTGCAGCATCCAGCTATGATATCAAGτGACCCGGGCACCTGGGCCAGTC

−5e

CAGAG丁GGGTGGτGTTATAAAAGGCCCCTCGτCGGAACCCAGAAGTCCTGG

      図6 マウスCYPIA2遺伝子5’上流域の塩基配列

    一700∼一450の間に（CT）nと（GT）nのくりかえし配列が存在している．一893よりmRNA

    キャップ部位間の塩基配列はGonzalezらによる20），

Probe＝

phPi3450．2−7

pheh32

pMActin

123456789101112

1欝翻醒……liiiiiiii｝iiiii｝iiiii…il

kb

＿3．3

、2．8

一t9

一2．1

図7 12例のヒト肝mRNAサンプルのノーザンハイ

 ブリダイゼーション

 1A2と1Al mRNAの大きさはそれぞれ3．3および

 2．8kbである31）48）．β・actinとepoxide hydrolaseの

 mRNAの大きさは2．1および1．9kbである38）44）．

うに減少あるいは増加している個体はなかった．

さらにdensitometryにより1A2 mRNA発現の

最も高いもの（sample 8）と低い．もの（sample 1，

11）のレベルには約15倍の開きがあることがわ

かった．

 patient 3は長期にわたる喫煙歴があり，12個の

サンプル中ただ1つ，2．8kbの1AI mRNAのバ

ンドが確認できた例であることは興味深い（図

7）．以前にも3−methylcholanthreneにより活性

化した培養ヒトリンパ球で，2．8kbの1Al mRNA

の誘導性には遺伝的な差異があることが報告され

ている48）．図7の1ane 3にみられる2．8kbのバン

ドは喫煙により誘導された1AI mRNAで，ここ

で用いたハイブリダイゼーショソの条件でP3

450，2−7プローブとクロス（交叉）ハイブリダイ

ゼーションしたものであろうと思われる．

         考  察

 本論文で，著者はヒトCYPIA2の塩谷配列を報

告し，遺伝子は7個のexonと6個のintronより

なっていて約7。8kbの大きさであることを示し

た．この結果は以前推定された約7．6kbという結

果29）にかなり近い．広範囲deletion analysisとコ

ンピューターによるラットCYPIA1上流の配列

の機能領域検索により，Fujisawa・Seharaらは15

kbの・ンセソサス配列5℃8T9♀T8TCAG

GC天鰐をもついわゆる薬物代翻節部位

（xenobiotic regulatory element）を報告した49｝．

また，最近Davisonらはこの薬物代謝調節部位と

一42一

共通なCACGCをdioxin反応部位として示し

た．このシス作用因子はAhREsとよぶことが提

案されている．これらのAhREs（AhRE2，

AhRE3， AhRE1）の中心はそれぞれマウスCYPl

Alで一1066，一991，一90312）13），ヒトCYPIA1で

は一1047，一976，一88912），ラットCYPIA1では一

1090，一1014，一89912）に存在している．ラット

AhRE3が幾つか並ぶとCYPIA1遺伝子の発現が

促進される49）．gel mobility shift assayl）3）14）50）や

methylation interference analysis14）によりこれ

らAhREsの少なくとも1つはAh受容体に作用

していること，またCYPIA1の誘導に必要である

ことが明らかになった．CYPIA2遺伝子にも

AhREは存在しているのだろうか？ ヒトCYPl

A2の5ノ側領域1906bpの中にはなかった（図2）．ま

たヒトCYPIA2のpo§itive strandの十800bp

（intron 1），十1145bp （exon 2），十6．25kbおよ

び＋7．45kb（いずれもexon 7）とnegative strand

の＋6．2kbと＋6．7kb（いずれもexon 7）に

CACGCはなかった（図2）．マウスおよびラット

の今までに報告されたCYPIA2遺伝子配列のど

こにもCACGCはない．ヒトにもないので，この

配列がヒトCYPIA2遺伝子の発現に重要である

とは考えにくい，

 GGGCGGという配列は種々の遺伝子の転写調

節因子であるSp1に結合する51）． CYPIA1遺伝子

ではこのGGGCGGはAhRE3とAhRE1の間に

あり，マウスでは一952，ヒトでは一943，ラット

では一975に位置している．この6bp boxはこれら

3種においてその位置や周囲との関係がよく保存

されており，CYPIA1遺伝子の発現に大きな役割

を担っていると思われる12）．しかし，ヒトCYPl

A2遺伝子においてこのGGGCGGはnegative

strandの一907とpositive strandの一32（図2）

にあるが，他の部位にはない．マウス，ラットで

はまだ見出されていない．すなわちこの配列は三

つの動物種で保存されていないので，ヒトにおけ

るCYPIA2の発現に重要とは考えにくい．

 正常ヒト肝臓における1A2 mRNAレベルの差

異は注目すべきことである．mRNAの発現レベ

ルは本来もっている基礎レベルと薬物などにより

誘導されたものとによって規定される．動物実験

ではpolycyclic hydrocarbonやTCDD，β一

naphthoflavoneによるCYPIA1とCYPIA2の誘

導は，それぞれの動物のAh受容体に対するイン

デューサーの親和性に応じた値を示した2）11）19）．こ

こでのサンプルには長期にわたって薬物が使用さ

れていた例はなかったが，sample 3は喫煙者から

得られたもので，喫煙がmRNAの発現に及ぼす

影響を考慮する必要がある，図7において，sam−

ple 3では喫煙により2，8kbの1AI mRNAのパソ

ドが非常によく誘導されているので，同時に検出

された3．3kbの1A2 mRNAは少なくともその一

部は喫煙により誘導されたものと考えた，図7の

他のサンプルでの1A2 mRNAが，発現の基礎値

を示しているのか，一部誘導されたものを含んで

いるのかは不明である．しかし，マウスの肝臓では

1A2 mRNAの基礎値は最大限に誘導された1Al

mRNAのレベルとほぼ等しいというデータがあ

り15），図7に示されたようにsample 3を除く他の

11サンプルでは1AI mRNAは誘導されていな

い．そこで，証明はできないが，ここに示された

個体間の1A2 mRNAレベルの差異は， CYPIA2

遺伝子の誘導による差異よりも，遺伝的に決定さ

れている基礎レベルの差異を反映しているものと

思われる．

 最近，4−aminobiphenylや他の芳香族アミンの

ヘモグロビン付加物の測定は，喫煙者に膀胱癌発

症の危険性が高いことを生化学的に理解する上に

役立つことがわかった52）．ヒトにおいて肝臓での

CYPIA2遺伝子発現には15倍以上の個体差が存在

する（図7）．こういつた個体差が，癌発生におけ

る環境因子の検討において常に問題となる遺伝的

な背景を説明するのに役立っかもしれない．

CYPIA2遺伝子が誘導されやすいか否かというこ

とと同様，mRNAレベルの高低は，個人の生活様

式や職業上のリスクを考える一ヒで有用かと思われ

る10）．

         結  論

 1）ヒトCYPIA2（cytochrome P3450）遺伝子

・の塩基配列を決定し，およそ7．8kbで7個のexon

と6個のintronよりなることを示した．

一43一

  2）全mRNA．は3，121bpでcoding regionは

exon 2の第10ヌクレオチ．ドから始まり，．515個の

アミノ酸をコードして，分子量58，2．94のタソバ．ク

を生成する．転．写開始部位はプライマーエクステ

ンションおよびS1ヌクレア「ゼマッピングの両

者で確認した．

  3）ヒト，マウス，ラット．の5■側領域，exon 1，

intron 1の塩基配．列を比較した結果， CYPIA2遺

伝子の制御部位はCYPIA1遺伝子とは異なった

部位に存在することが示唆された．

  4）ヒ．ト肝臓における1A2 m．RNAのレベルに

は大きな個体差が存在し，CYPIA2遺伝子発現に

おける遺伝的相違，即ち外来性の化学物質により

誘発される癌に対して個．体が有する遺伝的危険性

を反映する可能性があると思われた．

  稿を終えるにあたり，ご指導ならびにご校閲を賜り

ました福山幸夫教授，斎藤加代子講師に心から感謝致

します．また研究に直接多大なるご指導，ご教示を賜

り，発表の機会を与えてくださいました米国NIHの

D．W． Nebert博士に厚く御礼申し上げます．なお，こ

の論文の図表はThe Endocrine Societyの許可を得

て，K， Ikeya et aL・． Journal of Molecular Endo−

crinology， Vo1．3．， No．9，13994408より引用した．

      文  献

  1）Nebert DW， Nelso皿DR， Adesnik M et a1：

     The P450 gene superfamily：Update on listing

     of all genes and recommended nomenclature of

     the chromosomal loci． DNA 8：1−13，1989

  2）Gonzalez FJ：The molecular biology of cyto・

     chromes P450． Pha㎜acol Rev 40：243−288，

     1988

  3）Conney AH：Induction of microsomal

     enzymes by foreign chemicals and car・

     cinogenesis by pglycyclic aromatic hydrocar−

     bons． Cancer Res 42：4875．一4917，1982

  4）Pelkonen O， Nebert DW：Metabolism of

     P61ycyclic aromatic hydrocarbons：etiologic

     role in cartinogenesis． Pharmacol Rev 34：

     189−222， 1982

  5）Negishi M， Nebert DW：Structural gene

     products of the Ah locus． Genetic and．immuno・

     chemical evidence for two forms of mouse liver

     cytochrome P−450 induced by 3・

     methylcholanthrene． J．Biol Chem 254：

     11015−11023， 1979

      −44一

6）Reik LM， Levin W， Ryan DE et al：Immuno−

   chemicall relatedness of rat hepatic Inicrosomal

   cytochromes P・450c and P−450d． J Biol Chem

   257：3950−3957， 1982

7）Kamataki T， Maeda K， Yamazoe Y et a1：A

   high−spin form of．cytochrome P−450 highly

   purified from polychlorinated biphenyl−treated

   rats． Catalytic characterization and immuno−

   chemical quantitation in．liver microsomes． Mol．

   Pha㎜aco124：146−1．55，1983

8）Kad垣bar FF， Hammous GJ：The role of

   cytochrome P−450 in the血etabolism of chemi−

   cal carcinogens．動Mammalian Cytochrome

   P・450（Guengerich FP ed）， Vo11， pp1−55， CRC

   Press， Boca Raton（1987）

9）Faletto MB， Koser PL， Bat加1a N et al：

   Cytochrome P3・450 cDNA encodes aflatoxin B1

   4・hydroxylase． J Biol Chem 263：12187−12189，

   1988

10）Nebert DW：Genes encoding drugmetaboliz−

   ing enzymes：Possible role in human disease、

   動Phenotypic Variation in Populations（Wood−

   head AD， Bender MA， Leonard RC ed．s）， pp45

   −64，Plenum Press， New York（1988）

11）Whitlock JP Jr：The regulation of gene

   expression  by  2，3，7，8・tetrachlorodibenzo−P−

   dioxin． Pharmacol Rew 39：147−161，1987

12）Nebert DW， Jones JE：Regulation of the

   ．mammalian cytochrome Pr450（CYPIA1）gene。

   Int J Biochem 21：243−252，1989

13）Denisou MS， Fisher JM， Whitlock JP Jr：

   The DNA． recognition site for the dioxin・Ah

   recepter complex。 Nucleotide sequence and

   functional analysis． J Biol Chem 263：

   17221−17224， 1988

14）Neuhold正A， Shimyoshi Y， Ozato K et al：

   Regulation of mouse CYPIAI gene expression

   by dioxin． Requirement of two cis−acting ele−

   ments during the induction process． Mol Cell

   Bio19：2378−2386，1989

15）Gonzalez FJ．， Tukey RH， Nebert DW：Struc一．

   tural gene products of the Ah locus． Tran．

   scriptional regulation o．f cytochrome P．r450

   and P3・450 mRNA levels by 3−methylcholan・

   threne． Mol Pha㎜aco126：117−121，1984

16）Israe】DI， Wbitlock JP Jr：Regulation of

   cytochrome PI−450 gene transcription by 2，3，7，

   8−tetrachlorodibenzo−p・dioxin in wild type and

   variant mouse hepatoma cells， J Biol． Chem

   259 ：5400−5402， 1984

17）T血key RH， NegisLi M， Nebert DW：Struc−

   tural gene product of the Ah complex． Evi・

dence for transcriptional control of

chrome Pr-450 induction by use of a cloned

DNA sequence. J Biol Chem 256l6969-6974,

l981

18) Negishi M, Jensen NM, Garcia GS et al:

Structural gene products of the murine Ah

locus. Differences in ontogenesis, membrane

location, and glucosamine incorporation

between liver microsomal cytochromes Pi-450

and P-448 induced by polycyclic aromatic

pounds. EurJ Biochem 115:585-594, 1981

19) Nebert DW, Gonzalez FJ : P450 genes :

ture, evolution and regulation. Ann Rev

chem 561945-993, 1987

20) Gonzalez FJ, Kimura S, Nebert DW :

parison of the flanking regions and introns of

the mouse

inducible cytochrome Pi-450 and P3-450 genes. J

Biol Chem 260:5040-5049, 1985

21) Sogawa K, Gotoh O, Kawajiri K et al :

tinct organization of methylcholanthrene- and

phenobarbital-inducible cytochrome P-450

genes in the rat. Proc Natl Acad Sci USA 83 1

8044-8048, 1984

22) Segawa K, Gotoh O, Kawajiri K et al :

plete nucleotide sequence of a

lanthrene-inducible cytochrome P-450 (P-450d)

gene in the rat. J Biol Chem 260:5026-5032,

1985

23) Kimura S, Gonzalez FJ, Nebert DW:

Tissue-specific expression of the mouse

inducible Pr-450 and P3-450 genes : Differential

transcriptional activation and mRNA stability

in liver and extrahepatic tissues. Mol Cell Biol

6l1471-1477, 1986

24) Soderqvist P, Poellinger L, Toftgard R et al :

Differential expression of the cytochrome

450c and P-450d genes in the rat ventral

tate and liver. Cancer Res 48 : 3045-3049, 1988

25) Pasco DS, Boyum KW, Merchant SN et al:

Transcriptional and post-transcriptional

lation of the genes encoding cytochromes

450c and P-450d in vivo and in primary

patocyte cultures. J Biol Chem 263 : 8671-8676,

1988

26) Silyer G, Krauter KS: Expression of

chromes P-450c and P-450d mRNAs in cultured

rat hepatocytes. 3-Methylcholanthrene

tion is regulated primarily at the

scriptionai level. J Biol Chem 263:

11802-118e7, 1988

27) Quattrochi LC, Okino ST, Pendurthi UR et

al: Cloning and isolaion of human

chrome P-450 cDNAs homologous to

inducib}e rabbit mRNAs encoding P-450 4 and

P-450 6. DNA 4 I 395-400, 1985

28) Jaisvval AK,.Nebert DW, Gonzalez FJ:

Human P3 450: cDNA and complete amino

acid sequence. Nucleic Acids Res 14 I

6773-6774, 1986

29) Quattrechi LC, Pendurthi UR, Okino ST et

al: Human cytochrome P-450 4 mRNA and

gene : Part of a multigene farnily that contains

Alu sequences in its mRNA. Proc Natl Acad

Sci USA 8316731-6735, 1986

30) Umeno M, McBride OW, Yang C-S et al:

Human ethanol-inducible P450IIEI : Complete

gene sequence, promoter characterization,

chromosome mapping, regulation, and

directed expression. Biochemistry 27l

9006-9013, 1988

31) Jaiswal AK, Nebert DW, McBride OW et al :

Human P3-450: cDNA and complete protein

sequence, repetitive Alu sequences in the 3'

nontranslated region, and localization of gene

to chromosome 15. J Exp Pathol 3l 1-17, 1987

32) Deininger PL: Random subcloning of

sonicated DNA : Application to shotgun DNA

sequence analysis. Anal Biochem 129:

216-223, 1983

33) Sanger AF, Nicklen S, Coulson AR: DNA

sequencing with chain-terminating inhibitors.

Proc Natl Acad Sci USA 74 : 5463-5467, 1977

34) Wilbur WJ, Lipman DJ: Rapid similarity

searches of nucleic acid and protein data

banks. Proc Natl Acad Sci USA 80 1 726-730,

1983

35) Staden R: A new computer method for the

storage and manipulation of DNA gel reading

data. Nucleic Acids Res 8 : 3673-3694, 1980

36) Ansubel FM, Brent R, Kingston RE et al:

Current Protocols in Molecular Biology. pp4.6.

1-13, 4.8.1-3, Wiley Interscience, New York

(1987)

37) Skoda RC, Demierre A, McBride OW et al :

Human microsomal xenobiotic epoxide

hydrolase. cDNA sequence, cDNA-directed

expression in COS-1 cells, and chromosomal

localization. J Biol Chem 263 l 1549-1554, 1988

38) Aloniso S, Minty A, Bourlet Y et al :

ison of three actin-coding sequences in the

mouse : Evolutionary reiationships between the

actin genes of warm-blooded vertebrates. J Mol

Evol 23:11-22, 1986

-45-39) Southern EM: Detection of specific

sequences among DNA fragments separated by

gel electrophoresis. J Mol Biol 981503-517,

40) Lehrach M, Diamond D, Wozney JM et al :

RNA molecular weight determinations by gel

eiectrophoresis under denaturing conditions : A

critical reexamination. Biochemistry 16 1

4743-5751, 1977

41) Chureh GM, Gilbert W: Genomic

ing. Proc Natl Acad Sci USA 81 : l991-1995,

1984

42) Heilmann LJ, Sheen Y-Y, Bigerow SW et al :

The trout P4501Al. Deduced protein sequence,

expression in liver, and evolutionary

significance. DNA 7 1 379-387, 1988

43) Atchison M, Adesnik M : Gene conversion in

a cytochrome P-450 gene family. Proc Natl

Acad Sci USA 83 l 2300-2304, 1986

44) Hahn SL, Hahn M, Hayward WS:

tural organization of upstream exons and

tribution of transcription start sites in the

chiken c-myb gene. Mol Cell Biol 9 1 837-843,

1989

45) Ng S-Y, Gunning P, Liu S-H et al:

tion of the human P-actin promoter by

stream and intron domains. Nucleic Acids Res

17l601-615, 1989

46) Wilson AC, Carlson SS, White TJ :

ical evolution. Annu Rev Biochem 46 1

573-639, 1977

47) Miyata T, Hayashida H, Kikuno R et al:

Molecular clock of silent substitution : At least

six-fold preponderance of silent changes in

mitochondrial genes over those in nuclear

genes. J Mol Evol 19:28-35, 1982

48) Jaiswal AK, Gonzalez FJ, Nebert DW:

Human Pi-450 gene sequence and correlation of

mRNA with genetic differences in benzo [a]

pyrene metabolism. Nucle'ic Acids Res 13 1

4503-4519, 1985

49) Fujisawa-Sehara A, Sogawa K, Yamane M et

al : Characterization of xenobiotic responsive

elements upstream from the drug-metabolizing

cytochrome P450c gene: A similarity to

glucocorticoid regulatory elements. Nucleic

Acids Res 15:4179-4191, 1987

50) Hapgood J, Cuthill S, Denis M et al : Specific

protein-DNA interactions at a

responsive element : Copurification of dioxin

recepter and DNA-binding activity. Proc Natl

Acad Sci USA 86 : 60-64, 1989

51) Kadonaga JY, Jones KA, Tjian R:

Promoter-specific activation of RNA

ase II transcription by Spl. Trends Biochem

Sci 11120-23, 1986

52) Bryant MS, Vineis P, Skipper PL et al:

Hemog}obin adducts of aromatic amines:

Associations with. smoking status and type of

tobacco. Proc Natl Acad Sci USA 85 :

9788-9791, 1988