無菌マウス腸管内での好気化したBificobacteriumの嫌気性菌への復帰（II)

(1)

5 ( 東女医大誌第

5

4

巻第

1

2 号

)

頁

1

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昭和

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年

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無菌マウス腸管内での好気化した

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の嫌気性菌への復帰 (

I

)

東京女子医科大学微生物学教室 ( 主任吉岡守正教授〉北里研究所細菌室一げ口

け原

シ

コ子

ム口 ( 受付昭和

5

9

年8月11日〉

Restoration o

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Anaerobic Character i

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Germfree Mice o

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the Facultative Anaerobe Mutant o

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Yoshiko HARAGUCHI

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緒言偏性嫌気性梓菌

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から，好気培養で生育できるような株を得るべく，ある条件下で継代培養をくり返すうち，通性嫌気性連鎖球菌を得たI九この大きな変化が

contamination

でないことを証明する意味もあり，好気化株が再び偏性嫌気性菌にもどるか否かを実験した.初めに仇

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で試みたが成功せず，無菌雌マウスの消化管に定着させたところ，偏性嫌気性連鎖球菌及び連鎖球梓菌が得られた2) これには成熟雌マウスを雄マウスと同居・交配さぜるか1)， 2種の性腺刺激ホルモン即ち

pregnant mare serum

gonadotropine

と

human chorionic

gonadotropine

を2度接種し，偽妊娠処置をする必要がある3) このことは交尾刺激による黄体相の導入が必要であることを示陵している.そこで頚管刺激をせずに，プロゲステロンの投与により黄体相の導入を行い

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が起るか否かを試みた材料菌株 ;

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よりの分与株を

BL

寒天平板培地上で48時間嫌気培養後，単集落をレサズリン無添加チオグリコレート

(TG

C)培地に接種，増殖後

1

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2

_mg/ml

_{レサズリン加}

_TGC

_培地，

_0.25%

アルギニン加

L

ブロス，

L

ーブロスへと継代し，好気条件の

L

ブロス継代中に非常に良く増殖した株である.

1

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7

(2)

6 投与菌液

F M

9

1

を

BL

寒天培地上で3TC48時間嫌気培養後単集落を L ブロスに接種，好気条件下で3TC約18時間培養した.培養菌液は洗浄後

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X

102_{個 /ml}_の_L_{ーブロスに再浮遊させ，その} 0.2m

l

/

mouseを投与，同時に通性嫌気性であることを確かめ，菌数計算を行った. 使用動物.日本クレア由来

ICR

無菌マウスを常法通り飼育し，光制御は行わなかった. 方法マウス実験:菌投与後週

2

度検便し嫌気性菌のないことを確かめ 4週後pregnantmare serum gonadotropine (PMSG) 2国際単位(IU)/mouse

を午後4.30時に， human chorionic gonadotropine (hCG) 2IU/mouseを48時間後に各雌マウスの腹腔内接種，これを

1

日間隔で

2

度接種した.偽妊娠処置は最後のhCG接種の2時間後，McGill変法5)で行い，プロゲステロン処置は最後のhCG接種の翌日午前

7

時1.8mg/mouseを皮下接種した.接種 4日後腸管培養を行った.この時，卵巣に黄体が存在することと腔脂膏像を検ベdiestrouse期にあることを確かめた. 嫌気性菌の分離:マウスの消化管を胃・小腸上部・中部・下部・回盲部・直腸部に分けホモジナイズし，これを

BL

寒天培地とブレイン・ハート・インフュージョン血液寒天培地にduplicateにまき，一方は好気，他方は嫌気培養した.replica platingで嫌気培養でのみ発育する株を

5

代以上継代して，なおその性状を維持しているものを偏性嫌気性菌とした. 結果はじめにプロゲステロン量を決めるための実験を行った.即ち12週齢以上の成熟雌マウスにプロゲステロン0.6mg/mouse，

1 .

2mg/mouse，

1 .

8 mg/mouseを接種して嫌気化した菌が分離されるか否かの実験を行いTable 1の結果を得た.0.6 mg/mouseでは効果はなく， 1.2mg/mouseでは分離当初は嫌気性菌であるが，確認のため5代の継代培養の聞に好気条件でも生育出来る通性嫌気性に戻ってしまい，腫脂膏像は 8 日目には estrous期を示す例があった.1.8mg/mouseでは安定な菌が得られた.そこで本実験では使用マウ Table 1 E任ectiveconcentration of progesteron巴 for reversion from the facu1tative anaerobe to ana巴robicrevertants Progesterone No. of mice No. of mice concentration with anaerobes* with anaerobes*ホ 1.8(mg) 3/5

。

/5 1.2 4/10 3/10 0.6

。

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。

/5 事Stableanaerobes. **Unstable anaerobes which reverted to facultative anaerobes by several transfers. スに1.8mg/mouseのプロゲステロンを接種することとした. Table 2はゴナドトロピン接種とその後の各処置によっての偏性嫌気性菌へのrevertantの出現度をみたものである.ゴナドトロビン接種のみではrevertantは得られていない.頚管刺激による偽妊娠処置系，プロゲステロン接種による偽妊娠処置系，交配した系はゴナドトロビン接種のみの場合とは明らかな差がある.しかしホノレモンコントロールを全くせずに自然排卵・自然交配した系で一番高率に得られている. Table 3は原株

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と好気化株

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1

，それを無菌マウスに投与し，再び偏性嫌気性にreverseさせた

J

461株の生物学的性状を示した.

J

461は偏性嫌気性lこ戻ったが，形態は連鎖球菌のままであり，アルドラーゼ活性に関しては

B

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は活性はないが

J

461は 1258ー Table 2 E妊ectof various treatments for rever -sion from facultative anaerobes to anaerobic bacteria Gl otnI adotroplnε Another No. of mice Group _r_e_a_t_m_e_n_t _t_r_e_a_t_m_e_n_t_s with without anaerobe A 2 times 。(0%) 10 B 2 times _s_tc_ie_mr_uv_li_ac_ta_il_o_n 4(40%) 6* C 2 times pro.g_m1i_]ee_esc_ctt_tei_l_o口r_none 6(60%) 4*命 D 2 times mating 6(66%) 3** E mating 8(73%) 3** * : Di妊erence in significant level of p < 0 . 05 from group A H ・Di妊erence in significant level of p

<

0.01 from group A

(3)

Table 3 Biological properties of variant strains B. bifidum叫 J 461"' FM 910 ' 567 Gram stain 十

+

Shape rod COCCl COCCl

Aerobic cultue _α_._h_e_m_o_l_y_t_i_c on blood agar Gas production Catalase Indole production Liquefaction of gelatin Nitrate reduction Aldolase

。

₊

_十_十 activity Spore location Major fermentation L，A L L products a) B.坦坦旦旦ニoriginalstrain b)J 461 = anaerobic revertant c) FM 91=converted facultative anaerobic type Symbols: L=lactic acid A=acetic acid

F M

91より少いが持っている.発酵生成物は原株は乳酸・酢酸である.好気化株は分離当初に少量の酢酸を生成したが，継代中になくなり乳酸のみを産するようになった.その

F M

91から変った

J

461は乳酸のみを産する.その他の性状は 3株とも同じである.これらのことから

J

461は原株と好気化株の

F M

91の中間にあることを示している. 考察マウスやラットでは卵胞が成熟すると自然に排卵が起り，その跡に黄体が形成されるが，この黄体には機能がなくゲ、スターゲンをほとんど分泌しない.しかし頚管刺激を与えると黄体は機能を有するようになり，妊娠しない場合にも子宮は妊娠前期の性状を呈すようになる.この状態が偽妊娠であり，頚管刺激がないと黄体相の導入が出来ないこと7)を不完全性周期という. 先の実験町こおいて無処置の系，ゴナドトロビン投与のみの系，腔無関口の系からは偏性嫌気性 revertantは得られず

2

度のゴナドトロピン接種後偽妊娠処置又は交配させると得られることを報告した.これはゴナドトロビン接種と頚管刺激が必要であることを示唆している.本研究では雌 7 マウスが元来不完全性周期であることを利用して，ゲスターゲンのなかで生理的意義の最も大きいプロゲステロンを使用して黄体相の導入を行なった. 堀越等4)はラットを使いプロゲステロンを午前

6-7

時に一度に大量投与するとその時間帯に偽妊娠の誘起があると報告し，村上等6)はプロゲステロンの投与は黄体の機能を維持する作用のあるプロラクチンのサージを引き出すことを，高橋等叩プロラクチンサ一ジと呼応する形をとり，サージ維持に欠くことが出来ない存在であることを示した.サージはノグタナールサージとダイアナールサージがあることが確かめられておりへこの実験ではノクタナールサージに合せてプロゲステロンを接種した.腸管培養は先の実験で嫌気化株がよく得られた交配

4

日後，即ちプロゲステロン接種目より 5日目に行った. 2度のゴナドトロピン接種後交配した系，頚管刺激を行った系，プロゲステロン接種の系で行いTable

2

の結果を示した.ゴナドトロンピン投与のみの系と投与後

3

種のうち何れかの処置をした系との間には有意差があるが

3

種の処置の聞には有意差はなく，そして自然排卵・自然交配との聞にもない，機能黄体を持たない時は嫌気化株の出現はなく，黄体相を導入すると得られるということはプロゲステロンがこの菌の偏性嫌気性へのreversion~こ大切な働きを示していると思われ，肝で不活化され大部分は消化管中へ排

i

世されるといわれていることとと考え合せると，消化管の生理作用に何らかの変化を与え菌がその影響を受けるようなことがあるのかも知れない.1μg/ml， 10μg/ml， 100μg/ml， 1 mg/mlの4・pregnen-dione-3-carboxymethy

lox-ine:

BSA

と

F M

91を混合培養しでも revertant

は得られなかったことから，プロゲステロンは直接菌に作用するより間接的な作用と考えられ，このことは今後追究しなければならない問題である. 結圭五回ロ著者は先に偏性嫌気性菌

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を好気条件下で一定の液体培地を継代培養し， stre -1259ー

(4)

8 ptococcusに類似した好気化株を得た.この株をもとの性状に戻すことを目的として

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で試みたがrevertantは得られず，無菌雌マウスの腸管に定着させることによって偏性嫌気性への revertantを得た.revertantはゴナドトロビンの分泌があり，かっ頚管刺激による黄体相の導入を行なったマウスにおいて分離することができた. 本研究では頚管刺激は行なわず，プロゲステロンの接種により黄体相の導入を行ない偏性嫌気性の revertantを得た.このことはプロゲステロンによる消化管の生理作用の変化がこのreverslOnに大きな役目を果していることを示唆している. 稿を終るにあたり，御指導・御校問いただいた吉岡守正教授に深謝いたします. 文献

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3) Haraguchi， Y. and A. Ghoda: Kitasato Arch Exp Med (投稿中)(1984) 4) Horikoshi， H. and Y. Suzuki: On circulating -1260 sexsteroids during the estrous cycle and early pseudopregnancy in th巴ratwith special refer. ence to its luteal activation. Endocrinol Jpn 21 69-79 (974) 5) McGill， T.E.: Induction of luteal activity in female house mice. Horm Behav 211-222 (1970)

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