松岡 泰祐 学 位 の 種 類

氏 名 まつおか たいすけ

松岡 泰祐

学 位 の 種 類

博士（医学）

報 告 番 号

甲第

号

学位授与の日付

令和

年

月

日

学位授与の要件

学位規則第

条第

項該当（課程博士）

学 位 論 文 題 目

Inhibition of NLRP3 inflammasome by MCC950 improves the metabolic outcome of islet transplantation by suppressing IL-1β and islet cellular death

（門脈内膵島移植における NLRP3 インフラマソーム阻害剤 MCC950 投与による IL-1β と移植膵島の細胞死の抑制が膵島移 植成績を改善する）

論 文 審 査 委 員 （主 査） 福岡大学 教授

白澤 専二

（副 査） 福岡大学 教授

川浪 大治

福岡大学 講師

白須 直人

内 容 の 要 旨

【背景】

膵島移植は摘出した膵臓からインスリン産生細胞である膵 β 細胞を含む膵島を単離抽 出し経門脈的に移植する細胞移植療法であり、1 型糖尿病を主体とするインスリン依存性 糖尿病に対して行われる。1 型糖尿病は自己抗体により膵 β 細胞が破壊されインスリン 分泌が枯渇し生じる疾患で、本邦における患者数は 2017 年度厚生労働省研究班による疫 学調査では約 10-14 万人と推定されている。血糖コントロールにはインスリン投与が必須 であるが、糖尿病専門医の診療下でインスリン治療を行っても管理が難しい症例が存在し、

血糖変動性が強く高血糖のみならず低血糖にも悩まされることがある。特に意識消失を伴 う無自覚性重症低血糖発作は生命にかかわる可能性がある。

一方、膵島移植により移植された膵 β 細胞は生理的なインスリン分泌が可能で、血糖

不安定性の強いインスリン依存性糖尿病の治療として発展してきた。しかしながら、膵

島移植では移植直後に生じる自然免疫反応などにより約 70%の膵島が障害を受け拒絶され

ると言われており、特に炎症性サイトカインが膵島障害の一つの大きな要因であると報

告されている。炎症性サイトカインを惹起する一因子である NLRP3 インフラマソームは

細胞質内に存在するタンパク複合体で IL-1β, IL-18 の活性化、および細胞死を引き起

こすことが知られている。また、MCC950 は、NLRP3 インフラマソームを特異的に阻害す

る低分子化合物で、多種の免疫、炎症による疾患において有効であることが報告され、

近年注目されている。

【目的】

本研究の目的は門脈内膵島移植マウスモデルにおける移植後早期に生じる自然免疫反 応と NLRP3 インフラマソームの関与を明らかにし、NLRP3 インフラマソーム阻害剤であ る MCC950 投与による移植後の血糖降下作用の改善効果を明らかにすることである。

【対象と方法】

マウス膵 β 細胞腫瘍化細胞株である MIN6 にサイトカインカクテル(TNF-α, IFN-γ, IL-1β)の添加培養を行い、NLRP3 インフラマソーム関連遺伝子である IL-1β と NLRP3 遺伝子について qPCR で検討した。

野生型 C57BL/6J マウスから膵臓を摘出後、膵島を単離し、LPS、もしくはサイトカイ ンカクテル(TNF-α, IFN-γ, IL-1β)の添加培養を行い、IL-1β および NLRP3 の遺伝子 発現の変化を qPCR で検討した。さらに、NLRP3 インフラマソーム阻害剤である MCC950 を 添加し、その効果について明らかにした。

次に、単離した膵島 50 個を用いてサイトカインカクテル、またはサイトカインカクテ ル＋MCC950 を添加培養し、膵島組織、および膵島細胞の生存率をそれぞれ検討した。死 細胞は Propidium Iodide、生細胞は Hoechst 33342 で染色し評価した。

続いて移植実験を行った。レシピエントとして 8-10 週齢の雄の野生型 C57BL/6J マウ スにストレプトゾトシンを尾静脈投与し糖尿病マウスを作成した。野生型 C57BL/6J マウ スから膵島を単離し、経門脈的に膵島 170 個を移植したコントロール群と移植前後に MCC950 を腹腔内投与した MCC950 治療群を作成した。移植後 3 時間後、6 時間後、12 時間 後に肝臓を摘出し組織学的所見について検討した。TUNEL 染色、IL-1β、および F4/80 の 免疫染色を行い、移植した膵島の細胞死、IL-1β 発現とマクロファージの遊走について 比較検討を行った。

また、経門脈的に膵島 170 個を移植した後に移植後 28 日間の血糖値、体重、血漿 C-ペ プチド濃度を測定した。

【結果】

MIN6 の培養細胞に対するサイトカイン刺激により IL-1β および NLRP3 の遺伝子発現が 増強していた。また、単離膵島についても LPS、およびサイトカインの刺激により IL- 1β と NLRP3 の遺伝子発現が増強し、MCC950 の投与によりそれらの遺伝子発現の増強が 抑制された。

次に、サイトカイン刺激により膵島組織の生存率はコントロール群と比較して減少し

( p < 0.0001)、MCC950 を添加培養することで改善を認めた( p < 0.0051)。同様に、サイ

トカイン刺激により膵島細胞の生存率はコントロール群と比較して減少し ( p <

0.001)、MCC950 を添加培養することで改善を認めた( p = 0.009)。これらの事から NLRP3 インフラマソームはサイトカイン刺激により膵島の細胞死を誘導し、MCC950 投与がこれ を改善させることが示唆された。

移植膵島のアポトーシスは移植後 3 時間、6 時間、12 時間において時間依存性に増加 していた。MCC950 治療群はコントロール群と比較して 6 時間、12 時間後のアポトーシス を有意に減少させた(6 hours; p = 0.0218, 12 hours; p = 0.0015)。次に、膵島移植後 早期の移植膵島と膵島周囲に IL-1β が同定された。コントロール群では MCC950 治療群 と比較して移植後 3 時間で有意に IL-1β 陽性細胞の増加を認めた(3 hours; p = 0.0043)。また、F4/80 の染色においてコントロール群では移植膵島の周囲にマクロファ ージの遊走を認め、その数は時間依存性に増加していた。MCC950 治療群では 6 時間、12 時間で有意にマクロファージの数が減少していた(6 hours; p = 0.0037, 12 hours; p = 0.0015)。

さらに、MCC950 治療群ではコントロール群と比較して有意に 28 日間の血糖値の改善を 認めた( p = 0.04)。血漿 C-ペプチド濃度には有意差を認めなかったものの MCC950 治療群 での増加が認められた。一方、体重変化については両群間に差を認めなかった。

【結論】

膵島移植後早期に生じる宿主の自然免疫反応に NLRP3 インフラマソームが関与してい ることが示唆された。また、NLRP3 インフラマソームを阻害することで膵島のアポトー シス、IL-1β 産生、マクロファージの移植部位への遊走が抑制されることが明らかとな った。NLRP3 インフラマソームをターゲットとした治療は膵島移植の治療効果を改善さ せると考えられる。

審査の結果の要旨

本論文は門脈内膵島移植において、NLRP3 インフラマソーム阻害剤 MCC950 を投与する ことで IL-1βと移植膵島の細胞死を抑制し、膵島移植成績が改善することをマウスモデ ルを用いて明らかにしたものである。マウス膵島は TNF-α、IFN-γ、IL-1βによるサイト カイン刺激で NLRP3 関連遺伝子である IL-1β、NLRP3 の遺伝子発現を上昇させた。また、

サイトカイン刺激にて膵島の形状変化、細胞死を引き起こしたが MCC950 の添加培養によ りこれらの改善を認めた。

門脈内膵島移植における移植部位である肝臓の組織学的評価では MCC950 を投与するこ

とで、移植後早期の移植膵島の細胞死、IL-1βの発現、マクロファージの遊走を抑えるこ

とが確認された。移植後 28 日間の血糖値のモニタリングにおいては MCC950 の投与により

血糖値の変動に対する改善効果、および血漿 C-ペプチド濃度の増加を認め、NLRP3 インフ

ラマソームを標的とした門脈内膵島移植が移植治療成績の改善に繋がる可能性があると 考えられた。

本論文の斬新さ、重要性、実験方法の正確性、表現の明確さ、結論、主な質疑応答は以 下のとおりである。

1. 斬新さ

門脈内膵島移植と NLRP3 インフラマソームの関与における既報の論文はほとんどなく、

その治療効果も解明されていない。本研究はそれに着目し、膵島移植で NLRP3 インフラマ ソーム活性を抑制することで膵島移植の治療成績を向上させることを初めて示したもの である。

2. 重要性

膵島移植は移植後早期に移植膵島が障害を受け、拒絶されると言われている。ドナー不 足が問題となっている膵島移植において、膵島の障害を改善することは移植成績に直結す る。膵島移植の実臨床において、TNF-α阻害剤は移植後のインスリン離脱期間の延長に寄 与することが報告されているが、IL-1β阻害剤における治療効果の報告は限定的である。

しかし、本研究において MCC950 を投与することで移植部位における IL-1β産生、マクロ ファージの遊走、移植膵島のアポトーシスを減少させた。本研究の重要性は、膵島移植に おいて NLRP3 インフラマソーム抑制が IL-1βの産生を抑制させ、治療成績向上を担う可 能性を示した点である。

3. 実験方法の正確性

本研究はデータ解析に必要最小限の C57BL/6 マウスを実験で用いた。同種同系の膵島移 植を行うことで同種異系の免疫反応の介入を除外している。 In vitro における実験では 適切に条件を設定し、サイトカインの濃度、MCC950 の濃度においては既報の研究を参考に し、根拠に基づいて実験を行った。 In vivo の実験において移植実験を行う前実験として 糖尿病 C57BL/6 マウスに MCC950 を投与することで毒性や単独投与で治療効果がないこと を確認した。既報の論文を参考に MCC950 の濃度、投与時間を設定した。各試薬の使用は 根拠に基づいて設定している。

4. 表現の的確さ

研究の目的、方法と材料、結果、考察ともに十分に検討され明確な英語表記で記載された 論文である。

5. 結論

NLRP3 インフラマソーム阻害剤である MCC950 の投与は膵島移植における膵島細胞死、IL-

1βの産生、マクロファージの遊走を抑え、膵島移植後の血糖値を改善させ、移植成績を 向上させる。

主な質疑応答

Q1: NLRP3 インフラマソームは、IL-1βだけでなく、IL-18 も産生している。本研究では IL-1β に主に着眼しているが、MCC950 投与は IL-1βの抑制のみを介して治療効果を発揮 したと考えて良いか？

A1: MCC950 は IL-1βと IL-18 の産生を抑制する。PCR で IL-1βと IL18 の測定では、IL-1 βの遺伝子発現は見られたが、IL-18 の遺伝子発現はほとんど見られず、NLRP3 インフラ マソームを介したサイトカインは主に IL-1βと考えている。また、同薬剤を選択した根拠 として、膵島移植において影響を与えるサイトカインとして TNF-αがある。しかし、MCC950 は既報の研究で TNF-αには影響を与えないといわれており、今回の研究における移植成 績の改善は主に IL-1βを抑制したためと考えている。

Q2: MCC950 の特異性がどこまで証明されているか？濃度を振り検討しているのか？高濃 度になると非特異的な反応を示さないか？

A2: MCC950 の働きとして NLRP3 と ASC の重合を抑制しインフラマソームのタンパク複合 体の形成を防ぐことで薬理効果を発揮すると言われている。濃度を上げることで別の薬理 作用が起きるかについては報告されていない。また、薬剤による細胞障害性を見る実験と して単離した膵島に濃度を振り、MCC950 を添加培養したが、細胞障害性は認めなかった。

In vivo の前実験において生体内で影響がないかを膵島移植を行わない糖尿病マウスに MCC950 を投与したが、他の糖尿病マウスと比較しても違いは認めなかった。

Q3: 実験で MCC950 がアポトーシスを抑制していると示していたが、アポトーシスに関す るシグナルやタンパクに関する実験は行ったか？

A3: 今回の実験では細胞死がどのメカニズムで起きているかは検討できていない。アポト ーシスを同定する実験として caspase-3 の活性化を見る実験があるが、本実験では行って いない。NLRP3 インフラマソームが引き起こすピロトーシスに着目し、 in vitro で膵島の 障害が caspase-1 活性を介していると仮説を立て実験を行ったが、今回の実験では caspase-1 の活性化を検出することはできなかった。

Q4: in vivo、in vitro においても予防効果をみたものであるが、予防投与を行っていな い膵島移植にておいて、薬剤を投与することで治療効果があるか？

A4: 今回の実験では移植後早期の免疫反応を抑える目的で移植前 30 分、移植後 6 時間、

12 時間、24 時間に薬剤投与を行った。実際の膵島移植でも移植後早期に膵島が障害を受

けていると報告されており、MCC950 を投与するタイミングが重要と考えている。免疫反応

により膵島が障害を受ける早期の段階で薬剤を投与する必要があると考えている。

Q5: ヒトの膵島移植において NLRP3 インフラマソームを抑制する様な薬剤を投与するの であれば、移植後早期に薬剤を投与するのが良いか？

A5: 移植前、移植後早期の薬剤投与が良いのではと思われる。

Q6: そもそも膵島を単離する工程で膵島が障害を受け、IL-1β産生を引き起こしている との事だが、実臨床で膵島の障害を抑えるような工夫はあるか？

A6: 実際の膵島移植ではドナーより摘出した膵島を運搬する時点で膵臓が低酸素による 障害を受けるため、酸素化を行った保存液で運搬を行っている。また、単離した膵島を当 日、投与するのではなく、約 1 日間培養し安定化させた後に膵島移植を行うという方法が とられている。

Q7: figure1、MIN6 におけるサイトカイン刺激実験において IL-1βにおける fold change は何を基準に判定しているのか？0 時間における IL-1βは測定できていないため、基準値 になりえないのではないか？

A7: 本実験においては膵島を各時間で添加培養を行った後に lysate し、RNA から cDNA を 作成し、βアクチンをハウスキーピング遺伝子として用い、リアルタイム PCR を行ってい る。βアクチンを基準として、各時間での遺伝子発現を定量化した。

Q8: サイトカイン添加培養後の膵島細胞に対する Hoechst/PI 染色における細胞数はどの ように測定したか？

A8: コントロール群、サイトカイン刺激群、サイトカイン+薬剤投与群で膵島 30 個を用い て各群は n=9 とした。細胞はキーエンスを用いて自動測定で計測した。

Q9: 膵島内の細胞おいて内部の方が障害を受けやすい可能性はあるか？

A9: 内部の方が低酸素になりやすく、中心部から障害を受けていたと考えられる。

Q10: 膵島に対するサイトカイン刺激により IL-1β、NLRP3 の遺伝子発現が上昇している が、MCC950 を用いることでそれらの発現が減少するメカニズムは？

A10: MCC950 が薬理作用を示す部位より上流で mRNA が合成されているが、NLRP3 インフラ マソームを抑えることで、次なる炎症を抑え、結果として IL-1β や NLRP3 の遺伝子発現 を抑制していると考えられる。

Q11: in vitro で caspase-1 が活性化していないとの結果より、膵島の細胞死はピロトー シスでななく、アポトーシスであったと判断して良いか？

A11: サイトカイン刺激での細胞死は caspase-1 が活性化していないことからアポトーシ

スが主であると考えられる。しかしながら、実験に用いた膵島細胞が少なく、実験におい

て認識できない程度の caspase-1 を分泌していた可能性はある。

Q12: 門脈内膵島移植おいて障害を受けた膵 β 細胞や肝細胞でガスダーミン D の発現は あるか？

A12: ガスダーミン D の活性化を見ることでピロトーシスの経路を確認することができる が、本実験でガスダーミン D の活性化は評価していない。

Q13: LPS の刺激において caspase-4,5,11 はどのように働くか？

A13: caspase-4,5,11 も caspase-1 と同様にガスダーミン D を活性化させピロトーシスを 引き起こすが、NLRP3 インフラマソームを介さずにピロトーシスを引き起こす。

Q14: LPS で刺激すると非古典的な NLRP3 インフラマソームが活性化される可能性がある。

すなわち caspase-1 は活性化していないが、capsase-11 が活性化していた可能性はない か？

A14: 検討ができておらず、今後の検討課題だと思います。

Q15: 今回の実験で caspase-1 の活性は起きていないため、pro-IL-1βから IL-1βはでき ていない。しかし、MCC950 を投与し、インフラマソームと caspase-1 の活性を抑えるこ とで移植成績が改善する事についてどのように考察するか？

A15: in vitro の実験で caspase-1 の活性を見た実験の対象は膵島になる。既報の論文で は膵島とマクロファージの IL-1β産生の量を比較するとマクロファージが多く産生する ことが報告されている。移植部位における IL-1β免疫染色で肝実質内に発現していた IL- 1βはマクロファージが産生していたのではないかと思われる。マクロファージにおける IL-1β産生は主に NLRP3 インフラマソームを介していたのではないかと考察している。ま た、マクロファージが浸潤していない膵島内で IL-1βが発現し、MCC950 を投与すること で膵島内の IL-1βが減少していたことから、これに関しては NLRP3 インフラマソームを 介していたのではないかと考える。一方で in vitro において caspase-1 の活性化が確認 できない理由として膵島で合成される caspase-1 のタンパク量が少なく、実験に用いた膵 島が少なかったからではないかと考えている。

Q16: なぜ肝細胞がアポトーシスを起こすか？

A16: 門脈内膵島移植のモデルであり、移植した膵島は細くなった門脈に塞栓することで 肝内に生着する。生着部より遠位の肝組織は門脈血流がなくなるためアポトーシスを引き 起こされたと考えている。更にサイトカインによる細胞障害が加わったと考察している。

Q17: 門脈内膵島移植そのものが、移植部位の微小環境に対して悪影響を及ぼしており、

膵島の生着率を下げている可能性はないか？また、改善策はないか？

A17: これに関しては移植部位変更に関しての研究が行われている。実臨床では肝臓に移 植しているが、マウスの実験モデルは腎被膜下、精巣内、腹腔内などに移植することで門 脈虚血を回避できると言われている。

Q18: MCC950 投与群とコントロール群で体重に差がないことは理屈に合わないのか？

A18: 他の移植実験においては一般的に糖尿病が改善すると同様に体重も増加していくが、

本実験においては両群ともに体重に大きな違いはなかった点で予想と異なる結果であっ た。

Q19: MCC950 は臨床に応用可能な薬剤であるか？

A19: 現段階では実験用の薬剤である。NLRP3 インフラマソームの活性が原因となってい るクリオピリン関連周期熱症候群疾患モデルでは治療効果が認められており、薬理作用が 究明されれば、実臨床にも応用可能と考えている。

以上の質疑を中心に活発な討論が行われ、申請者は適切に回答した。

以上の審査の結果、本論文は内容の斬新さ、重要性、研究方法の正確性、表現の明確さ、

およびに質疑応答の対応を踏まえ、主査および副査による審査の結果、学位論文に値する

と評価された。